CN108641968B - 一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用 - Google Patents

一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种空间紫红曲霉FuH‑23‑4筛选及其在生产红曲色素中的应用。本发明保护的紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH‑23‑4，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15380。本发明利用天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的紫红曲霉，以地面原始的紫红曲霉作为对照，选育出产红曲色素能力较高的空间紫红曲霉菌株，为空间红曲色素在食品着色剂中的应用提供实践依据，拓宽了空间微生物研究的范围，填补了食品空间微生物研究的空白。

Description

一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的 应用
技术领域
本发明涉及一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用。
背景技术
红曲色素是由紫红曲霉(Monascus purpureus)在生长代谢过程中由菌丝分泌的多种天然色素的混合物。由于红曲色素具有较强的耐光性与耐热性，对酸、碱、氧化剂与还原剂均较稳定，因而在食品着色、防腐、保健和药用等方面具有重要应用价值。自古以来，在我国红曲色素一直被用于食品着色剂，是我国食品法规规定安全性最高的食用色素之一。近年来，不断深入研究发现，紫红曲霉除了产生红曲色素之外，还可以产生多种功能性活性物质。如降血脂物质——莫那可林K(MonacolinK)与降血压物质——γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)，以及降血清胆固醇和降血脂作用的多种次级代谢产物。因此，由紫红曲霉产生的红曲色素和多种功能性活性物质，深受消费者亲睐，市场需求日益增加，应用领域不断扩展。
微生物发酵生产功能性物质，首要影响因素就是菌株产目标物质的能力。由于微生物细胞变异快，因此人类利用微生物容易变异的特点实施诱变育种。但高效的诱变育种方法以及从众多的突变菌株中筛选出高产目的产物的菌株，一直是微生物诱变育种工作的难点。空间诱变技术由于受到太空微重力效应、高真空、极端温差、弱磁场和高能粒子(电子、质子、重离子)辐射等诱变作用，可改变突变频率而发生基因突变，将导致其生物性状(如个体形态、菌落特征、生理生化特征、免疫原性等)、发酵生产性能(如生物量、产物量、酶活力、效价、发酵速度等)发生改变，将大大提高筛选效率，缩短获得目的菌株的时间，对降低生产成本意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用。
本发明提供的紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4，于2018年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.15380。
本发明保护紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4在生产红曲色素中的应用。
本发明还保护紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4的发酵产物。
所述发酵产物的制备方法如下：培养紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4，得到发酵产物。
所述发酵产物的制备方法依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子培养基培养紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至发酵培养基进行培养。
所述步骤(a)中，培养条件为28℃、160r/min振荡培养，培养时间为3天。
所述步骤(b)中，接种比例为7％(体积百分比)，培养条件为28℃、160r/min振荡培养，培养时间为7天。
本发明还保护以上任一发酵产物在生产红曲色素中的应用。
本发明还保护一种生产红曲色素的方法，包括如下步骤：培养紫红曲霉(Monascuspurpureus)FuH-23-4。
所述方法中，采用发酵培养基培养紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4。
所述方法依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子培养基培养紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至发酵培养基进行培养。
所述步骤(a)中，培养条件为28℃、160r/min振荡培养，培养时间为3天。
所述步骤(b)中，接种比例为7％(体积百分比)，培养条件为28℃、160r/min振荡培养，培养时间为7天。
本发明还保护一种产品，其活性成分为紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4；所述产品的用途为生产红曲色素。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的发酵产物；所述产品的用途为生产红曲色素。
以上任一所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：粳米粉25-35g/L，葡萄糖15-25g/L，蛋白胨10-20g/L，NaNO3 1-3g/L，MgS04·7H20 0.4-0.6g/L，KH2P041.0-2.0g/L；所述溶剂为水。
所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度具体如下：粳米粉30g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaNO3 2g/L，MgS04·7H20 0.5g/L，KH2P041.5g/L。
以上任一所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：米粉65-75g/L，蛋白胨10-20g/L，NaNO3 1-3g/L，MgS04·7H20 0.4-0.6g/L，KH2P041.0-2.0g/L；所述溶剂为水。
所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度具体如下：米粉70g/L，蛋白胨15g/L，NaNO3 2g/L，MgS04·7H20 0.5g/L，KH2P041.5g/L。
以上任一所述培养基中的溶剂具体可为蒸馏水。
本发明利用天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的紫红曲霉，以地面原始的紫红曲霉作为对照，选育出产红曲色素能力较高的空间紫红曲霉菌株，为空间红曲色素在食品着色剂中的应用提供实践依据。目前国内外学者对空间微生物的研究停留在对空间病原菌、腐蚀菌和制药方面的应用，因此，本发明拓宽了空间微生物研究的范围，填补了食品空间微生物研究的空白。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
