CN108658962B - 3-取代香豆素呋咱衍生物及其在制备抗多药耐药肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属化学制药领域,涉及3‑取代香豆素母核及其α,β‑不饱和酮取代的衍生物,通过两碳链接与呋咱氮氧化物结合的呋咱偶联物,经实验证实其具有优良抑制敏感人肿瘤细胞和耐药瘤株细胞生长抑制活性;尤其对P‑gp过表达多药耐药肿瘤细胞具有选择性显著抑制活性;对正常细胞几乎没有毒性,具有优良的安全性。初步药理显示其通过释放高浓度一氧化氮,诱导癌细胞的凋亡功能,同时具有依赖P‑gp过表达特点,抑制MDR肿瘤生长的新作用机制。本发明的化合物为深入研究获得对敏感和耐药肿瘤均具有抑制活性的候选药物奠定了基础;同时为克服P‑gp过表达导致的MDR提供了新的方向和策略。
Description
技术领域
本发明属化学制药领域,涉及香豆素呋咱衍生物及其在制药中的用途,具体涉及3-苄基取代香豆素母核和开环衍生物与呋咱的偶联物及其在制备抑制P-gp过表达多药耐药(MDR)肿瘤生长活性药物中的用途。
背景技术
世界卫生组织(WHO)在《全球癌症报告2014》中指出“全球面临癌症大暴发,中国发病率第一”。我国癌症中心赫捷院士和肿瘤登记中心陈万青教授等专家于2016年全球癌症领域杂志《CA:临床医师癌症杂志》(CA CancerJ.Clin.)上在线报告:2015年我国有新发浸润性癌病例数429.2万,相当于平均每天新发12000例癌症,即每分钟有8人被诊断为恶性肿瘤;同时有281.4万癌症死亡病例,相当于平均每天7500人死于癌症,即每分钟有5人死于恶性肿瘤。据统计,我国肿瘤5年生存率预估为36.9%,美国2012年就已经达到70%。以上数字表明,肿瘤治疗是我国临床急需解决的健康卫生问题,攻克癌症的“登月计划”面临非常严峻的挑战。
目前,临床癌症治疗方式主要包括:外科手术治疗、放射治疗(放疗)、化学药物治疗(化疗)、生物治疗(包括免疫治疗、细胞治疗和基因治疗等)、介入治疗和热疗等。几十年来,本领域已发掘100多种有效的抗肿瘤药物,但是肿瘤快速耐药问题正成为药物根治肿瘤的主要障碍。研究显示,药物耐药包括原发性耐药和获得性耐药两种,其中,超过半数多药耐药(MDR)与ABC(the ATP-binding cassette)膜转运蛋白超家族的三个蛋白:多药耐药蛋白1(multi-drug resistance protein 1,MDR1,即P-糖蛋白(P-gp),ABCB1),MDR-相关蛋白1(MRP1,ABCC1)以及乳腺癌耐药蛋白(BCRP,ABCG2)密切相关(NatureRev.Cancer,2002,2,48-58),其中,P-gp过表达是ABC转运蛋白超家族成员中,更为常见导致肿瘤形成MDR的因素;对于结构和性质多样性的药物,P-gp可将它们泵出肿瘤细胞外,使药物浓度低于其能够杀灭肿瘤细胞的水平,从而引起多药耐药现象,导致癌症治疗的失败(NatRev.DrugDiscov.2006;5:219-34);因此,致力于找到合适的抑制剂以阻碍P-gp对药物的泵出作用,提高肿瘤细胞内药物的蓄积浓度,以克服癌细胞的多药耐药性一直是本领域重要的研究策略。20多年来,研究者已经发展了三代靶向P-gp抑制剂,然而由于体内副作用以及不理想的药效,至今未见有抑制P-gp药物成功上市(CancerRes.1982,42,4730-4733;Mol.Pharmacol.1989,36,543-546;Anti-CancerDrugs 1992,3,641-646)。
最近,有文献报道(Chem.Rev.2014,114,5753-5774;Molecular CancerTherapeutics,2016)如图1所示的结构的邻二氮杂菲金属复合物(1,1,10-phenanthrolinecomplexes)、三褶菊酮(2,perezone)、毛叶假鹰爪素D(3,triethyldesmosdumotin(TEDB))、8-羟基喹啉(4,8-hydroxyquinoline)以及缩氨基硫脲类(5,thiosemicarbazone)等类型,对含过表达P-gp的耐药肿瘤株,如耐长春新碱的宫颈鳞状癌细胞KB-V1和耐阿霉素的人子宫肉瘤细胞MES-SA/Dx5,具有比非耐药细胞KB和MES-SA更强的细胞增殖抑制活性;部分化合物对耐药细胞株毒性选择性高出敏感母体十几到几百倍,而P-gp的过表达对于维持这种选择性具有显著的必要性;这些结果是与传统认识中P-gp过表达MDR肿瘤株对药物不敏感现象矛盾的新发现。
