CN108669093A - 一种用于抑制水葫芦生长的植物微生物联合剂 - Google Patents

一种用于抑制水葫芦生长的植物微生物联合剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种植物微生物联合剂，由微生物菌剂4‑5份、植物提取物3‑5份、草木灰7‑8份、烷基苯磺酸盐0.5‑1份、丙二醇0.2‑0.3份组成，所述微生物菌剂由不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成，本发明植物微生物联合剂能够显著降低富营养水体COD值，并抑制水葫芦大量生长，具有推广价值，应用前景广阔。

Description

一种用于抑制水葫芦生长的植物微生物联合剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于抑制水葫芦生长的植物微生物联合剂。
背景技术
水葫芦(Eichhornia crassipes Solms)为雨久花科凤眼莲属多年生水生草本植物，又名凤眼莲、假水仙、洋水仙等，原产南美，20世纪30年代传入我国， 60～70年代作为畜禽饲料推广。水葫芦在气温13℃开始繁殖，气温39℃时仍能繁殖，它兼有无性和有性繁殖功能，尤以无性繁殖为主，种群恢复和扩散能力极强。水葫芦喜生于温暖、向阳和富含有机质的静水中，在适宜的条件下每5 d就能繁殖1棵新植株，每天能增加20％～30％ 的生物量，是世界上生长、繁殖最快的水生植物之一。
由于水葫芦强大的繁殖能力，且作为外来入侵种在我国缺乏天敌制约，导致其在我国南方水域快速蔓延，同时我国水体富营养化程度的加剧，也起了推波助澜的作用。近年来，已在我国南方多省蔓延成灾，带来极大的生态和社会危害，水葫芦甚至被称为“水上绿魔”。 水葫芦的快速繁殖，会覆盖水面，造成激烈的种内竞争，导致腐烂死亡，污染水体，加剧水体富营养化程度。密集的水葫芦降低了光线对水体的穿透能力，增加水中二氧化碳的浓度，降低水中溶氧量，妨碍其他水生生物的生长而造成生态链失去平衡，对生态系统造成不可逆转的破坏。水葫芦导致生物多样性丧失、生态灾害频发，大量的水葫芦漂集于河道湖面，堵塞河道，影响 航运，阻碍排灌，在汛期阻碍水流，并降低水产品产量、质量，严重影响运输业、旅游业和水产养殖业的发展。滇池、太湖、黄浦江等南方著名水体，水葫芦泛滥成灾，近年来的暖冬天气甚至造成水葫芦反季节生长。
目前在水葫芦的治理中，国内多使用人工打捞和化学制剂的方法。利用人工打捞的方法治理水葫芦消耗了大量社会财富，造成了巨大的经济损失，有关方面耗费巨资却无法根治。化学防治方法简便，效果迅速，但除草剂无法清除水葫芦种子，效果不能持久，且对水体生态系统的破坏性大，污染环境。加之水葫芦彻底腐烂速度慢，枯黄后浮在水面仍需一段时间，影响生态景观，且腐烂后增加泥沙淤积。因此该方法仍要与河塘清淤等措施相配套，才较为理想，常见的化学除草剂主要有草甘膦(Glyphosate)、草甘膦稀释100倍用喷雾器对叶面喷雾，水葫芦一般在施药后30 d又长出新叶鞘和新叶，故可在施药30 d后视新叶抽生情况采取点喷法再补喷一次。还有农达、克无踪等。然而，化学除草剂使用后容易产生新一轮的环境污染，且后果越来越严重。
不少国家对水葫芦的病原菌也进行了大量的调查研究工作，并且已经取得一定的进展：全世界已经报道了70多种侵染水葫芦的病原真菌，在南非等国家已经筛选到的诺曼尼尾孢(Cercospora rodmanii)和水葫芦链格孢(Alternaria eichhorniae)对水葫芦具有较强的抑制作用。寻求对水葫芦有强致病性和生防控制作用的病原微生物，由此进一步研制无残留、不污染环境的生物抑制剂，将不仅具有重要的商业开发应用价值，而且能安全有效地控制水葫芦的危害，以避免由此造成的巨大经济损失。
利用植物化感作用(allelopathy)来控制一些杂草的生长，已有很多报道。开发植物源农药主要是利用植物体的次生代谢物质，这些物质是植物自身防御体系与有害生物的相互适应演变、协同进化的结果，具有除草剂活性物质通常包括：酚酸类(phenolicacids)，生物碱(alkaloids)，三萜(烯)(triterpenes)等。与有机合成农药相比，植物源除草剂具有选择性高、低毒、易降解等优点。现有技术也存在利用植物内源提取物治理水葫芦的有关报道，例如印度的Saxena报道用马缨丹叶的提取液培养水葫芦，能够有效地杀死水葫芦。