地面紫红曲霉(Monascuspurpureus)GT23：中国工业微生物保藏中心，编号40268，简称为地面紫红曲霉GT23。
YEPD培养基：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂17g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0。
种子培养基：粳米粉(购买自宁波市江北五桥粮油有限公司)30g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，NaNO3 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1.5g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
发酵培养基：米粉70g，蛋白胨15g，NaNO3 2g，MgS04·7H20 0.5g，KH2P04 1.5g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
实施例1、空间紫红曲霉的筛选
一、菌株的太空诱变
将地面紫红曲霉GT23经天宫2号和神舟11号飞船搭载返回，得到若干株空间诱变菌株。
二、菌株的活化
取冻存于-80℃超低温冰箱内的空间诱变菌株和地面紫红曲霉GT23甘油管保藏菌种，以接种环蘸取少量菌液划线接种于YEPD培养基试管斜面，28℃培养4天，连续活化3代后用于后续试验。
三、菌株的扩大培养
取步骤二活化3代的空间诱变菌株和地面紫红曲霉GT23接种于YEPD培养基三角瓶斜面，于28℃培养4天。
四、菌株的分离纯化
完成步骤三后，取在YEPD培养基三角瓶斜面生长良好的空间诱变菌株和地面紫红曲霉GT23，用50mL无菌生理盐水冲洗表面孢子，以无菌均质器按8次/sec，拍打1min，使孢子与菌丝体充分分离，以三层无菌纱布过滤后，得到纯孢子悬浮液。取孢子悬浮液1mL，以9mL无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取10-2孢子稀释液，以涂布方法接种于YEPD培养基平板，于28℃培养4天。观察空间诱变菌株和地面紫红曲霉GT23的菌落性形态，挑取菌落特征与地面菌株相比差异大的空间诱变菌株单菌落，纯化培养于YEPD培养基试管斜面，于28℃培养4天，得到编号为23-1至23-21的菌株。
五、菌株的复筛
待测菌株：编号为23-1至23-21的菌株、地面紫红曲霉GT23。
1、取待测菌株，接种于种子培养基中，28℃、160r/min振荡培养3天后，以无菌均质按8次/sec，拍打1min，拍散菌丝球，按7％(体积百分比)的接种量移入发酵培养基中，28℃、160r/min振荡培养7天，得到菌株发酵液。
2、取步骤1得到的菌株发酵液5mL，以5000r/min离心15min后，取上清液1mL，加入8mL 70％(体积百分数)乙醇水溶液中混匀，于60℃恒温水浴1h后，冷却至室温，得到待测溶液。
3、以70％(体积百分数)乙醇水溶液作空白对照调0，用紫外分光光度计(UNIC公司，型号：UV-2100)测定步骤2得到的待测溶液在505nm下的吸光度值，检测待测发酵液的红曲霉色价，结果如表1所示。
红曲霉色价(U/mL)＝A×B×100
A——待测发酵液在505nm下的吸光度值；
B——稀释倍数。
表1分离纯化后的红曲霉菌株色价检测结果
Figure BDA0001671821790000041
Figure BDA0001671821790000051
由表1的结果表明，与地面原始的紫红曲霉GT23所产红曲色素的产量相比较，23-4、23-13、23-16、23-20菌株产红曲色素能力较高，其次是23-1、23-8、23-9、23-11、23-15、23-21。其中，23-4产红曲色素的能力最高，其色价为584.10U/mL，比地面原始菌株GT23产红曲色素能力提高了3.71倍。
六、23-4菌株的形态学鉴定与分子生物学鉴定
1、23-4菌株的菌落特征：菌落中心与培养皿分离，突起，不裂开，有致密气生菌丝和细密辐射状折皱，背面培养基中有点状红色素分泌。
2、检测23-4菌株的18S rDNA，测序结果如序列表1的序列所示。18s rDNA鉴定结果显示23-4菌株与紫红曲霉(Monascus purpureus)的相似性达到100％。经过形态学及18SrDNA鉴定，可以确定23-4菌株属于紫红曲霉。
七、23-4菌株的保藏
将23-4菌株命名为紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4，于2018年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNO.15380。紫红曲霉(Monascus purpureus)FuH-23-4简称为空间紫红曲霉23-4。
八、遗传稳定性
将空间紫红曲霉23-4传代培养，进行遗传稳定性实验，通过测定每一代发酵液的红曲霉色价，判断遗传稳定性，结果如表2所示。
表2 23-4菌株10代红曲霉色价检测结果
Figure BDA0001671821790000052
Figure BDA0001671821790000061
由表2可见，空间紫红曲霉23-4传10代以后，其色阶仍然处于较高水平，可以基本判断空间紫红曲霉23-4在色阶方面具有遗传稳定性。
序列表
<110> 富乐顿生物工程科技（北京）有限公司
<120> 一种空间紫红曲霉FuH-23-4筛选及其在生产红曲色素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> 紫红曲霉(Monascus purpureus)
<400> 1
cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattacc gagtgcgggt ccccttcgtg ggacccaacc 60
tcccacccgt gattattgta cctcctgttg cttcggcgcg gccccctggg gcccgccgga 120
gacatcttct cgaacgctgr ctttgaaaag gattgctgtc tgagtaaaca taccaaatcg 180
gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 240
cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 300
ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat tactgcccct caagcgcggc 360
ttgtgtgttg ggccgccgtc ccctgcgcct ccgggcaacg gggacgggcc cgaaaggcag 420
tggcggcgcc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc agtaggtcgg 480
gccggggcct ttgccctctc caaccttttt ttccttaggt tgacctcgga tcagggatac 540
ccgcaactta agcatatcaa taagcg 566