Richardson等对活性较好的缩氨基硫脲类骨架化合物Dp44mT,通过机理研究发现(J.Biol.Chem.2015,290(15),9588–9603):Dp44mT利用溶酶体(lysosomes)上P-gp转运功能,内吞进入溶酶体,与Cu+形成络合物,参与氧化还原反应产生活性氧(ROS),增加溶酶体膜渗透性,最终使肿瘤细胞凋亡(apopotosis);研究证实MDR肿瘤细胞株中的P-gp具有重要的反向增加Dp44mT等化合物,抑制MDR肿瘤生长的助推作用;研究认为,通过P-gp靶向溶酶体是另一把克服肿瘤MDR的“枪”(FreeRadicalBiology and Medicine 2016,96,432–445);因此,根据该逆向增敏新理念,设计合成利用MDR肿瘤细胞中过表达P-gp特点,高选择性增加对MDR肿瘤生长抑制作用的新结构化合物,为获得具有新作用机制的抗MDR肿瘤候选药物提供了一个崭新的视角。
另有文献报道,香豆素是中草药中常见的天然产物母核,其衍生物具有抗菌、抗病毒、抗骨质疏松及抗肿瘤等多种生物活性。本发明课题组曾设计合成了一系列香豆素及其吡喃酮位置异构体的衍生物,显示良好地抑制肿瘤细胞增殖活性,促A549(肺癌细胞)凋亡活性呈明显浓度依赖关系,显示细胞分裂周期捕捉在G2/M期(Eur.J.Med.Chem.,2012,49,74-85);继而,通过构效关系研究,获得活性更好的呋咱香豆素偶联物CY-11S-1A26,具有稳定释放NO作用和良好的肿瘤细胞选择性,对受试的A549、Hela(人宫颈癌细胞)、A2780(卵巢癌细胞)细胞以及MDA-MB-231HM(三阴性乳腺癌细胞体内传代筛选出具肺高转移倾向的细胞)、SKOV3(卵巢癌细胞)5种敏感及耐顺铂的A2780和耐吉西他滨的MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)2种耐药肿瘤细胞增殖抑制均有nM水平IC50值,初步药理实验显示,化合物CY-11S-1A26能够通过抑制MEK通路、诱导凋亡和阻断血管形成等作用,从多个方面协同抑制肿瘤细胞增殖,体现出“单药多靶”的特点(J.Med.Chem.,2014,57,9343-9356)。
基于现有技术的现状,本申请的发明人拟提供新的具有对P-gp过表达的多药耐药(DMR)肿瘤细胞增殖抑制作用的化合物,为进一步制备P-gp过表达导致的肿瘤多药耐药的抗肿瘤药物提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的现状,提供活性明确,尤其对P-gp过表达的MDR肿瘤耐药株具有作用的新型抗肿瘤药效化合物。涉及香豆素呋咱衍生物及其在制备抗多药耐药肿瘤药物中的用途,具体涉及3-苄基取代香豆素母核和开环衍生物与呋咱的偶联物,尤其是化合物4-(2-((3-(4-氟苄基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(CY-14S-4A83,15b)及其衍生物和在制备对P-gp过表达的多药耐药(DMR)肿瘤细胞增殖抑制药物的用途。
本发明以原有活性化合物CY-11S-1A26为基础,设计合成如图2所示的,对敏感肿瘤以及P-gp过表达的MDR肿瘤生长具有显著抑制活性的,保留或打开香豆素二环结构的呋咱氮氧化物偶联物;所述的化合物是3-位含取代的香豆素母核及其开环衍生物通过两碳链接与呋咱氮氧化物结合的呋咱衍生物。
更具体的,本申请人对先导化合物CY-11S-1A26进行了优化,得到香豆素环3-位含苄基取代的新呋咱偶联物和用α,β-不饱和酮代替香豆素吡喃酮的衍生物;药理活性显示,合成的化合物保留了对原来敏感肿瘤株和耐药株nM水平的抑制活性,而且对P-gp过表达的多药耐药(DMR)肿细胞增殖抑制,显示比相应敏感株显著的选择性抑制,可能存在通过P-gp靶向溶酶体促使肿瘤凋亡的新机制。
本发明中,优选的香豆素呋咱衍生物具有如下式I和II的结构,
所述的香豆素呋咱衍生物为香豆素母核3-位连接有或无取代基的芳苄基,通过两碳边链与呋咱氮氧化物拼合成I类型中产物;
以及香豆素吡喃酮被α,β-不饱和酮取代再连接有或无取代基的芳苄基,通过两碳边链与呋咱氮氧化物拼合成II类型中产物,
其中:X为含一个碳的链接,
R为取代或无取代芳基、芳杂环,
R1和R2为氢原子、卤素、烷基、烷氧基、硝基、磺酰胺基。
本发明中,更优选的式I和II结构的香豆素呋咱衍生物中:X=CH2、CO;R1和R2为氢原子、氟原子、甲基、甲氧基、乙氧基、硝基、NHSO2NHCH3;R为取代芳基、芳杂环(包括吡啶、呋喃、吡咯和噻吩)。
