CN103146672B

CN103146672B - 一种在固体发酵中进行固定化em菌的方法

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Publication number: CN103146672B
Application number: CN201310032822.3A
Authority: CN
Inventors: 周宇; 朱佳杰; 甘西; 唐瞻杨; 谭芸
Original assignee: GUANGXI INSTITUTE OF FISHERIES
Current assignee: GUANGXI INSTITUTE OF FISHERIES
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103146672A

Abstract

本发明公开了一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，方法经1)载体的制备、2)发酵料配制、3)发酵制备EM菌剂、4)固定化的固体EM菌剂的制备四步骤制得固定化的EM菌。本发明和现有技术相比的有益效果是：1.本发明缩短了操作时间，提高了工作效率，节省了生产成本，比现有技术中只靠单一的吸附固定效果更好，解决了现有技术的吸附固定化细菌容易脱落问题。2.本发明通过载体的吸附和培养剂的粘附相结合制成的固定化EM菌制剂，使细菌能牢固地固定在载体纤维上，在水体中能够形成局部的种群优势，因此，对水质的作用时间长，效果明显。

Description

一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法

技术领域

本发明涉及细菌的固体发酵以及固定化微生物技术中的物理吸附法。具体的说是一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法。

背景技术

固定化微生物技术是用化学的或者物理的手段和方法将游离微生物限制或定位在某一特定空间范围内,保留其固有的催化活性,且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术。由于固定化微生物技术能够大大提高细菌对水质的净化效果，因而广泛用于污水处理、景观水体净化和水产养殖水质调节等方面。

目前，固定化微生物的制备方法很多，一般分为物理固定法（主要有包埋法、吸附法和包络法）和化学固定法（主要有共价结合法和交联法）两大类，其中吸附法和包埋法是比较常用的微生物固定化方法，吸附法又分为物理吸附和离子吸附两种。

物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、木屑、卵石、铅炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，通过将吸附载体浸泡在液体微生物制剂中，微生物被吸附到载体的毛细孔来达到固定化。现有的物理吸附法，工艺比较繁琐，也比较耗时，载体必须经过菌剂的浸泡、干燥、再浸泡的多次重复操作才能达到理想的吸附效果。

虽然可用作吸附剂载体的材料很多，但目前常用的吸附剂都存在某些不足，如碎石、木屑、卵石、铅炭、硅藻土、多孔砖等载体，虽然资源广，来源容易，价格也低廉，但吸附效果不理想。而硅胶、活性炭、多孔玻璃等载体材料，虽然吸附效果较好，但不容易加工制作，价格也较高，难以大规模使用。因此，研究更高效，更经济环保，工艺简单，省时省力的微生物固定化方法以及寻找更好的载体材料，仍然是这一领域的重点。

针对目前微生物固定技术存在的问题，人们对固定化的工艺以及载体的固定效果等做了很多改进。人们尝试通过将一些载体浸泡在液体发酵剂中，进行简单的液体发酵将细菌固定化，但由于发酵难以进行搅拌，细菌的发酵效果并不好，而且培养出来的细菌大部分都分散在培养剂中，难以被载体吸附，因此固定化效果不太理想。马放等，同时培养法与吸附法微生物固定化对比[J]《哈尔滨工业大学学报》2012年04期，为一种适用于菌丝球生物质载体高效、快捷的微生物固定化方法,分别采用同时培养法和吸附法将高效苯胺降解细菌JH-9固定于黑曲霉菌Y3形成的生物质载体菌丝球上。马海荣等，XM固态菌剂载体选择的初步研究[J]《哈尔滨工业大学学报》2005年02期，采用实验所选择的最适条件,将通过网孔尺寸为0.420mm分样筛的麦麸、麦壳、锯末、活性炭和砖粉按一定比例混合,将含水量控制在50％(质量分数)左右,在30℃进行发酵和固定化制成固态菌剂,每克含菌量可达到4×10^8～5×10^8。但其仍然是一种固体发酵工艺，固定化效果也不太理想。可见，现有的微生物固定方法虽然多种多样，但都存在一定的不足，不管在工艺上还是在载体材料上都必须进行改进。

