CN108642113A

CN108642113A - 一种高效且稳定制备高f值玉米寡肽的方法

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Publication number: CN108642113A
Application number: CN201810413496.3A
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 李婷婷; 黄钦钦; 周楠迪
Original assignee: Niu Sui Sheng Special Medical Food Jiangsu Co Ltd; Jiangnan University
Current assignee: Niu Sui Sheng Special Medical Food Jiangsu Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: CN108642113B

Abstract

本发明公开了一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法，属于酶制剂技术领域。该方法本着选用特异性蛋白酶替换酶切位点广泛的蛋白酶进行定向水解，提高原料的F值及实用价值，同时提供一种高效且稳定制备高F值寡肽的方法及放大工艺进而用于工业化生产的目的，本发明采用易操作、易工业化生产的活性炭静态吸附进行脱芳高F值化处理，解决了目前高F值寡肽产品极度缺乏的问题。本发明的多次验证实验具有可重复性，说明该制备方法具有较高的稳定性；可控酶解反应条件温和，制备方法清洁环保，符合国家清洁生产的相关规定；利用低价值的玉米粗肽，开发高价值且极度缺乏的高F值功能性产品，符合未来功能性食药的趋势和发展。

Description

一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法

技术领域

本发明涉及一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法，属于酶制剂技术领域。

背景技术

F值为支链氨基酸(BCAA；包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)与芳香族氨基酸(AAA；包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的摩尔数之比，这是为了纪念德国医学博士Fischer在20世纪70年代提出的“伪神经递质假说”而命名的。研究表明，F值是反映肝脏疾病程度的重要指标，对于正常人而言，血液的F值大约为3.5～4.0，而肝脏病人血液的F值会低于2.5，如果下降到1.2，会出现肝昏迷状况，若低于0.8，会导致深度昏迷。所以，肝脏病人应及时补充高F值产品从而恢复体内平衡状态。

目前，国内外市售的高F值产品都是由氨基酸复配而成，还未有高F值寡肽产品出售，而现代营养学研究表明：寡肽与游离氨基酸相比，除了可以作为营养物质外，还具有渗透压低、耗能低等优点，更容易被机体吸收利用。因为氨基酸和寡肽的被吸收属于两个独立的运作系统，其中，氨基酸的吸收属于主动运输，主要依靠Na⁺转运体系从而造成氨基酸吸收慢，相互竞争性、载体易饱和，吸收耗能大，而寡肽的被吸收属于被动吸收，主要依赖H⁺或Ca⁺转运体系，转运具有耗能低、转运速度快、载体不易饱和、渗透压低等优点。所以，高F值寡肽的优势吸引着研究者及消费者的眼球，从而促使其研发工作的推进。

高F值寡肽是一类由3～6个氨基酸残基组成、分子量为200～1000Da、F值大于20、游离氨基酸含量不超过5％的混合活性肽。有关研究表明，高F值寡肽不仅可以缓解或治疗肝性脑病，还因其独特的氨基酸组成而具有改善术后及卧床病人的营养状况、解酒醒酒、抗疲劳、缓解苯丙酮尿症对神经系统的损害及抗癌等生理功能。近些年来，随着人们生活质量的提高及各方面压力导致身体素质的减弱，高F值寡肽产品在食品和医疗领域备受关注，且具有广阔的开发及发展前景。

高F值寡肽具有十分可观的生物活性，它的高标准决定其制备不易，其中，提高F值是重中之重。在酶解工艺中，提高F值的关键点是选择酶切位点专一的内、外切蛋白酶进行协同定向水解，高效释放芳香族氨基酸。目前，在以玉米为原料制备高F值寡肽的国、内外研究中，研究者主要选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肌动蛋白酶中的一种或是两种酶组合进行酶解。这些酶的酶切位点广泛，在实际生产中，会因酶解过程不易控制而导致实验的重复性差，从而不利于投入到工业化生产；也会因耗酶量多而增大生产成本，进而影响产品投入市场的效益。