本发明提供了所述的香豆素母核的呋咱衍生物的制备方法,其包括:
市售溴苄、对氟溴苄和间硝基溴苄(6a-c)和乙酰乙酸乙酯(7),在NaH和四氢呋喃(THF)中反应,得到中间体8a-c;进一步在70%硫酸下与间苯二酚缩合反应得到3-取代的香豆素母核产物9a-c,然后与氯乙醇、碳酸钾、碘化钾在DMF中回流反应得到7-羟乙氧基3-取代的香豆素中间体10a-c,其中化合物10c在DMF中,用氯化亚锡还原得到3-间氨基苄基取代香豆素衍生物11,进一步与自制的试剂12反应,得到3-间磺酰氨基苄基取代香豆素衍生物13;最后,中间体10a,b及13与呋咱氮氧化合物14,在含碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)的二氯甲烷中,室温反应合成目标衍生物15a-c。化学反应如下通式一:
通式一,
市售苯甲醛和对氟苯甲醛(17a,b)与4-甲氧甲氧基-2-甲氧基-苯乙酮(16),在含60%NaOH乙醇溶剂中缩合反应,得到中间体18a,b;进一步盐酸酸化去除甲氧基甲基保护基团,得到香豆素开环中间体19a,b,然后与氯乙醇、碳酸钾、碘化钾在DMF中回流反应得到4-羟乙氧基取代中间体20a,b;最后,与呋咱氮氧化合物14,在含碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)的二氯甲烷中,室温反应合成香豆素开环用α,β-不饱和酮代替的呋咱衍生物21a,b。化学反应如下通式二:
通式二,
本发明所述的3-取代香豆素母核及其开环衍生物,通过两碳链接与呋咱氮氧化物结合的偶联物(15a-c;21a,b),进行了体外抗肿瘤活性筛选试验;
在体外药理实验中,以原活性化合物CY-11S-1A26和顺铂等为阳性对照,检测对敏感的肿瘤细胞株子宫癌细胞(Hela)、四株卵巢癌细胞(SKOV3、OVCA433、OVCA429、A2780)、三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、人口腔表皮癌细胞(KB)以及耐顺铂的A2780/CDDP、耐吉西他滨的231/Gem、耐长春新碱的KBV和耐阿霉素的MCF-7/ADR等人肿瘤细胞生长抑制活性,结果显示,所述的化合物,除了对2株敏感人肿瘤细胞KB和MCF-7的细胞增殖抑制活性在微摩尔水平外,对其他敏感和耐药株均显示纳摩尔的IC50值,具有优良抑制活性;其中3-对氟苄基取代呋咱香豆素偶联物CY-14S-4A83(15b),除了保留对以上多种敏感和耐药的实体瘤在0.8-23nM活性外;还出现反常现象:即CY-14S-4A83(15b)对敏感MCF-7细胞增殖抑制活性IC50为2.85μM,而对于耐药的MCF-7/ADR却是IC50=0.005μM,即对耐药株抑制活性高出敏感株550多倍;对敏感KB活性IC50为3.23μM,而对于耐药KBV却是IC50为0.011μM,也具有293倍的差异;另外,对于永生化人类卵巢表面上皮细胞T29的IC50>5μM,以及脐静脉内皮细胞(HUVEC)IC50为0.266μM,显示良好细胞选择性。
本发明中,初步药理机制显示本发明所述的化合物同样可以释放NO,但是也出现不同于原先导化合物CY-11S-1A26特点,如没有浓度依赖的细胞周期捕捉现象,没有将细胞周期阻滞在G2/M;可以显著促进肿瘤凋亡,但是主要发生在早期凋亡,而不是原来活性化合物的晚期凋亡;对P-gp过表达耐药肿瘤株(KBV,MCF-7/ADR)与敏感母体细胞增殖,具有显著选择性抑制活性;而对于非P-gp过表达耐药肿瘤株(A2780/CDDP,MDA-MB-231/GEM)与敏感母体细胞增殖,则具有几乎同样敏感的毒性,没有选择性抑制;实验提示,本发明所述的化合物可能存在抑制P-gp过表达导致的多药耐药肿瘤细胞增殖的新的作用机制。
本发明中通过下述方法检测所述的化合物抑制肿瘤活性的作用。
1、采用MTT法检测本发明化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性,将对数生长期的癌细胞接种于96孔板中,分为空白对照组、阳性药对照组(顺铂、吉西他滨、阿霉素、长春新碱)和不同浓度的本发明化合物处理组,37℃培养48h后进行MTT检测,计算细胞增殖抑制率及IC50;
