CN108660099B - 一株诱导大豆产生大豆抗毒素的解淀粉芽孢杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株诱导大豆产生大豆抗毒素的解淀粉芽孢杆菌及其用途。该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15480。实验证明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34 CGMCCNo.15480可以诱导大豆产生大豆抗毒素，相应大豆粉中的大豆抗毒素含量达到5.78mg/g鲜豆重。本发明具有重要的应用价值。

Description

一株诱导大豆产生大豆抗毒素的解淀粉芽孢杆菌及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株诱导大豆产生大豆抗毒素的解淀粉芽孢杆菌及其用途。
背景技术
大豆(Glycine max)是豆科大豆属一年生草本植物，在豆类中营养价值最高。除了大豆本身所固有的异黄酮类化合物具有多种生物学作用外，在压力条件下大豆会产生一种次生代谢产物大豆抗毒素(glyceollins)。大豆抗毒素有大豆抗毒素Ⅰ、大豆抗毒素Ⅱ和大豆抗毒素Ⅲ三种异构体(结构式见图1)，其可以完全抑制雌激素诱导的MCF-7细胞中黄体酮受体的表达，并部分抑制其在BG-1细胞的表达，从而可高效阻断妇科肿瘤的生长和扩散。由此可知，大豆抗毒素是大豆中的又一健康元素。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亲缘性很高的非致病细菌，广泛存在于自然界。目前国内外对其研究仅局限于发酵条件优化、降解除草剂丁草胺、抑制植物病原微生物、控制藻类繁殖和动物肠道益生菌等应用领域。
发明内容
本发明的目的是如何诱导大豆产生大豆抗毒素。
本发明首先保护解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AT34，该菌株已于2018年03月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15480。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34CGMCC No.15480简称为解淀粉芽孢杆菌AT34。
本发明还保护一种菌剂，其含有解淀粉芽孢杆菌AT34。
所述菌剂的用途可为a1)或a2)或a3)：a1)生产大豆抗毒素；a2)生产富含大豆抗毒素的大豆粉；a3)诱导大豆产生大豆抗毒素。
所述菌剂的制备方法，可包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌AT34接种至细菌培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。
所述细菌培养基可为LB液体培养基或PDB培养基。所述LB液体培养基的制备方法具体可如下：将10g蛋白胨、10g氯化钠和5g酵母粉溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L；121℃灭菌15min。所述PDB培养基的制备方法具体可如下：将5g马铃薯浸粉、15g葡萄糖、10g蛋白胨和5g氯化钠溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L；121℃灭菌15min。
所述菌剂的制备方法中，所述培养的具体条件可为：35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)、100-300rpm(如100-200rpm、200-300rpm、100rpm、200rpm或300rpm)振荡培养10-20h(如10-15h、15-20h、10h、15h或20h)。
除了活性成分，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
所述解淀粉芽孢杆菌AT34或上述任一所述菌剂在a1)或a2)或a3)中的应用也属于本发明的保护范围：a1)生产大豆抗毒素；a2)生产富含大豆抗毒素的大豆粉；a3)诱导大豆产生大豆抗毒素。
本发明还保护一种生产大豆抗毒素得方法，可包括如下步骤：
(1)向有切口的大豆子叶中加入所述解淀粉芽孢杆菌AT34，培养；
(2)完成步骤(1)后，从所述大豆子叶中提取大豆抗毒素。
本发明还保护一种生产富含大豆抗毒素的大豆粉的方法，可包括如下步骤：
(1)向有切口的大豆子叶中加入所述解淀粉芽孢杆菌AT34，培养；
(2)完成步骤(1)后，将所述大豆子叶研磨成大豆粉；所述大豆粉即为富含大豆抗毒素的大豆粉。
本发明还保护一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法，可包括如下步骤：
(1)向有切口的大豆子叶中加入所述解淀粉芽孢杆菌AT34，培养；
完成步骤(1)后的大豆子叶即产生大豆抗毒素。
上述任一所述的方法中，所述步骤(1)中，“向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌AT34”是通过向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌AT34的菌悬液实现的。所述菌悬液中解淀粉芽孢杆菌AT34的浓度可为7×1010cfu/mL-2×1011cfu/mL(如7×1010cfu/mL-9.6×1010cfu/mL、9.6×1010cfu/mL-2×1011cfu/mL、7×1010cfu/mL、9.6×1010cfu/mL或2×1011cfu/mL)。
上述任一所述的方法中，所述“向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌AT34”的方式可为b1)或b2)：
b1)将所述有切口的大豆子叶完全浸泡在所述菌悬液中；
b2)向所述切口内滴入所述菌悬液。
所述b1)中，浸泡时间可为1-10min(如1-2min、2-5min、5-10min、1min、2min、5min或10min。
上述任一所述的方法中，所述步骤(1)中，培养可为23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)暗培养3-5d(如3-4d、3-5d、3d、4d或5d)。
上述任一所述的方法中，所述步骤(1)中，培养的湿度可为40-60％(如40-50％、50-60％、40％、50％或60％)。
解淀粉芽孢杆菌是人畜安全的肠道益生菌。实验证明，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34CGMCCNo.15480可以诱导大豆产生大豆抗毒素，相应大豆粉中的大豆抗毒素含量达到5.78mg/g鲜豆重。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为大豆抗毒素三种异构体的结构式。