在纯化工艺中，提高F值的关键点是脱芳处理。对于酶解工艺中释放出的游离态芳香族氨基酸，需要有效去除芳香族氨基酸进行脱芳高F值化。目前，脱芳的方法主要有离子交换法、膜分离法、凝胶色谱法、亲和层析法、活性炭色谱法。大量研究报道，一般采用Sephadex G-15或Bio-Gel P-2凝胶层析进行分离纯化，但是因为上样量少而不易于工艺的放大，从而给投入临床及市场的工业化生产带来困难。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种特定内外切蛋白酶协同定向水解及一步纯化显著提高玉米肽F值的方法，着重于选用特异性蛋白酶替换酶切位点广泛的蛋白酶进行定向水解，在提高F值进而提高原料实用价值的同时，也提高实验的可重复性；本发明同时提供了一种高效且稳定制备高F值寡肽的方法，不仅可以减小酶的消耗量、降低生产成本、省去灭酶处理环节进而节能，还可以稳定制备且放大工艺进而用于临床及市场的工业化生产。

本发明的目的是提供一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法，所述方法为采用特定内、外切蛋白酶定向协同水解法水解玉米粗肽得到酶解液，然后采用活性炭静态吸附法对酶解液进行脱芳高F值化处理，经干燥后得到高F值寡肽。

在本发明的一种实施方式中，所述内切酶为α-胰凝乳蛋白酶，所述外切酶为羧肽酶A。

在本发明的一种实施方式中，所述一种制备高F值玉米寡肽的方法的具体步骤为：

(1)第一步水解：配制成玉米粗肽溶液，加入α-胰凝乳蛋白酶，在30～50℃，pH为7～9的条件下反应1～5h，得到第一步水解液；

(2)第二步水解：将羧肽酶A加入到第一步水解液中，在27～47℃，pH为6～8的条件下反应0.5～2.5h，灭酶，得到第二步水解液；

(3)活性炭脱芳：将第二步水解液离心得到酶解液，然后加入粉末活性炭，在15～35℃，pH为2～4的条件下吸附1～5h，过滤，完成脱芳高F值化处理；

(4)冷冻干燥：将完成脱芳处理的溶液进行干燥得到高F值玉米寡肽。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的玉米粗肽易溶于水且全溶，起始F值为2.6～4.2。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的玉米肽的浓度为10～90g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中α-胰凝乳蛋白酶的添加量为酶底比为5×10³～2.5×10⁴U/g

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的羧肽酶A的添加量为酶底比为1～5U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的灭酶为90℃水浴中灭酶10～15min.

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的活性炭的添加量为活性碳质量与酶解液体积比值1:10～1:50。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的活性炭为粉末状、100目颗粒、200目颗粒、10目杏壳、20目杏壳、柱状。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的活性炭为粉末状。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)步中的离心为在15-25℃、转速为8000-10000rpm的条件下，离心8-15min，得到澄清透明的酶解液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的过滤为在4-6℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心10-20min，然后经滤纸过滤。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的干燥具体为将脱芳后液体在-80℃冰箱中冷冻12～18h后，再经冷冻干燥机运行17个循环，大约48～60h。

步骤(3)中所述的脱芳方法是活性炭静态吸附法，活性炭色谱法较离子交换法、膜分离法、凝胶色谱法、亲和层析法等脱芳方法，具有成本低、易操作、效率高等优点。活性炭吸附有静态和动态两种，实验对比表明：活性炭静态吸附的效果更好，所以选择静态吸附。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，利用吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。活性碳吸附分离苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的机理尚不完全清楚，其吸附可理解为非极性苯环侧链与活性炭碳巨大表面间非极性吸附和氨基酸极性吸附与活性炭含氧基团间极性吸附的总和。以芳香族氨基酸的结构看，在吸附过程中以物理吸附为主，分子中苯环部分与活性炭表面的石墨型微晶结构以色散力为主的物理吸附，很可能苯环部分横卧于石墨的微结晶上，而当-OH基取代时又很可能由横卧转向垂直。