关于植物-微生物联合修复的研究在土壤修复中的报道较多，主要侧重于植物与专性降解菌的联合修复、植物与菌根真菌的联合修复两个方面的研究。而针对水体的研究相对较少，丁学峰等究结果发现，黄花水龙与EM菌联合净化富营养水体的效果优于EM菌单独处理的效果。袁冬海等研究了微生物-水生生物强化系统模拟处理富营养化水体，结果表明高效固定化微生物扩散的高效微生物在植物根区附着，可强化根际微生物的活性，进一步加强自然水体的脱氮除磷能力。
本发明申请人前期已经制备了用于抑制水葫芦的微生物菌剂，其对水葫芦取得显著的抑制效果，然而，微生物菌剂的培养耗费的成本较大，在已经存在植物提取物对水葫芦抑制报道的前提下，申请人通过改进成分的配方，添加植物提取物与微生物菌剂复配，一定程度上降低微生物菌剂的用量，降低成本，并达到了相似或更高的效果。研究寻找一种安全、稳定和高效的水葫芦的生物防治制剂，为建立健康、有效的水葫芦管理体系，提供新的途径，是一个很有价值的研究工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种抑制水葫芦生长的植物微生物联合剂。
为实现本发明目的，本申请采用如下技术方案：
一种植物微生物联合剂，其包括微生物菌剂和植物提取物以及助剂。
具体地，所述植物微生物联合剂由微生物菌剂4-5份、植物提取物3-5份、草木灰7-8份、烷基苯磺酸盐0.5-1份、丙二醇0.2-0.3份组成。所述比例为重量比例。
所述微生物菌剂由异养硝化菌-不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。
所述微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3-4:1-2:2-3的体积比混合，即得；
所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；
所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；
所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633
所述植物提取物的制备方法为：取大蓟2份、车前草3份（重量份）干燥后粉碎并混匀获得植物粉末备用，添加植物粉末5倍重量的95%乙醇（体积分数），浸提24h后，过滤获得提取液，将提取液减压浓缩，至不再有溶剂流出，获得浓缩提取物；取0.5g浓缩提取物，添加0.5ml三乙醇胺，再加蒸馏水定容至100ml，然后超声波振动10min，使其充分溶解，获得植物提取物。
本发明联合剂主要由微生物和植物提取物组成，不含有草甘膦、农达、克无踪等有害化学除草制剂，避免了化学制剂残留量累积保护了水体及环境，具有适应性强、稳定性好等特点。并合理利用微生物间的协同作用，不仅对浮游水草水葫芦的作用效果好，且无毒无害，生态环保，显著降低了用药量、施药次数以及用药成本，且该生物制剂配制方便，保存时间长，具有很强的实用价值。
本发明申请人团队前期已经制备了用于抑制水葫芦的微生物菌剂，其对水葫芦取得显著的抑制效果，然而，微生物菌剂的培养耗费的成本较大，在已经存在植物提取物对水葫芦抑制报道的前提下，申请人通过改进成分的配方，添加植物提取物与微生物菌剂复配，一定程度上降低微生物菌剂的用量，降低成本，并达到了相似或更高的效果，有助于节约和环境保护。
具体实施方式
实施例1
一种植物微生物联合剂，其包括微生物菌剂和植物提取物以及助剂。
具体地，所述植物微生物联合剂由微生物菌剂4份、植物提取物5份、草木灰7份、烷基苯磺酸盐0.5份、丙二醇0.2份组成。所述比例为重量比例。
所述微生物菌剂由异养硝化菌-不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。
所述微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3:1:2的体积比混合，即得；
所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；
所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；
所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633
所述植物提取物的制备方法为：取大蓟2份、车前草3份，干燥后粉碎并混匀获得植物粉末备用，添加植物粉末5倍重量的95%乙醇（体积分数），浸提24h后，过滤获得提取液，将提取液减压浓缩，至不再有溶剂流出，获得浓缩提取物；取0.5g浓缩提取物，添加0.5ml三乙醇胺，再加蒸馏水定容至100ml，然后超声波振动10min，使其充分溶解，获得植物提取物。