2、应用Western blot(免疫印迹法)分析,检测本发明化合物作用的耐药肿瘤株内的P-gp表达,受试敏感和耐药细胞,培养后进行处理,收集细胞用冷PBS洗涤1次,用RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟,4℃、12000rpm离心15分钟,总蛋白用BCA法定量,每道30μg的上样量,经SDS-PAGE电泳后转印到聚偏二乙烯的氟化物PVDF膜上,封闭于10%脱脂奶中,依次进行一抗、二抗反应,曝光显色;
3、采用经典的Griess试剂检测本发明化合物的细胞内NO释放水平,受试肿瘤细胞A2780(1×107个于10cm培养皿)用100μM浓度本发明化合物孵化150分钟后,收集细胞用RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟,细胞裂解液4℃、12000rpm离心15分钟,上清中加入NADPH、FAD、Nitrate Reductase,37℃孵育30min;再加入LDH及LDH Buffer,37℃继续孵育30min;然后与Griess试剂混合30分钟,在540nm下检测吸光度,不加药物作用的细胞经同样条件下处理后作为本底,以原活性化合物CY-11S-1A26做对照,不同浓度下亚硝酸钠用同样方法处理制备标准曲线。
本发明提供了新的结构的3-取代香豆素母核及其开环衍生物呋咱偶联物,经实验证实具有明显的体外抑制肿瘤细胞的活性,尤其对P-gp过表达DMR肿瘤细胞增殖具有显著的抑制作用,所述的化合物通过释放高浓度的一氧化氮,诱导癌细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖作用,和通过释放高浓度的一氧化氮,选择性抑制P-gp过表达的MDR肿瘤细胞增殖。本发明为深入研究获得对敏感和耐药肿瘤均具有抑制活性的候选药物奠定了基础;同时也通过对新作用机制的研究,为克服P-gp过表达导致的MDR提供了新的方向和策略。
本发明的3-取代香豆素呋咱衍生物可用于制备抑制敏感和耐药人类肿瘤细胞的药物制剂;所述的敏感肿瘤细胞是敏感的肿瘤细胞株子宫癌细胞(Hela)、四株卵巢癌细胞(SKOV3、OVCA433、OVCA429、A2780)、三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、口腔表皮癌细胞(KB);所述的耐药肿瘤细胞是耐顺铂的A2780/CDDP、耐吉西他滨的MDA-MB-231/Gem、耐长春新碱的KB-V和耐阿霉素的MCF-7/ADR。
附图说明
图1显示了抑制P-gp过表达的MDR肿瘤细胞增殖的化合物结构通式。
图2显示了化合物CY-11S-1A26及I和II类结构特征示意图。
图3显示了化合物CY-14S-4A83对受试细胞没有周期捕捉情况。
图4显示了化合物CY-14S-4A83促进受试肿瘤细胞凋亡现象。
图5显示了耐药株及其对应敏感株中P-gp表达情况。
图6显示了化合物在细胞内的NO释放水平。
图7显示了优选的香豆素呋咱衍生物具有式I和II的结构,所述的香豆素呋咱衍生物为3-取代香豆素母核及其开环用α,β-不饱和酮替代的衍生物,通过两碳与呋咱氮氧化物拼合的产物。
具体实施方式
通过以下实施方法将有助于理解本发明,但并不限制于本发明的内容。
实施例1
通式一中化合物2-(4-氟苄基)-3-氧代丁酸乙酯(8b)的合成
60%的NaH(0.76g,18.9mmol,1.2e.q)置于三角烧瓶中,冰浴中,加入无水THF(47.4mL),搅拌;缓慢滴加乙酰乙酸乙酯(2.06g,15.8mmol,1.0e.q);反应15min后,缓慢逐滴滴加4-氟代苄溴(3.29g,17.38mmol,1.1e.q),撤冰浴,2h反应完全;过滤除去固体,蒸去大部分溶剂,加入饱和NH4Cl溶液,乙酸乙酯萃取三次,有机相用饱和NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥;过滤,有机相蒸干得浅黄色油状液体产物(8b),直接作为下一步反应原料。
实施例2
通式一中化合物3-(4-氟苄基)-7-羟基-4-甲基-2H-色烯-2-酮(9b)的合成
浅黄色油状液体(8b)中,加入间苯二酚固体(1.74g,15.8mmol,1.0e.q),冰浴下加入70%硫酸(9mL水中缓慢加入21mL浓硫酸配制,30mL),反应30min后撤冰浴,室温下继续反应2h;将反应液细流倾入冰水中,得浓稠的胶状物,用乙酸乙酯萃取三次,有机相用饱和NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥;过滤,有机相蒸干得暗红色粗品。EtOH重结晶,干燥后得浅黄色固体产物(9b)1.58g,两步反应总收率35.10%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.47(s,1H,7-OH),7.65(d,J=8.6Hz,1H,5-H),7.29–7.21(m,2H,2’,6’-Bn-H),7.09(t,J=8.8Hz,2H,3’,5’-Bn-H),6.81(d,J=8.6Hz,1H,6-H),6.71(s,1H,8-H),3.90(s,2H,3-CH2),2.40(s,3H,4-CH3)。