本发明的有益效果：

本发明提供一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法，该方法采用特定内、外切蛋白酶协同定向水解，在稍微改变玉米粗肽分子量范围且保证酶解液分子量主要集中于180～1000Da的条件下，酶解液的F值达到6.22，是起始F值的1.5倍，解决目前选用酶切位点广泛的蛋白酶而引起的酶消耗量大、生产成本高、实验稳定性差等问题。本发明采用一步活性炭吸附层析的纯化工艺，得到F值为41.17的高F值玉米寡肽，且分子量在180～1000Da的寡肽占总含量的56.42％，游离态氨基酸占4％。此分子量分布及游离氨基酸的含量均符合高F值寡肽的要求，且此F值是起始F值的10倍，是活性炭吸附层析前的6.6倍。此工艺可以大批量生产，解决目前采用Sephadex G-15或Bio-Gel P-2凝胶层析分离纯化工艺中上样量少、生产周期长、难以工业化生产的问题。本发明较其他制备高F值寡肽的方法，不仅高效且稳定，而且制备工艺操作简单、节能、易放大、适合工业化生产，为投入临床及市场提供条件。利用低价值的玉米粗肽，开发高价值且极度缺乏的高F值功能性产品，符合未来功能性食药的趋势和发展。

附图说明

图1高效且稳定制备高F值玉米寡肽的流程图

图2α-胰凝乳蛋白酶酶解条件的优化图，其中(a)底物浓度对酶解的影响；(b)酶底比对酶解的影响；(c)温度对酶解的影响；(d)pH对酶解的影响；(e)时间对酶解的影响。

图3羧肽酶A酶解条件的优化图，其中；(a)酶底比对酶解的影响；(b)温度对酶解的影响；(c)pH对酶解的影响；(d)时间对酶解的影响。

图4酶解前后的多肽分子量分布的对比图

图5酶解前后的游离态支链、芳香族氨基酸的含量的对比图

图6脱芳处理后的多肽分子量分布图

图7脱芳处理后的氨基酸组成分析图

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步解释：

本发明本着选用特异性蛋白酶替换酶切位点广泛的蛋白酶进行定向水解，提高原料的F值及实用价值，同时提供了一种高效且稳定制备高F值寡肽的方法及放大工艺投入于市场的目的，对市售的玉米粗肽做进一步加工处理，探索出一种特定内外切蛋白酶协同定向水解及一步纯化显著提高玉米肽F值的方法，试图解决目前高F值寡肽产品极度缺乏的问题。

酶活力测定：参照GB/T 23527-2009

水解度定义：氨基氮含量(从蛋白质底物切割下来的氨基酸)与总蛋白氮含量的比值。其中，氨基氮含量采用甲醛滴定法测定，总蛋白氮含量采用凯氏定氮法测定。

甲醛滴定法：在GB 5009.235-2016的基础上稍有改良，方法如下：

取3只250mL的烧杯，分别标为A、B、C，其中A为空白组，B为实验组，C为平行组。在A中加入40mL超纯水，在B、C中分别加入10mL水解液、30mL超纯水，然后均置于磁力搅拌器搅拌均匀，均用0.5mol/L的NaOH调节pH到8.2，然后均加入5mL中性甲醛搅拌均匀，pH稳定后，均用0.01mol/L的NaOH滴定直到pH到9.2，记录消耗的0.01mol/LNaOH的体积，计算氨基氮含量。计算公式如下：

式中：

X—总氨基氮含量(g/100mL)

V1—实验组加入甲醛溶液后所消耗的NaOH溶液的平均体积(mL)

V2—空白组加入甲醛溶液后所消耗的NaOH溶液的体积(mL)

10—所取水解液的体积(mL)

n—水解液的稀释倍数

C—NaOH的浓度(mol/L)

0.014—氮的毫摩尔质量(g/mmol)

多肽分布测定：取溶液在12000r/min的转速下离心10min，取上清液，采用HPLC法测定多肽分子量分布。

氨基酸含量测定：

(1)游离氨基酸：取离心后的上清液，加入等体积的10％的TCA溶液，静置3h，在15000rpm的转速下离心30min，取2mL上清液经0.22um的有机相膜再次过滤，然后取400uL上清液于液相样品瓶，采用HPLC法测定游离氨基酸含量。

