CN108642033A - 一种温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法 - Google Patents

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张蕾
郭小芳
唐娜
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明公开了一种温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法，包括：(1)将酶蛋白溶解于Tris‑HCl缓冲溶液，(2)加入无机铁盐或无机亚铁盐或有机铁盐或有机亚铁盐铁前驱体，(3)在溶液中加入多巴胺或多巴仿生粘合剂，(4)混合液常温搅拌，在超导磁场作用下分离收集强磁性铁酶复合物。本发明优点在于：在无磁场作用下，弱磁性铁酶复合物不表现磁性，可在游离状态发挥其生物活性，消除传统固定化酶的空间位阻效应；在强磁场作用下，弱磁性铁酶复合物在强磁场下表现较明显的可磁化性，可实现在超导磁场中有效分离回收；制备方法简单绿色，弱磁核稳定性高，无团聚现象具有活性的酶蛋白可占固体化酶质量的90％。

Description

一种温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法
技术领域
本发明涉及温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法，属于蛋白固定化技术领域。
背景技术
由于生物催化剂的高效性和高选择性，它在化学工业上的应用已经具有越来越大的吸引力。它们反应条件温和、能耗低、易催化得到相对较纯的产品，可减少废物排放且可以完成传统化学催化所不能胜任的任务。其中酶催化具有选择性高、专一性强、反应单一、可控性强、产品易纯化等特点。由于重复使用、降低成本及增强酶稳定性的需求，固定化技术不断发展，主要包括物理吸附法、共价结合法、包埋法和交联法。上述所述的前三种固定化方法，由于有载体的存在其单位载体荷酶量较低，在浪费反应空间及能量。交联法存在酶活收率低的问题。
为了解决固定化酶的快速分离问题，科研工作者早已关注磁性材料，它具有比表面积大、不易破碎等诸多优势，通过磁场实现微纳米吸附材料与水快速分离停留时间短，成本可控，集约化程度高等优势。CN102250869报道一种用于生产植物幽醇醋的磁性固定化酶的制备方法；CN104560940A公布了一种磁性固定化酶的制备方法，将酶蛋白固定于聚乙烯毗咯烷酮一乙烯基三甲氧基硅烷表面；CN104844768A公开了一种核壳结构的温敏性磁性蛋白质印迹微球的制备方法；以上方法均属于先制得磁性颗粒，再将酶蛋白采用吸附或共价结合法固定于磁性微球表面，存在催化过程中酶活性位点被载体掩蔽(空间位阻效应)导致的表观酶活显著降低的问题。
发明内容
本发明的目的是在于提供了温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法。纳米级弱磁性铁核在酶蛋白中原位生成，与酶蛋白分子间以共价键结合，弱磁性铁核在无磁场作用下不表现出磁性，磁力随磁场强度增加而逐渐增大，在强磁场下表现较明显的可磁化性。酶保持其催化活性并可在超导磁场作用下实现分离和收集。
本发明通过以下技术方案予以实现：
(1)将酶蛋白溶解于0.02～0.2M pH6.0～pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酶蛋白的浓度在0.1～10.0g/L。
(2)加入铁前驱体，使其终浓度为0.002～0.02M，铁前驱体包括无机铁盐、无机亚铁盐、有机铁盐和有机亚铁盐。
(3)在上述溶液中加入仿生粘合剂，仿生粘合剂指可在水溶液中发生自聚合的物质，包括但不局限于多巴胺、多巴，浓度范围为0.1～0.5g/L。
(4)将上述混合液常温搅拌0.5h～10h，在超导磁场作用下分离收集弱磁性铁酶复合物
本发明提出的制备方法的优点在于：在无磁场作用下，弱磁性铁酶复合物不表现磁性，可在游离状态发挥其生物活性，消除传统固定化酶的空间位阻效应；在强磁场作用下，弱磁性铁酶复合物在强磁场下表现较明显的可磁化性，可实现在超导磁场中有效分离回收；弱磁核为原位生成，稳定性高，无团聚现象，不易发生氧化反应而消磁；单位磁性负载率高，优化条件下，具有活性的酶蛋白可占固体化酶质量的90％以上，制备方法简单，在水相、室温、常压下制备，无有机溶剂参与，制备条件绿色温和。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
实施例1：
(1)将酶蛋白溶解于0.02M pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酶蛋白的浓度在0.1g/L。
(2)加入FeSO4至(1)中，使其终浓度为0.02M。
(3)再溶液中加入多巴胺，使其终浓度为0.5g/L。
(4)将上述混合液常温搅拌0.5h，在超导强磁场作用下分离收集强磁性铁酶复合物。
以上铁酶复合物的中酶蛋白占90％，其磁性为0.10emu/g，可在超导强磁场作用下收集。
实施例2：
(1)将酶蛋白溶解于0.2M pH6.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酶蛋白的浓度在10g/L。
(2)加入二茂铁至(1)中，使其终浓度为0.002M。
(3)再溶液中加入多巴胺，使其终浓度为0.1g/L。
(4)将上述混合液常温搅拌10h，在超导强磁场作用下分离收集强磁性铁酶复合物。
以上铁酶复合物的中酶蛋白占98％，其磁性为0.02emu/g，可在超导强磁场作用下收集。
实施例3：
(1)将酶蛋白溶解于0.1M pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酶蛋白的浓度在2g/L。
(2)加入FeCl3至(1)中，使其终浓度为0.01M。
(3)再溶液中加入多巴胺，使其终浓度为0.3g/L。
(4)将上述混合液常温搅拌2h，在超导强磁场作用下分离收集强磁性铁酶复合物。
以上铁酶复合物的中酶蛋白占98％，其磁性为0.02emu/g，可在超导强磁场作用下收集。

Claims (1)

1.一种温和条件下制备弱磁性铁酶复合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将酶蛋白溶解于0.02～0.2M pH6.0～pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酶蛋白的浓度在0.1～10.0g/L。
(2)加入铁前驱体，使其终浓度为0.002～0.02M，铁前驱体包括无机铁盐、无机亚铁盐、有机铁盐和有机亚铁盐。
(3)在上述溶液中加入仿生粘合剂，仿生粘合剂指可在水溶液中发生自聚合的物质，包括但不局限于多巴胺、多巴，浓度范围为0.1～0.5g/L。
(4)将上述混合液常温搅拌0.5h～10h，在超导磁场作用下分离收集弱磁性铁酶复合物。
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