实施例3
通式一中化合物3-(4-氟苄基)-7-(2-羟乙氧基)-4-甲基-2H-色烯-2-酮(10b)的合成
化合物9b(1.0g,3.52mmol,1.0e.q)、碳酸钾(1.46g,10.55mmol,3.0e.q)、碘化钾(63.3mg,0.35mmol,0.1e.q)置于三口烧瓶中,加入8mL DMF,加热至90℃;缓慢滴加溶于2mLDMF中的氯乙醇(0.47mL,7.04mmol,2.0e.q);升温回流反应2h;冷至室温,倾入至100mL冰水中,产生沉淀;过滤,洗涤,干燥得浅黄色粗品。粗品用二氯甲烷和甲醇混合溶液溶解,柱层析得浅黄色固体产物(10b)(0.94g,81.31%)。MS(EI)(m/z)329.0[M+H]+;1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.54(d,J=8.9Hz,1H,5-H),7.21(m,2H,(2’,6’-Bn-H)),6.95(t,J=8.6Hz,2H,(3’,5’-Bn-H)),6.90(dd,J=8.9,2.5Hz,1H,6-H),6.84(d,J=2.5Hz,1H,8-H),4.15(t,2H,OCH2 CH2OH),4.06–3.97(m,4H,OCH2 CH2 OH,3-CH2),2.42(s,3H,4-CH3)。
实施例4
通式一中化合物4-(2-((3-(4-氟苄基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-14S-4A83,15b)的合成
化合物10b(500mg,1.52mmol,1.0e.q)、2-氧代-3,4-二苯磺酰基呋咱(14,725.4mg,1.98mmol,1.3e.q)置于三口烧瓶中,抽换氮气;冰浴,加入无水二氯甲烷(10mL);滴加DBU(0.54mL,3.05mmol,2.0e.q),撤冰浴,室温下继续反应过夜;直接过滤,固体用EtOH多次洗涤,干燥得白色固体产物(15b)(435.5mg,51.40%)。MS(EI)(m/z)553.2[M+H]+;1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(d,J=7.8Hz,2H,(2’,6’-SO2Ph-H)),7.83(t,J=7.4Hz,1H,4’-SO2Ph-H),7.79(d,J=8.8Hz,1H,5-H),7.66(t,J=7.8Hz,2H,(3’,5’-SO2Ph-H)),7.27(t,J=6.8Hz,2H,(2”,6”-Bn-H)),7.13–7.06(m,3H,(3”,5”-Bn-H),8-H),7.03(d,J=8.8Hz,1H,6-H),4.77(d,J=5.5Hz,2H,Furazanyl-OCH2 CH2O),4.50(d,J=5.5Hz,2H,Furazanyl-OCH2 CH2 O),3.94(s,2H,3-CH2),2.46(s,3H,4-CH3);13C NMR (150MHz,DMSO-d6)δ161.1,160.3,158.7,153.2,148.3,137.1,136.0,135.3,129.8,129.8,129.7,128.2,126.7,121.2,115.1,114.9,113.9,112.5,110.4,101.2,69.6,66.0,31.3,15.1。
实施例5
通式一中化合物4-(2-((3-苄基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-12S-4C35,15a)的合成