图2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的生长曲线。
图3为大豆抗毒素提取液的HPLC检测结果。
图4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34菌悬液中确认诱导子。
图5为HPLC检测结果。
图6为MS检测结果。
保藏说明
菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：(Bacillus amyloliquefaciens)
菌株编号：AT34
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年03月26日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15480
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
LB液体培养基：将10g蛋白胨、10g氯化钠和5g酵母粉溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L；121℃灭菌15min。
LB固体培养基：将10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母粉和7g琼脂溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L；121℃灭菌15min。
LB固体平板：将约55℃的LB固体培养基倒入无菌培养皿，冷却后即得到LB固体平板。
PDB培养基：将5g马铃薯浸粉、15g葡萄糖、10g蛋白胨和5g氯化钠溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L；121℃灭菌15min。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34CGMCCNo.15480的分离、鉴定和保藏
一、芽孢杆菌AT34的分离
1、在100mL无菌PBS缓冲液(pH6.8)中加入10g粪便样品(由中国河北省保定市唐县10只7-10日龄健康仔猪的新鲜粪便混合而成)，充分混匀，然后用两层无菌纱布过滤，收集滤液。
2、完成步骤1后，取1mL滤液，80℃水浴15min(目的为杀死非芽孢菌)，得到处理液。
3、完成步骤2后，取处理液，加入盛有9mL无菌PBS缓冲液(pH6.8)中的无菌试管中充分混匀(此时稀释度记为10-1)，然后从此试管中吸取1mL加入到另一盛有9mL无菌PBS缓冲液(pH6.8)的无菌试管中混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的菌悬液。将各稀释度取0.1mL均匀涂布在LB固体平板上，37℃恒温静置培养24h。
4、完成步骤3后，显微镜下观察，挑取具有芽孢的单菌落，反复纯化3-5次。将筛选到的一株芽孢杆菌命名为芽孢杆菌AT34。
二、芽孢杆菌AT34的鉴定
1、参考“《伯杰氏系统细菌学手册》(布瑞德.伯杰氏系统细菌学手册(第八版).中译本.科学出版社，1984)”、“Rahman K S，Rahman T J，Mcclean S，etal.Rhamnolipidbiosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosausing low-cost raw materials[J].Biotechnology Progress，2002，18(6):1277-1281.”、“张春云，王印庚，荣小军.养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定[J].水产学报，2006，30(1)：118-123.”、“沈锡辉，刘志培，王保军，等.苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究[J].环境科学学报，2004，24(3)：482-486.”和“Rezzonico F，Smits T H，Montesinos E，etal.Genotypic comparison of Pantoeaagglomerans plant and clinical strains[J].Bmc Microbiology，2009，9(1):204.”，鉴定芽孢杆菌AT34的形态学特征，并测定芽孢杆菌AT34的生理生化特征。
芽孢杆菌AT34的形态学特征和生理生化特征的结果见表1。
表1.细胞形态和理化实验结果
Figure BDA0001720488530000041
2、16S rRNA序列分析
芽孢杆菌AT34的16S rRNA序列如序列表中序列1所示。
3、gyrB基因的核苷酸序列分析
芽孢杆菌AT34的gyrB基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
鉴于上述形态学特征、生理生化特征分析、16S rRNA序列分析和gyrB基因的核苷酸序列分析，将步骤一分离纯化得到的芽孢杆菌AT34鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。该芽孢杆菌AT34已于2018年03月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15480。芽孢杆菌AT34的全称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AT34CGMCCNo.15480，简称解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AT34。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的生长曲线
1、取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的单克隆，接种于5mLLB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到种子液。
2、取1mL种子液，接种于100mLPDB培养基(接种比为1:100)，37℃、200rpm振荡培养40h。培养期间，每隔4h测定菌液的OD600nm值。
以培养时间为横坐标，菌液的OD600nm值为纵坐标，绘制解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)AT34的生长曲线。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的生长曲线见图2。结果表明，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34在PDB培养基中生长的很快，接种4h进入对数生长期，接种22h到达稳定期。