(2)水解氨基酸：(液体)取水解管，量取1mL样品，加入1mL浓盐酸，再加入6mL6mol/L的HCl，然后充氮气3min，完成后拧紧水解管，放于120℃的烘箱中水解22h。22h后，将水解管中样品全部转移至容量瓶中，加4.8mL10mol/L的NaOH进行中和，然后用蒸馏水定容到25mL，置于振荡器中混匀后经双层滤纸过滤，取1mL滤液于1.5mL离心管中，在15000rpm的转速下离心30min，然后取400uL上清液于液相样品瓶，采用HPLC法测定溶液中的总氨基酸含量；(固体)方法同液体，不同点在于，固体取100.00mg左右，加入8mL6mol/L的HCl。

F值定义：支链氨基酸与芳香族氨基酸的摩尔数之比。计算公式如下：

实施例1内、外切酶的种类对高F值寡肽制备的影响

实施方式同实施例1，其区别在于，换用酶切位点广泛的内、外切酶进行酶解。分别选用碱性蛋白酶Alcalase2.4L和木瓜蛋白酶组合、中性蛋白酶和氨肽酶组合、胃蛋白酶和风胃蛋白酶组合，然后测定酶解液的氨基酸组成，计算酶解液的F值，和实施例1中酶解液的F值作比较。酶解条件和酶解液F值如下表所示：

由表可知，经碱性蛋白酶Alcalase2.4L和木瓜蛋白酶协同水解后，酶解液的F值为3.28；经中性蛋白酶和氨肽酶组合协同水解后，酶解液的F值为2.98；经胃蛋白酶和风胃蛋白酶协同水解后，酶解液的F值为3.52，这三种方案得到的酶解液的F值均低于原料起始F值4.14,，推测可能是这些蛋白酶虽对芳香族氨基酸有识别位点，但因其酶切位点广泛，在水解过程中具有随机性，同时作用于更多的支链氨基酸；而经α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A协同定向水解得到的酶解液的F值为6.22，是原料起始F值的1.5倍，进一步验证了这两种酶的酶切位点专一，同时说明这个内、外切蛋白酶协同组合对于水解玉米粗肽制备高F值寡肽的方案是可行的。

与酶切位点广泛的蛋白酶水解效果的对比，本发明使用的α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A可以高特异性地识别作用位点而进行协同定向水解，从而高效且稳定制备高F值寡肽，为投入临床及市场的工业化生产提供条件。

实施例2底物浓度对α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的影响

取玉米粗肽粉加入超纯水，分别配制成浓度为10g/L、30g/L、50g/L、70g/L、90g/L的玉米粗肽溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，在反应温度40℃，pH为8的条件下，以2.0×10⁴U/g的酶底比(E/S)加入α-胰凝乳蛋白酶，反应2h，水解完成后得到第一步水解液。

以水解度(DH)作为考察α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的指标，水解度越大说明水解越完全。实验结果如图2(a)所示，玉米粗肽粉浓度为10g/L、30g/L、50g/L、70g/L、90g/L时，水解度(DH)分别为4.2％、6.5％、7.9％、7.2％、6％，且玉米粗肽浓度在30–70g/L时，水解度(DH)可达到7.9％以上。由此说明，在2.0×10⁴U/g的酶底比条件下，此浓度范围内的玉米粗肽可以得到充分酶解。

实施例3酶底比对α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的影响

取玉米粗肽粉加入超纯水，分别配制成浓度为50g/L的玉米粗肽溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，在反应温度40℃，pH为8的条件下，分别以5.0×10³U/g、10⁴U/g、1.5×10⁴U/g、2.0×10⁴U/g、2.5×10⁴U/g的酶底比加入α-胰凝乳蛋白酶，反应2h，水解完成后得到第一步水解液。