EM菌是一种由光合细菌、乳酸杆菌、酵母菌和放线菌四大菌群组成的有益复合细菌。迄今为止，EM菌已被日本、美国、巴西、法国、台湾等90多个国家和地区认可和使用。我国1992年从日本引进EM菌，目前已被广泛用于水产养殖水质调节、养殖病害防治和污水净化等领域。EM菌产品一般为水剂和粉剂，由于水剂和粉状菌剂的细菌在水中容易变成游离状态，难以形成优势种群，细菌存活时间短，因而大大降低其作用效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法。EM菌在固体发酵过程中通过载体的吸附以及在菌剂制作过程中通过培养剂的粘附双重作用固定在载体上,使得固定化EM菌剂的制作能够在一个工艺流程中完成。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，包括以下步骤：

1)载体的制备

选取油质少，木质松软的木屑，木屑经60℃以下低温烘干或者进行晒干后，用网孔尺寸为0.425mm的粉碎机进行粉碎2次，使木屑变成纤维木粉，用作EM菌固定化的载体；

2)发酵料配制

2.1)培养剂的配制：以甘蔗糖蜜作为发酵配方的碳源和粘稠剂，配制成培养剂，培养剂的重量百分数配方为：甘蔗糖蜜20～30％、腐植酸4～6％、NH₄CI8～12％、KH₂PO₄1～3％、复合酶0.7％、微量元素0.3％、自来水48％～66％；其中，复合酶使用普通的兽用复合酶，微量元素根据常规配方自行配制；配制时，首先放入水，然后慢慢加入甘蔗糖蜜，搅拌均匀后，再一一加入其他原料，配制的培养剂具有一定的粘稠性；

2.2)发酵料配制：将步骤2.1)的培养剂与含活菌数为10～40亿个/g的液体EM菌种或者含活菌数为10～40亿个/g的固体EM菌种按重量百分数10％的接种量进行接种；如果是液体菌种，在配制培养剂时自来水的加入量要比配方的量少重量百分数10％，如果是固体菌种，先加入一定重量的自来水，自来水的重量按照培养剂配方的固体与水分比例，根据接种的固体菌种重量来算出，然后将菌种放入培养剂中并搅拌均匀。

然后再与木粉载体进行混合制成固体发酵料，发酵料的pH值为7.5；

3)发酵制备EM菌剂

将上步骤的发酵料装入发酵容器，适当封盖后，在20℃-40℃的温度下进行发酵20～50天，发酵完成，制得EM菌剂；

4)固定化的固体EM菌剂的制备

将上步骤发酵好的EM菌剂在50℃的低温下烘干，在烘干过程中，具有粘稠性的培养剂将EM菌粘附固定在载体上，制作成固定化的固体EM菌剂。

上述步骤1)中油质少，木质松软的木屑中的木材种类为油质较少且松软的杉木、杨木和柳木，要求木屑新鲜干净，不发黑。

上述步骤1)中粉碎机为木屑粉碎机。

上述步骤2)中甘蔗糖蜜为糖厂制糖的副产品，饲料级，含水分的重量百分数为35％。

上述步骤2)中配制发酵料时，水分的含量通过用手紧摄发酵料，有液体从指缝渗出但不下滴为准。

上述步骤3)中发酵容器的容积必须在20L以上，可以是发酵桶、发酵罐和水泥池。

上述步骤3)中在发酵过程中载体将培养出来的EM菌吸附在载体纤维孔隙中，发酵好的EM菌菌剂可以闻到酒精的芳香气味。

本发明和现有技术相比的有益效果是：

1.本发明EM菌的固定化是在固体发酵过程中完成，解决了目前固定化技术先发酵然后再固定化分两步进行的繁琐工艺，缩短了操作时间，提高了工作效率，节省了生产成本，比现有技术中只靠单一的吸附固定效果更好，解决了现有技术的吸附固定化细菌容易脱落问题。

2.本发明在菌剂干燥中又通过粘附作用进行固定化，因此效果明显，制成的菌剂是一种优质的固定化EM菌产品。

3.固定化载体由木屑经过微细粉碎制成，其具有效果好，来源广，价格低廉，对细菌无副作用等特点。

4.本发明通过载体的吸附和培养剂的粘附相结合制成的固定化EM菌制剂，使细菌能牢固地固定在载体纤维上，在水体中能够形成局部的种群优势，因此，对水质的作用时间长，效果明显。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