化合物10a(870mg,2.8mmol,1.0e.q)、2-氧代-3,4-二苯磺酰基呋咱(14,1318.8mg,3.6mmol,1.3e.q)置于三口烧瓶中;冰浴下,加入无水二氯甲烷(20mL);滴加DBU(852.5mg,0.84mL,5.6mmol,2.0e.q),撤冰浴,室温下继续反应1小时。加入二氯甲烷,水洗3次,饱和NaCl溶液洗涤一次,无水Na2SO4干燥;有机相蒸干得米白色固体,干燥;柱层析,干燥后得白色产物15a(803.8mg),收率53.64%。MS(EI)(m/z)557.2[M+Na]+;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(d,J=7.8Hz,2H,(2’,6’-SO2Ph-H)),7.87–7.74(m,2H,4’-SO2Ph-H,5-H),7.66(t,J=7.8Hz,2H,(3’,5’-SO2Ph-H)),7.29-7.16(m,5H,Bn-H),7.09(s,1H,8-H),7.03(d,J=8.8Hz,1H,6-H),4.77(d,J=5.4Hz,2H,Furazanyl-OCH2 CH2O),4.50(d,J=5.4Hz,2H,Furazanyl-OCH2 CH2 O),3.34(s,2H,3-CH2),2.46(s,3H,4-CH3);13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ161.1,160.3,158.7,153.2,148.2,139.2,137.1,136.0,129.8,128.3,128.1,127.9,126.7,126.0,121.2,113.9,112.5,110.4,101.1,69.6,66.0,32.1,15.1。
实施例6
通式一中化合物4-(2-((4-甲基-3-(3-((N-甲基磺酰胺基)氨基)-苄基)-2-氧代-2H-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-14S-6A50,15c)的合成
化合物13(120.0mg,0.288mmol,1.0e.q)和2-氧代-3,4-二苯磺酰基呋咱(14,136.9mg,0.37mmol,1.3e.q)置于三口烧瓶中,抽换氮气;冰浴下加入无水二氯甲烷(4mL);滴加DBU(85.4μL,0.58mmol,2.0e.q);搅拌15min后撤冰浴,室温过夜反应至完全。加入2NHCl,用二氯甲烷萃取多次,有机相合并后依次用水及饱和NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥。蒸干后硅胶柱层析进一步纯化后得白色产物15c(157.0mg),收率85.0%。MS(EI)(m/z)643.2[M+H]+;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H, NHSO2NHCH3),7.98(d,J=7.9Hz,2H,(2’,6’-SO2Ph-H)),7.88–7.77(m,2H,4’-SO2Ph-H,5-H),7.66(t,J=7.7Hz,2H,(3’,5’-SO2Ph-H)),7.23(q,J=5.0Hz,1H,NHCH3),7.17(t,J=7.8Hz,1H,2”-Bn-H),7.09(d,J=2.5Hz,1H,8-H),7.07-6.98(m,3H,6-H,(4”,5”-Bn-H)), 6.85(d,J=7.6Hz,1H,6”-Bn-H),4.77(brs,2H,Furazanyl-OCH2 CH2O),4.49(brs,2H,Furazanyl-OCH2 CH2 O),3.91(s,2H,3-CH2),2.45(s,3H,4-CH3),2.42(d,J=4.9Hz,3H,NHCH3 );13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ160.9,160.2,158.6,153.2,148.3,139.8,138.8,137.0,135.9,129.7,128.7,128.1,126.6,122.0,120.9,117.9,115.8,113.8,112.4,110.3,101.1,69.5,65.9,28.1,15.1。
实施例7
通式二中化合物4-(2-(4-肉桂酰基-3-甲氧基苯氧基)乙氧基-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-14S-6C44,21a)的合成