以水解度(DH)作为考察α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的指标，水解度越大说明水解越完全。实验结果如图2(b)所示，酶底比(E/S)为5.0×10³U/g、10⁴U/g、1.5×10⁴U/g、2.0×10⁴U/g、2.5×10⁴U/g，水解度(DH)分别为4.4％、5.87％、7％、7.87％、8.1％，且α-胰凝乳蛋白酶的酶底比(E/S)在1.5×10⁴～2.5×10⁴U/g U/g时，水解度(DH)可达到7.87％以上。由此说明，在底物浓度为50g/L的条件下，羧肽酶A的用量在此酶底比范围内就可将玉米粗肽充分酶解，从而避免酶用量过度造成的浪费。

实施例4温度对α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的影响

取玉米粗肽粉加入超纯水，分别配制成浓度为50g/L的玉米粗肽溶液，然后置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，在pH为8的条件下，以2.0×10⁴U/g的酶底比加入α-胰凝乳蛋白酶，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的温度下反应2h，水解完成后得到第一步水解液。

以水解度(DH)作为考察α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的指标，水解度越大说明水解越完全。实验结果如图2(c)所示，反应温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，水解度(DH)分别为5.6％、6.6％、7.9％、7.4％、6.6％，且反应温度在35～45℃时，水解度(DH)可达到7.9％以上。由此说明，反应温度在35～45℃时，更有利于α-胰凝乳蛋白酶的酶促反应。

实施例5pH对α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的影响

取玉米粗肽粉加入超纯水，分别配制成浓度为50g/L的玉米粗肽溶液，然后置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，在反应温度为40℃的条件下，以2.0×10⁴U/g的酶底比加入α-胰凝乳蛋白酶，分别在7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的pH下反应2h，水解完成后得到第一步水解液。

以水解度(DH)作为考察α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的指标，水解度越大说明水解越完全。实验结果如图2(d)所示，反应pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，水解度(DH)分别为6.0％、7.2％、7.8％、7.3％、6.4％，且反应pH在7.5～8.5时，水解度(DH)可达到7.8％以上。由此说明，反应pH在7.5～8.5时，更有利于α-胰凝乳蛋白酶的酶促反应。

实施例6反应时间对α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的影响

取玉米粗肽粉加入超纯水，分别配制成浓度为50g/L的玉米粗肽溶液，然后置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，在pH为8、反应温度为40℃的条件下，以2.0×10⁴U/g的酶底比加入α-胰凝乳蛋白酶，分别反应1h、2h、3h、4h、5h，水解完成后得到第一步水解液。

以水解度(DH)作为考察α-胰凝乳蛋白酶酶解效果的指标，水解度越大说明水解越完全。实验结果如图2(e)所示，反应时间为1h、2h、3h、4h、5h，水解度(DH)分别为6.0％、7.6％、8.6％、9.2％、9.4％，且反应时间在3～5h时，水解度(DH)可达到9.2％以上。由此说明，在底物浓度为50g/L且酶底比为2.0×10⁴U/g的条件下，反应3～5h，玉米粗肽可水解完全。

实施例7酶底比对羧肽酶A酶解效果的影响

将第一步水解液仍维持40℃的反应温度，调节pH为7.0，分别以1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL的酶底比加入羧肽酶A，反应1h，水解完成后得到第二步水解液。

以OD₂₂₀/OD₂₈₀作为考察羧肽酶A酶解效果的指标，OD₂₂₀/OD₂₈₀越小说明芳香族氨基酸的释放量越多。实验结果如图3(a)所示，酶底比(E/S)为1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/m，OD₂₂₀/OD₂₈₀分别为6.6、5.9、6.2、6.5、6.7，且羧肽酶A的酶底比(E/S)在1～3U/mL时，OD₂₂₀/OD₂₈₀有最小值，大约在5.9以下。由此说明，在此酶底比范围内，芳香族氨基酸的释放量大于支链氨基酸。

实施例8温度对羧肽酶A酶解效果的影响

将第一步水解液的pH均调节到7.0、温度分别调节到27℃、32℃、37℃、42℃、47℃的条件下，以2U/mL的酶底比加入羧肽酶A，反应1h，水解完成后得到第二步水解液。