实施例3、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34诱导大豆产生大豆抗毒素
本实施例中的大豆为普通的非转基因大豆，购自中国黑龙江省哈尔滨市巴彦县万发镇。
培养皿直径为90mm。
暗培养的条件为：温度25℃，湿度50％。
HPLC检测条件为：Waters2695色谱系统，配Waters 2996紫外检测器，柱子为C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：40℃，采用二元流动相：A液为浓度为0.058mol/L的乙酸水溶液(pH3.0)，B液为100％乙腈。流速：1mL/min，梯度洗脱：0-17min，0％乙腈→45％乙腈；17-27min，45％乙腈→90％乙腈；27-33min，90％乙腈，维持时间33min；检测波长：285nm，进样量10μL。
一、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34诱导大豆产生大豆抗毒素
1、取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的单克隆，接种于5mLLB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到种子液。
2、完成步骤1后，取5mL种子液，接种于500mLPDB培养基(接种比为1:100)，37℃、200rpm振荡培养18h，得到培养菌液。
3、完成步骤2后，取培养菌液，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体。
4、完成步骤3后，取菌体，加入10mL去离子水重悬，得到菌悬液。该菌悬液中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的浓度约为9.6×1010cfu/mL。
5、取大豆种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液灭菌消毒3min，再用无菌水淋洗2次，每次2min，然后在无菌水中浸泡5h。将浸泡膨胀的大豆脱去种皮，两片子叶分开，在每片子叶上划1个切口，切口大小约为2mm×4mm。
6、完成步骤5后，在每个大豆子叶切口内滴加60μL步骤4得到的菌悬液或PDB培养基(作为对照)，再置于装有无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿(每个培养皿中放入10±1枚大豆子叶)中，然后将培养皿暗培养4d。
二、大豆抗毒素的提取和HPLC检测
1、取完成步骤一的大豆子叶，充分研磨，得到大豆粉。
2、完成步骤1后，取1.0g大豆粉，加入3.0mL 80％(v/v)乙醇水溶液，50℃搅拌1h(目的为提取大豆抗毒素)，冷却至室温，12000r/min离心15min，收集上清液。
3、完成步骤2后，取上清液，用80％(v/v)乙醇水溶液定容至10mL，然后经0.22μm微孔膜过滤，收集滤液。该滤液即为大豆抗毒素提取液。
4、取步骤3收集的滤液，进行HPLC检测。
采用步骤一中4得到的菌悬液处理，获得的大豆抗毒素提取液的色谱图见图3中A(1为大豆抗毒素Ⅰ，2为大豆抗毒素Ⅱ，3为大豆抗毒素Ⅲ)，出峰保留时间为23-24min。经HPLC检测，相应大豆粉中的大豆抗毒素含量为5.78mg/g鲜豆重。
采用PDB培养基处理，获得的大豆抗毒素提取液的色谱图见图3中B。结果表明，对照中仅检测到0.14mg/g大豆抗毒素的生成。
为了进一步确认步骤一中4得到的菌悬液中哪一部分是有效的诱导子，进行如下实验：
(1)取步骤一中4得到的菌悬液，4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。
(2)取大豆种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液灭菌消毒3min，再用无菌水淋洗2次，每次2min，然后在无菌水中浸泡5h。将浸泡膨胀的大豆脱去种皮，两片子叶分开，在每片子叶上划约2mm×4mm的切口。
(3)完成步骤(2)后，在大豆子叶切口内滴加60μL待测溶液(无菌水、PDB培养基、步骤(1)收集的上清液或步骤一中4得到的菌悬液)，再置于装有无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿(每个培养皿中放入10±1枚大豆子叶)中，然后将培养皿暗培养4d。
(4)取完成步骤(3)的大豆子叶，充分研磨，得到大豆粉。
(5)完成步骤(4)后，取1.0g大豆粉，加入3.0mL 80％(v/v)乙醇水溶液，50℃搅拌1h(目的为提取大豆抗毒素)，冷却至室温，12000r/min离心15min，收集上清液。
(6)取步骤(5)收集的上清液，用80％(v/v)乙醇水溶液定容至10mL，然后经0.22μm微孔膜过滤，收集滤液。该滤液即为大豆抗毒素提取液。
(7)取步骤(6)收集的滤液，进行HPLC检测，然后计算相应大豆粉中的大豆抗毒素含量。
实验结果见图4(1为无菌水，2为PDB培养基，3为步骤(1)收集的上清液，4为步骤一中4得到的菌悬液)。结果表明，采用无菌水处理，相应大豆粉中的大豆抗毒素含量几乎为0mg/g鲜豆重；而采用PDB培养基、步骤(1)收集的上清液和步骤一中4得到的菌悬液分别处理，相应大豆粉中的大豆抗毒素含量分别为0.14mg/g鲜豆重、2.06mg/g鲜豆重和5.78mg/g鲜豆重。结果表明，步骤一中4得到的菌悬液及其上清液均含有有效的诱导子，且步骤一中4得到的菌悬液比其上清液中的诱导子含量更高。
三、大豆抗毒素的纯化与鉴定
1、取步骤二中3得到的大豆抗毒素提取液，采用制备型高效液相色谱(pre-HPLC)进行分离纯化，得到纯化的大豆抗毒素溶液。
pre-HPLC条件：C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，Acquity
Figure BDA0001720488530000071
BEH)；二元流动相：A液为去离子水，B液为100％乙腈；梯度洗脱：0～10min，5％乙腈；10～100min，5％乙腈→45％乙腈；100～150min，45％乙腈→90％乙腈；150～180min，90％乙腈；流速：3mL/min；柱温：25℃；检测器：电喷雾；进样量：2mL。
2、完成步骤1后，将步骤二中3得到的大豆抗毒素提取液和纯化的大豆抗毒素溶液分别进行HPLC检测。
检测结果见图5(A为步骤二中3得到的大豆抗毒素提取液，B为纯化的大豆抗毒素溶液)。
2、完成步骤1后，取纯化的大豆抗毒素溶液，进行ESI-MS检测。