化合物20a(2.0g,6.70mmol,1.0e.q)和2-氧代-3,4-二苯磺酰基呋咱(14,3.19g,8.71mmol,1.3e.q)置于三口烧瓶中,抽换氮气;冰浴下加入无水二氯甲烷(20mL);滴加DBU(2.0mL,13.41mmol,2.0e.q);搅拌15min后撤冰浴,室温下反应14h;加入2N HCl,用二氯甲烷多次萃取,有机相合并后依次用水及饱和NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥。蒸干后硅胶柱层析进一步纯化后得白色固体产物21a(2.98g),收率85.0%。(400MHz,Chloroform-d)δ8.02(d,J=7.9Hz,2H,(2’,6’-SO2Ph-H)),7.79(d,J=8.6Hz,1H,6-Ar-H),7.75-7.66(m,2H,4’-SO2Ph-H,CO-CH=CH),7.61(dd,J=6.8,2.8Hz,2H,(3’,5’-SO2Ph-H)),7.58-7.48(m,3H,(2”,6”-Ph-H),CO-CH=CH),7.40(dd,J=5.1,1.9Hz,3H,,(3”,4”,5”-Ph-H)),6.61(dd,J=8.6,2.2Hz,1H,5-Ar-H),6.57(d,J=2.2Hz,1H,3-Ar-H),4.81(dd,J=5.6,3.4Hz,2H,Furazanyl-OCH2 CH2O),4.49-4.45(m,2H,Furazanyl-OCH2 CH2 O),3.94(s,3H,-OCH3);13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ190.6,162.6,160.4,158.8,142.4,138.0,135.6,135.4,132.9,130.1,129.7,128.9,128.6,128.3,127.1,123.1,110.4,105.8,99.4,69.3,65.5,55.9。
实施例8
通式二中化合物(E)-4-(2-(4-(3-(4-氟苯基)丙烯酰基-3-甲氧基苯氧基)乙氧基-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-14S-6B39,21b)的合成
化合物20b(485.0mg,1.53mmol,1.0e.q)和2-氧代-3,4-二苯磺酰基呋咱(14,730.2mg,1.99mmol,1.3e.q)置于三口烧瓶中,抽换氮气;冰浴下加入无水二氯甲烷(10mL);滴加DBU(0.46mL,3.07mmol,2.0e.q);搅拌15min后撤冰浴,室温下继续反应。TLC监测反应,3.5h反应至完全;停止反应,加入2NHCl,用二氯甲烷萃取多次,有机相合并后依次用水及饱和NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥。蒸干后硅胶柱层析进一步纯化后得白色固体产物21b(704.4mg),收率85.0%。MS(EI)(m/z)541.2[M+H]+;1HNMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.02(d,J=7.8Hz,2H,(2’,6’-SO2Ph-H)),7.78(d,J=8.6Hz,1H,6-Ar-H),7.71(t,J=7.5Hz,1H,4’-SO2Ph-H),7.65(d,J=15.8Hz,1H,CO-CH=CH),7.61-7.57(m,2H,(3’,5’-SO2Ph-H)),7.57-7.52(m,2H,(2”,6”-Ph-H)),7.43(d,J=15.8Hz,1H,CO-CH=CH),7.09(t,J=8.6Hz,2H,(3”,5”-Ph-H)),6.61(dd,J=8.6,2.3Hz,1H,5-Ar-H),6.57(d,J=2.3Hz,1H,3-Ar-H),4.82-4.79(m,2H,Furazanyl-OCH2 CH2O),4.49-4.45(m,2H,Furazanyl-OCH2 CH2 O),3.93(s,3H,OCH3)。13C NMR(150MHz,Chloroform-d)δ190.3,164.6,163.0,162.7,160.4,158.8,141.1,138.0,135.7,132.9,131.7,130.2,130.1,129.7,128.6,126.8,123.0,116.1,115.92,110.4,105.9,99.4,69.3,65.5,55.9。
实施例9体外抗肿瘤活性筛选试验
1)采用MTT法检测本发明化合物抑制肿瘤细胞增殖的活性,将对数生长期的癌细胞接种于96孔板中,分为空白对照组、阳性对照组和不同浓度的本发明化合物或阳性药处理组,37℃培养48h后进行MTT检测,计算细胞增殖抑制率及IC50;