以OD₂₂₀/OD₂₈₀作为考察羧肽酶A酶解效果的指标，OD₂₂₀/OD₂₈₀越小说明芳香族氨基酸的释放量越多。实验结果如图3(b)所示，反应温度分别为27℃、32℃、37℃、42℃、47℃，OD₂₂₀/OD₂₈₀分别为6.3、6.0、5.6、5.8、6.0，且反应温度在32～42℃时，OD₂₂₀/OD₂₈₀有最小值，大约在5.6以下。说明反应温度在32～42℃时，更有利于羧肽酶A的酶促反应，从而将芳香族氨基酸充分释放出来。

实施例9pH对羧肽酶A酶解效果的影响

将第一步水解液的温度调节到37℃，pH分别调节到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,的条件下，以2U/mL的酶底比加入羧肽酶A，反应1h，水解完成后得到第二步水解液。

以OD₂₂₀/OD₂₈₀作为考察羧肽酶A酶解效果的指标，OD₂₂₀/OD₂₈₀越小说明芳香族氨基酸的释放量越多。实验结果如图3(c)所示，反应pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，OD₂₂₀/OD₂₈₀分别为6.0、5.8、5.5、5.6、5.8，且反应pH在6.5～7.5时，OD₂₂₀/OD₂₈₀有最小值，大约在5.5以下。说明反应温度pH在6.5～7.5时，更有利于羧肽酶A的酶促反应，从而将芳香族氨基酸充分释放出来。

实施例10反应时间对羧肽酶A酶解效果的影响

将第一步水解液的温度调节到37℃，pH调节到7.0的条件下，以2U/mL的酶底比加入羧肽酶A，分别反应0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，水解完成后得到第二步水解液。

以OD₂₂₀/OD₂₈₀作为考察羧肽酶A酶解效果的指标，OD₂₂₀/OD₂₈₀越小说明芳香族氨基酸的释放量越多。实验结果如图3(d)所示，反应时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，OD₂₂₀/OD₂₈₀分别为6.2、5.6、5.2、4.9、5.2，且反应时间在1.5～2.5h时，OD₂₂₀/OD₂₈₀有最小值，大约在5.2以下。说明在酶底比为2U/mL的条件下，反应1.5～2.5h，羧肽酶A充分发挥作用，从而将芳香族氨基酸充分释放出来。

实施例11高F值寡肽的制备方法

(1)第一步水解：取玉米肽粉2.5g，加入超纯水50mL配制成50g/L的玉米肽溶液，置于恒温磁力搅拌器上搅拌均匀，调节到最适反应温度和pH，加入α-胰凝乳蛋白酶进行第一步水解，水解完成后得到第一步水解液。

其中，反应条件：底物浓度为5％、反应温度为40℃、反应pH为8、酶底比(E/S)为2.0×10⁴U/g、反应时间为4h。

(2)第二步水解：取第一步水解液置于恒温磁力搅拌器上，调节到最适反应温度和pH下，加入羧肽酶A进行第二步水解。水解完成后置于水浴中灭酶10min，得到第二步水解液。

其中，反应条件：反应温度为37℃、反应pH为7、酶底比(E/S)为2U/mL、反应时间为2h。

(3)离心过滤：第二步水解液冷却一段时间后，取其置于冷冻离心机中进行离心过滤。在25℃、转速为10000rpm的条件下，离心10min，得到澄清透明的酶解液。

(4)活性炭脱芳：取离心过滤后的酶解液，用HCl调节pH为2.5，按1:10的炭液比加入粉末活性炭，在25℃的摇床上吸附2h。吸附完成后，置于4℃、转速为10000rpm的冷冻离心机中离心15min，然后经滤纸过滤。