ESI-MS检测条件：离子源为电喷雾，正离子模式扫描；毛细管电压3.50kV，锥孔电压60V。离子源和脱溶剂气温度分别为120℃和350℃；脱溶剂气流量和锥孔反吹气流量分别为800L/h和50L/h；质量分析器高低端分辨率均为0.75；碰撞室气体为氩气；数据采集和处理软件采用Mass LYNX(Waters，MA，USA，Version 1.4.0)。
检测结果见图6。图6中有3个加H+的分子质量离子峰339、321和229。大豆抗毒素的理论分子量为338，质荷比339表示质子化的大豆抗毒素分子量(M+H+)，321为339失去1个水分子后的分子量(M+H+-H2O)，229为321再失去苯氧基团后的分子量(M+H+-H2O-C6H4O)。ESI-MS检测结果表明，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的菌悬液可以诱导大豆产生大豆抗毒素。
实施例4、大批量生产富含大豆抗毒素的大豆粉
1、取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的单克隆，接种于5mLLB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养12h，得到种子液1。
2、完成步骤1后，取种子液1，接种于500mLPDB培养基(接种比为1:100)，37℃、200rpm振荡培养18h，得到种子液2。
3、完成步骤2后，取种子液2，接种于PDB培养基(接种比为1:100)，37℃、200rpm振荡培养18h，得到培养菌液。
4、完成步骤3后，取培养菌液，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体。
5、完成步骤4后，取菌体，加入去离子水重悬，得到菌悬液。该菌悬液中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AT34的浓度为9.6×1010cfu/mL。
6、取大豆种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液灭菌消毒3min，再用无菌水淋洗2次，每次2min，然后在无菌水中浸泡5h。将浸泡膨胀的大豆脱去种皮，两片子叶分开并切成段(如3段)，得到大豆子叶段。
7、完成步骤6后，取大豆子叶段，加入步骤5得到的菌悬液浸泡2min，然后取出沥干。
8、完成步骤7后，取大豆子叶段，置于无菌设备暗培养4d。
9、完成步骤8后，取大豆子叶段，冻干，然后研磨成大豆粉。
步骤9制备的大豆粉富含大豆抗毒素，可作为食品原料或饲料原料。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一株诱导大豆产生大豆抗毒素的解淀粉芽孢杆菌及其用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat 60
tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca 120
gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc 180
cctttgttct gcccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg 240
acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa 300
tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac 360
acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct 420
ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac 480
cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc 540
gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct 600
aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc 660
ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt 720
cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact 780
caagttcccc agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt 840
aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt 900
attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg 960
ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc 1020
ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc attgcggaag attccctact 1080
gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccgat caccctctca 1140
ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc 1200
gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca ccttttatgt ttgaaccatg cggttcaaac 1260
aagcatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca gtcttacagg caggttaccc 1320
acgtgttact cacccgtccg ccgctaacat cagggagcaa 1360
<210> 2
<211> 805
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
agtccgccag tttacccggc aaattggaaa tctcaagtgc gcttttacgc cgggtcaatt 60
cccgcgcttt tttcgccgcc atccgcgctc ttgcggccat taagcccttt caacgatttt 120
acgggctgag tccggatttt caagaaggaa tgtttccagt gcggaagaaa acagcgtatc 180