2)、应用Westernblot(免疫印迹法)分析,检测本发明化合物作用的耐药肿瘤株及其相对应的敏感肿瘤株内的P-gp表达,受试敏感和耐药细胞,培养后进行处理。收集细胞用冷PBS洗涤1次,用RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟,4℃、12000rpm离心15分钟,总蛋白用BCA法定量,每道30μg的上样量,经SDS-PAGE电泳后转印到聚偏二乙烯的氟化物PVDF膜上,封闭于10%脱脂奶中,依次进行一抗、二抗反应,曝光显色;
结果显示,所述的化合物具有优良抑制肿瘤细胞活性的作用和抑制耐药肿瘤株活性作用(如表1,表2和表3所示),其中化合物4-(2-((3-(4-氟苄基)-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(CY-14S-4A83),对7株敏感人肿瘤细胞Hela、SKOV3、OVCA433、OVCA429、A2780、MDA-MB-231和A549,IC50分别为2.8,8.3,3.3,3.9,6.6,0.8和3.7nM,具有显著的活性;同时对耐顺铂的A2780/CDDP和耐吉西他滨的MDA-MB-231/Gem的细胞增殖抑制,也同样具有22.8和6.9nM的IC50值;有趣的现象是,3-对氟苄基取代呋咱香豆素偶联物CY-14S-4A83对KB和MCF-7这2株敏感人肿瘤细胞的增殖抑制活性,显得非常不敏感,反而对相应耐药株具有显著的抑制活性:即CY-14S-4A83对敏感MCF-7细胞增殖抑制活性IC50为2.85 μM,而对于耐药的MCF-7/ADR却是IC50=0.005μM,即对耐药株抑制活性高出敏感株550多倍;对敏感KB活性IC50为3.23μM,而对于耐药KB-V却是IC50为0.011μM,也具有293倍的差异;另外,该化合物对于永生化人类卵巢表面上皮细胞T29的IC50>5μM,以及脐静脉内皮细胞(HUVEC)IC50为0.266μM,显示良好细胞选择性。
表1是本发明化合物的抗肿瘤细胞增殖活性结果。
表2是本发明的化合物抑制耐药瘤株活性结果。
表3是本发明的化合物对正常细胞的毒性。
此外,初步药理实验结果显示,化合物CY-14S-4A83出现不同于原先导化合物CY-11S-1A26的特点,如图3所示,未见有与CY-11S-1A26一样的浓度依赖的细胞周期捕捉在G2/M;如图4所示,CY-14S-4A83可以显著促进肿瘤凋亡,但是主要发生在早期凋亡,而不与原来活性化合物CY-11S-1A26一样为晚期凋亡。
图5显示了在免疫蛋白印迹法中,耐药的MCF-7/ADR和KB-V为P-gp过表达,而敏感MCF-7和KB则无P-gp表达。相应没有选择性的MDA-MB-231/GEM和A2780/CDDP耐药株,也同样没有P-gp表达。
表1
表2
表3
实施例10
采用经典的Griess试剂检测本发明化合物的细胞内NO释放水平,受试A2780肿瘤细胞(1×107个于10cm皿)用100μM浓度本发明化合物孵育150分钟后,收集细胞用RIPA裂解液冰上裂解细胞30分钟,细胞裂解液4℃、12000rpm离心15分钟,上清中加入NADPH、FAD、Nitrate Reductase,37℃孵育30min;再加入LDH及LDH Buffer,37℃继续孵育30min;然后与Griess试剂混合30分钟,在540nm下检测吸光度,不加药物作用的细胞经同样条件下处理后作为本底,不同浓度亚硝酸钠用同样方法处理制备标准曲线,以原活性化合物CY-11S-1A26做对照;结果如图6所示,本发明化合物同样可以释放相当浓度的NO。
Claims (5)
2.权利要求1的衍生物在制备抑制敏感和耐药人类肿瘤细胞的药物制剂中的用途;
所述的敏感肿瘤细胞是敏感的子宫癌细胞Hela,四株卵巢癌细胞SKOV3,OVCA433,OVCA429,A2780,三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,肺癌细胞A549,乳腺癌细胞MCF-7,口腔表皮癌细胞KB。
3.按权利要求2的用途,其特征在于,所述的耐药肿瘤细胞是耐顺铂的A2780/CDDP,耐吉西他滨的MDA-MB-231/Gem,耐长春新碱的KB-V和耐阿霉素的MCF-7/ADR。
4.按权利要求2的用途,其特征在于,所述的衍生物,释放高浓度的一氧化氮,诱导癌细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖作用。
5.按权利要求2的用途,其特征在于,所述的衍生物,释放高浓度的一氧化氮,选择性抑制P-gp过表达的MDR肿瘤细胞增殖作用。
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