(5)冷冻干燥：将脱芳后液体经冷冻干燥机进行冷冻干燥，时间为48h，目的是除去溶液中的挥发性酸。

采用HPLC法对脱芳后的冻干粉进行氨基酸组成分析，根据F值的公式计算，得出冻干粉的F值为41.17，此F值与原料的起始F值相比，提高了10倍；在寡肽和游离氨基酸的混合物中，游离氨基酸含量占4％；在游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量占3.6％，支链氨基酸含量占35％。这些数据说明：脱芳处理后的冻干粉的F值及游离氨基酸所占比例均符合高F值寡肽的要求，且游离态的芳香族氨基酸基本被吸附脱掉，达到预期的实验目的。

采用HPLC法对脱芳后冻干粉进行多肽分子量分布分析，分子量主要集中于1000Da以下，占总含量的99.82％。其中，分子量为180～1000Da的寡肽占总含量的56.42％，此分子量范围的寡肽主要由3～6个氨基酸残基组成，符合高F值寡肽的分子量要求；分子量小于180Da的占42.86％，结合氨基酸含量分析可知：此分子量范围的可能是二肽或游离态氨基酸，且二肽为主要部分，约占38％，其余4％的游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量甚少，支链氨基酸和其他氨基酸为主要成分。另外，冻干粉的分子量分布与原料的分子量分布相比，相差不多，进一步突出α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的特异性和高效性。

该实施例选用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A协同定向水解及一步纯化，在稍微改变原料多肽分子量分布的同时，F值提高了10倍，满足高F值寡肽的F值和分子量的要求，且多次验证实验具有稳定的重复性，达到预期效果：提高原料F值的同时，也提供了一种高效且稳定制备高F值寡肽的方法，帮助解决目前高F值寡肽产品极度缺乏的问题。

实施例12高F值寡肽的制备方法

实施方式同实施例1，其区别在于，活性炭脱芳处理中的碳液比为1:15。采用HPLC法对脱芳后的冻干粉进行氨基酸组成分析，得出冻干粉的F值为30.67，此F值与原料的起始F值相比，提高了7.5倍；在寡肽和游离氨基酸的混合物中，游离氨基酸占4.6％；在游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量占6％，支链氨基酸含量的31％。这些数据说明：脱芳处理后的冻干粉的F值及游离氨基酸所占比例均符合高F值寡肽的要求，且游离态的芳香族氨基酸基本被吸附脱掉，达到预期的实验目的。

采用HPLC法对脱芳后的冻干粉进行多肽分子量分布分析，分子量主要集中于1000Da以下，占总含量的97.47％。其中，分子量为180～1000Da的寡肽占总含量的65.9％，此分子量范围的寡肽主要为3～6个氨基酸残基组成，符合高F值寡肽的分子量要求；分子量小于180Da的占31.54％，结合氨基酸含量分析可知：此分子量范围的可能是二肽或游离态氨基酸，且二肽为主要部分，约占27％，其余4.6％的游离态氨基酸中，芳香族氨基酸含量甚少，支链氨基酸和其他氨基酸为主要成分。另外，此分子量分布与原料的分子量分布相比，相差不多，进一步突出α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的特异性和高效性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种高效且稳定制备高F值玉米寡肽的方法，其特征在于，所述方法为采用特定内、外切蛋白酶定向协同水解法水解玉米粗肽得到酶解液，然后采用活性炭静态吸附法对酶解液进行脱芳高F值化处理，经干燥后得到高F值寡肽。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述内切酶为α-胰凝乳蛋白酶，所述外切酶为羧肽酶A。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中的玉米粗肽的起始F值为2.6～4.2，玉米粗肽溶液的浓度为10～90g/L。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中α-胰凝乳蛋白酶的添加量为酶底比5×10³～2.5×10⁴U/g。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中的羧肽酶A的添加量为酶底比为1～5U/mL。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中的灭酶为90℃水浴中灭酶10～15min。

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中的活性炭的添加量为活性炭质量与酶解液体积比值1:10～1:50，所述活性炭为粉末状、100目颗粒、200目颗粒、10目杏壳、20目杏壳、柱状。

9.应用权利要3-8任一所述方法制备得到的高F值玉米寡肽。

10.权利要求3-8任一所述方法在制备高F值玉米寡肽方面的应用。