Claims (6)

1.紫红曲霉（Monascus purpureus）FuH-23-4，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15380。
2.权利要求1所述紫红曲霉（Monascus purpureus）FuH-23-4在生产红曲色素中的应用。
3.一种生产红曲色素的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述紫红曲霉（Monascuspurpureus）FuH-23-4。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中采用发酵培养基培养所述紫红曲霉（Monascus purpureus）FuH-23-4；
所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述发酵培养基中的浓度如下：米粉65-75g/L，蛋白胨10-20 g/L，NaNO3 1-3 g/L，MgS04·7H20 0.4-0.6 g/L，KH2P041.0-2.0 g/L；所述溶剂为水。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法依次包括如下步骤（a）和步骤（b）：
步骤（a）：采用种子培养基培养紫红曲霉（Monascus purpureus）FuH-23-4；
步骤（b）：将步骤（a）的产物接种至权利要求4中所述的发酵培养基进行培养；
所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：粳米粉 25-35g/L，葡萄糖15-25 g/L，蛋白胨10-20 g/L，NaNO3 1-3 g/L，MgS04·7H20 0.4-0.6 g/L，KH2P041.0-2.0 g/L；所述溶剂为水。
6.一种产品，其活性成分为权利要求1的所述紫红曲霉（Monascus purpureus）FuH-23-4；所述产品的用途为生产红曲色素。
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