最优的实施例。在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，操作步骤如下：

1.选取新鲜、干净的杉木木屑，经60℃以下低温烘干后，选用巩义市张升机器有限公司生产的500型号带筛木粉机，选用网孔尺寸为0.425mm的筛片粉碎2次，使木屑变成絮状纤维木粉。

2.配制培养剂的重量百分数配方为：甘蔗糖蜜25％、腐植酸5％、NH₄CI10％、KH₂PO₄2％、复合酶0.7％、微量元素0.3％、自来水57％。配制时，首先放入水，然后慢慢加入甘蔗糖蜜，搅拌均匀后，再一一加入其他原料，配制好的培养剂具有一定的粘稠性。接入活菌数为30亿个/g的固体EM菌种，接种量重量百分数为10％，先加入菌种重量4.05倍的自来水，然后将菌种放入培养剂中并搅拌均匀。将步骤1制备的载体和接种好的培养剂进行混合并充分搅拌均匀制成发酵料，发酵料的湿度以用手紧摄发酵料，有液体从指缝渗出但液体不下滴为准。

步骤3.将步骤2制好的发酵料装入容积为1立方米发酵罐中，装料时，放入高度20公分的发酵料后，摊平压实，再放入20公分再摊平压实，直到装满，然后进行封闭发酵，封闭时留出小孔隙以便排出气体。发酵的环境温度保持30℃，初始发酵PH值7.5，发酵过程不需要翻动发酵料也不需要添加营养液。发酵30天，打开封盖，可以闻到很浓的带有酸甜气味的酒精芳香气味，取中间发酵料，可见发酵料已由原来淡黄色变为深黄色，取少量发酵料，加入少量超纯水并高速振荡，取上层液体放到显微镜下观察，可见到大量的细菌时发酵完成。

4.发酵好的EM菌剂在50℃的低温下烘干，由于培养剂在发酵完成后还具有一定的粘稠性，载体表面的EM菌就被牢固地粘附在纤维上，变成固定化的固体菌剂。通过载体的吸附和发酵剂的粘附双重固定化的EM菌剂，其活菌数达到120亿个/g，成为一种优质的固定化EM菌制剂产品。

实施例2

在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，操作步骤如下：

1.选取新鲜、干净的杨木木屑，经晒干后，选用巩义市张升机器有限公司生产的500型号带筛木粉机，选用网孔尺寸为0.425mm的筛片粉碎2次，使木屑变成絮状纤维木粉。

2.配制培养剂的重量百分数配方为：甘蔗糖蜜20％、腐植酸4％、NH₄CI8％、KH₂PO₄1％、复合酶0.7％、微量元素0.3％、自来水66％。配制时，首先放入水，然后慢慢加入甘蔗糖蜜，搅拌均匀后，再一一加入其他原料，配制好的培养剂具有一定的粘稠性。接入活菌数为50亿个/g的固体EM菌种，接种量重量百分数为10％，先加入菌种重量5.62倍的自来水，然后将菌种放入培养剂中并搅拌均匀。将步骤1制备的载体和接种好的培养剂进行混合并充分搅拌均匀制成发酵料，发酵料的湿度以用手紧摄发酵料，有液体从指缝渗出但液体不下滴为准。

3.将步骤2制好的发酵料装入容积为20L发酵桶中，装料时，放入高度20公分的发酵料后，摊平压实，再放入20公分再摊平压实，直到装满，然后进行封闭发酵，封闭时留出小孔隙以便排出气体。发酵的环境温度保持40℃，初始发酵PH值7.5，发酵过程不需要翻动发酵料也不需要添加营养液。发酵20天，打开封盖，可以闻到很浓的带有酸甜气味的酒精芳香气味，取中间发酵料，可见发酵料已由原来淡黄色变为深黄色，取少量发酵料，加入少量超纯水并高速振荡，取上层液体放到显微镜下观察，可见到大量的细菌时发酵完成。

4.发酵好的EM菌剂在50℃的低温下烘干干燥，由于培养剂在发酵完成后还具有一定的粘稠性，载体表面的EM菌就被牢固地粘附在纤维上，变成固定化的固体菌剂。通过载体的吸附和发酵剂的粘附双重固定化的EM菌剂，其活菌数达到50亿个/g，成为一种优质的固定化EM菌制剂产品。