本发明植物微生物联合剂施用量为0.2-0.3%的重量比例施加。
实施例2 一种植物微生物联合剂，其包括微生物菌剂和植物提取物以及助剂。
具体地，所述植物微生物联合剂由微生物菌剂5份、植物提取物5份、草木灰8份、烷基苯磺酸盐1份、丙二醇0.3份组成。所述比例为重量比例。
所述微生物菌剂由异养硝化菌-不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。
所述微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照4:2:3的体积比混合，即得；
所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；
所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；
所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633
所述植物提取物的制备方法为：取大蓟2份、车前草3份干燥后粉碎并混匀获得植物粉末备用，添加植物粉末5倍重量的95%乙醇（体积分数），浸提24h后，过滤获得提取液，将提取液减压浓缩，至不再有溶剂流出，获得浓缩提取物；取0.5g浓缩提取物，添加0.5ml三乙醇胺，再加蒸馏水定容至100ml，然后超声波振动10min，使其充分溶解，获得植物提取物。
本发明植物微生物联合剂施用量为0.2-0.3%的重量比例施加。
实施例3 本发明制剂对水葫芦致病性试验：
（1）制剂制备：
实验组：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3:1:2的体积比混合；所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633；
实验2组：将微生物菌剂和植物提取物按照1:1重量比例配比，所述微生物菌剂为：不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3:1:2的体积比混合；所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；所述枯草芽孢杆菌为（Bacillussubtilis）ATCC NO.6633；所述植物提取物的制备方法参见实施例1；
对照实验组1组：将不动杆菌、假丝酵母菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3:1的体积比混合；所述不动杆菌为ATCC NO.17978；所述假丝酵母菌为ATCC NO.22023；
对照实验2组：将假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照1:2的体积比混合；所述假丝酵母菌为ATCC NO.22023；所述枯草芽孢杆菌为ATCC NO.6633；
（2）水葫芦自然生态培养模拟实验。
将生长正常的水葫芦幼株移栽于添加0.2％体积的步骤（1）制备的制剂的营养液中。同时以不添加菌液作为空白对照组，均设立三组平行对照。露天培养，观察和记录水葫芦生长情况。培养20天后，含本申请复合微生物菌剂的水葫芦均出现不同程度的枯萎，叶片出现病态，而对照组生长正常。
（3）水葫芦病情分级标准]如下：
0级叶片上无任何病斑；
1级叶片上少数病斑，总面积小于三分之一；
2级叶片上病斑总面积大于三分之一，小于三分之二；
3级叶片上病斑面积大于三分之二；
4级叶片全部枯萎。
（4）水葫芦叶片的发病率和病情指数分别按以下公式计算：
发病率(100％)＝染病叶片数/总叶片数×100
叶片病情指数＝〔Σ(发病级别×该级的叶片数)/(总叶片数×4)〕×100％
重复上述实验三批次取平均值。结果表1所示：
表1 本发明制剂针对水葫芦自然生态培养模拟实验
组别 病情指数 发病率
实验组 86.7% 84.2%
实验2组 87.3% 88.1%
对照实验1组 33.5% 41.4%
对照实验2组 52.1% 43.9%
空白对照组 12.3% 9.4%
实验结果表明，模拟自然生态培养的水葫芦，加入本申请微生物菌剂能够显著增加水葫芦的病情指数和发病率。且实验组效果也显著优于对照1-2组，本申请复合菌剂之间实现了协同作用，同时采用本发明植物微生物联合制剂也取得显著的效果。
实施例4 本发明制剂对水葫芦逆境反应酶试验