agtaatcgtt ctcgcttcag agttgccgag cttcgttttc gtctgccctt cgaattgcgg 240
atcagggtgc ttaattgaaa tgatggcagt cagcccttct ctcacatcat caccgctcag 300
attcggatca ttttctttga aaatcccttt tcttcttgca tagtcgttta tgacacgggt 360
caaaccggtt ttaaatccgg cttcgtgcgt gccgccttcg tatgtgttga tgttattcgt 420
gaaagaataa atgttgcttg tatagctgtc gttgtattgc aatgcaactt caaccgttat 480
gccgtctttc tcgccttcga tataaatcgg ctcttcatga atgacttctt tggaacggtt 540
taagtactca acgtagcttt tgattccgcc ttcgtagtgg tactcgtttt tccgttcttg 600
tccttcacgt ttgtcttcaa tcgtgatgtt gacgcccttt gtcaggaagg ccaattctcg 660
gacacggttt gaaagcagat catagtcgta tacggttgtt tctttgaaaa tttccggatc 720
gggaacgaag tgcgtaatcg ttccggtctt atcagtgtca ccgatcactt caagatcggc 780
caccggtaca ccgcgttcat acgcc 805

Claims (18)

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）AT34，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15480。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34CGMCC No.15480。
3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCCNo.15480、或、权利要求2所述菌剂的应用，为a1）或a2）或a3）：
a1）生产大豆抗毒素；
a2）生产富含大豆抗毒素的大豆粉；
a3）诱导大豆产生大豆抗毒素。
4.一种生产大豆抗毒素的方法，包括如下步骤：
（1）向有切口的大豆子叶中加入权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480，培养；
（2）完成步骤（1）后，从所述大豆子叶中提取大豆抗毒素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480是通过向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的菌悬液实现的。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述菌悬液中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的浓度为7×1010cfu/mL-2×1011cfu/mL。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述加入的方式为b1）或b2）：
b1）将所述有切口的大豆子叶完全浸泡在所述菌悬液中；
b2）向所述大豆子叶的切口内滴入所述菌悬液。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，培养为23-27℃暗培养3-5d。
9.一种生产富含大豆抗毒素的大豆粉的方法，包括如下步骤：
（1）向有切口的大豆子叶中加入权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480，培养；
（2）完成步骤（1）后，将所述大豆子叶研磨成大豆粉；所述大豆粉即为富含大豆抗毒素的大豆粉。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480是通过向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的菌悬液实现的。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述菌悬液中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的浓度为7×1010cfu/mL-2×1011cfu/mL。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述加入的方式为b1）或b2）：
b1）将所述有切口的大豆子叶完全浸泡在所述菌悬液中；
b2）向所述大豆子叶的切口内滴入所述菌悬液。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，培养为23-27℃暗培养3-5d。
14.一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法，包括如下步骤：
（1）向有切口的大豆子叶中加入权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480，培养；
完成步骤（1）后的大豆子叶即产生大豆抗毒素。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480是通过向有切口的大豆子叶中加入解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的菌悬液实现的。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：所述菌悬液中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）AT34 CGMCC No.15480的浓度为7×1010cfu/mL-2×1011cfu/mL。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于：所述加入的方式为b1）或b2）：
b1）将所述有切口的大豆子叶完全浸泡在所述菌悬液中；
b2）向所述大豆子叶的切口内滴入所述菌悬液。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，培养为23-27℃暗培养3-5d。
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