实施例3

在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，操作步骤如下：

1.选取新鲜、干净的柳木木屑，经60℃以下低温烘干后，选用巩义市张升机器有限公司生产的500型号带筛木粉机，选用网孔尺寸为0.425mm的筛片粉碎2次，使木屑变成絮状纤维木粉。

2.配制培养剂的重量百分数配方为：甘蔗糖蜜30％、腐植酸6％、NH₄CI12％、KH₂PO₄3％、复合酶0.7％、微量元素0.3％、自来水38％。配制时，首先放入水，然后慢慢加入甘蔗糖蜜，搅拌均匀后，再一一加入其他原料，配制好的培养剂具有一定的粘稠性。接入活菌数为10亿个/g的液体EM菌种，接种量重量百分数为10％，由于是液体菌种，所以前面配制培养剂时自来水的加入量要比配方的量少重量百分数10％，将菌种放入培养剂中并搅拌均匀。将步骤1制备的载体和接种好的培养剂进行混合并充分搅拌均匀制成发酵料，发酵料的湿度以用手紧摄发酵料，有液体从指缝渗出但液体不下滴为准。

3.将步骤2制好的发酵料装入容积为10立方米水泥池中，装料时，放入高度20公分的发酵料后，摊平压实，再放入20公分再摊平压实，直到装满，然后进行封闭发酵，封闭时留出小孔隙以便排出气体。发酵的环境温度保持20℃，初始发酵PH值7.5，发酵过程不需要翻动发酵料也不需要添加营养液。发酵50天，打开封盖，可以闻到很浓的带有酸甜气味的酒精芳香气味，取中间发酵料，可见发酵料已由原来淡黄色变为深黄色，取少量发酵料，加入少量超纯水并高速振荡，取上层液体放到显微镜下观察，可见到大量的细菌时发酵完成。

4.发酵好的EM菌剂经过50℃的低温烘干干燥，由于培养剂在发酵完成后还具有一定的粘稠性，载体表面的EM菌就被牢固地粘附在纤维上，变成固定化的固体菌剂。通过载体的吸附和发酵剂的粘附双重固定化的EM菌剂，其活菌数达到80亿个/g，成为一种优质的固定化EM菌制剂产品。

Claims

1.一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)载体的制备

2)发酵料配制

2.1)培养剂的配制：以甘蔗糖蜜作为发酵配方的碳源和粘稠剂，配制成培养剂，培养剂的重量百分数配方为：甘蔗糖蜜20～30％、腐植酸4～6％、NH₄Cl8～12％、KH₂PO₄1～3％、复合酶0.7％、微量元素0.3％、自来水48％～66％；其中：复合酶使用普通的兽用复合酶，微量元素根据常规配方自行配制；配制时，首先放入水，然后慢慢加入甘蔗糖蜜，搅拌均匀后，再一一加入其他原料，配制的培养剂具有一定的粘稠性；

2.2)发酵料配制：将步骤2.1)的培养剂与含活菌数为10～40亿个/g的液体EM菌种或者含活菌数为10～40亿个/g的固体EM菌种按重量百分数10％的接种量进行接种；如果是液体菌种，在配制培养剂时自来水的加入量要比配方的量少重量百分数10％，如果是固体菌种，先加入一定重量的自来水，自来水的重量按照培养剂配方的固体与水分比例，根据接种的固体菌种重量来算出，然后再与木粉载体进行混合制成固体发酵料，发酵料的pH值为7.5；

3)发酵制备EM菌剂

4)固定化的固体EM菌剂的制备

2.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤1)中油质少，木质松软的木屑中的木材种类为油质较少且松软的杉木、杨木或柳木。

3.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤1)中粉碎机为木屑粉碎机。

4.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中甘蔗糖蜜为糖厂制糖的副产品，饲料级，含水分的重量百分数为35％。

5.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤2)中配制发酵料时，水分的含量通过用手抓紧发酵料，有液体从指缝渗出但不下滴为准。

6.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中发酵容器的容积在20L以上，是发酵桶、发酵罐或水泥池。

7.根据权利要求1所述的一种在固体发酵中进行固定化EM菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中在发酵过程中载体将培养出来的EM菌吸附在载体纤维孔隙中，发酵好的EM菌菌剂可以闻到酒精的芳香气味。