植物处于逆境条件下会引起一系列生理生化变化，使植物产生应激反应。病原菌侵染后， 植物体内迅速发生氧迸发，产生大量活性氧，高浓度的活性氧对植物自身细胞有害，因此 植物体内存在清除活性氧的保护酶系，包括过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。
超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内清除超氧阴离子自由基的关键酶之一，它能将O- 2歧化为H2O2.。植物SOD酶的活性常与其抗氧化胁迫的能力正相关。过氧化氢酶(CAT)能够清除植物体内过多的过氧化氢，从而减少其对细胞的过氧化伤害，是植物中极为重要的逆境生理酶。 过氧化物酶(POD)是植物体内担负清除H2O2的主要酶类，它可把H2O2转化为H2O。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，具有很强的毒性，它会严重损伤生 物膜的结构与功能，其积累是自由基毒害作用的表现，其含量高低也就成了反应膜脂过氧化强弱的重要指标。因此丙二醛含量可反映植物遭受逆境伤害的程度，实验组水葫芦叶片中的丙二醛含量显著高于对照，说明本发明菌液对叶片的细胞膜产生了较强的毒害作用。从而导致水葫芦叶片失绿与细胞死亡，抑制了水葫芦植株的生长。
按照实施例3所示方法测定实验2组水葫芦叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）的活性，与对照组相比较。
结果如下，实验2组SOD值较空白对照组提高4.1倍，POD值较空白对照提高了2.5倍，CAT值提高了4.3倍。即实验2组水葫芦叶片的SOD、POD、CAT酶的活性均显著提高。
实施例5 水体生物安全性试验
取生长正常的水莲、栽培于培养基中，按照培养基体积的0.2%的量添加实施例2制备的制剂，以不添加菌液的空白对照组为对照。观察和记录植株生长情况，30天内植株均生长正常，未见明显异常。
实施例6 本发明联合剂水体净化试验
取模拟池塘富营养化水体（含水葫芦）进行试验，以 0.2%的重量比例施加实施例1制备的联合剂。设置空白对照组，设平行组，28℃培养。采用间歇曝气方式培养。72h后取样测定水体中氨氮和COD的含量，以及水葫芦的坏死叶片百分比。结果如表2所示：
表2植物微生物联合剂水体净化试验
组别 COD降解率 氨氮降解率 水葫芦叶片坏死率
实验组 65.3% 60.4% 33.8%
空白对照组 3.2% 4.1% 0
结论，本发明制剂能够显著降低富营养化水体的COD和氨氮，起到净化水体的效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种植物微生物联合剂，其包括微生物菌剂、植物提取物以及助剂。
2.根据权利要求1所述的植物微生物联合剂，其特征在于，所述植物微生物联合剂包括下述重量份的组分：微生物菌剂4-5份、植物提取物3-5份、草木灰7-8份、烷基苯磺酸盐0.5-1份、丙二醇0.2-0.3份。
3.根据权利要求1-2所述的植物微生物联合剂，其特征在于，所述微生物菌剂由不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌组成。
4.根据权利要求3所述的植物微生物联合剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法为：将不动杆菌、假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌分别按照常规培养方式培养至浓度为1×107个/ml的菌液，然后按照3-4:1-2:2-3的体积比混合，即得。
5.根据权利要求1-4所述的植物微生物联合剂，其特征在于：
所述不动杆菌（Acinetobacter SP.）为ATCC NO.17978；
所述假丝酵母菌为（Candida utilis）ATCC NO.22023；
所述枯草芽孢杆菌为（Bacillus subtilis）ATCC NO.6633。
6.根据权利要求1-5所述的植物微生物联合剂，其特征在于：所述植物提取物的制备方法为：按照重量份取大蓟2份、车前草3份，干燥后粉碎，混合获得植物粉末，添加植物粉末5倍重量的95%乙醇，浸提24h后，过滤获得提取液，将提取液减压浓缩，获得浓缩提取物；取0.5g浓缩提取物，添加0.5ml三乙醇胺，再加蒸馏水定容至100ml，超声波振动，使其充分溶解，获得植物提取物。
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