CN108593608A - 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用 - Google Patents

四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108593608A
CN108593608A CN201810125850.2A CN201810125850A CN108593608A CN 108593608 A CN108593608 A CN 108593608A CN 201810125850 A CN201810125850 A CN 201810125850A CN 108593608 A CN108593608 A CN 108593608A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tetraphenyl ethylene
clo
pyridiniujm
concentration
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810125850.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108593608B (zh
Inventor
赵娜
李楠
刘艳艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Normal University
Original Assignee
Shaanxi Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Normal University filed Critical Shaanxi Normal University
Priority to CN201810125850.2A priority Critical patent/CN108593608B/zh
Publication of CN108593608A publication Critical patent/CN108593608A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108593608B publication Critical patent/CN108593608B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N21/643—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" non-biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 ‑和ClO4 ‑中的应用，所述四苯乙烯吡啶盐的结构式为该化合物结构简单，易于合成且产率高，能快速有效的识别NO3 ‑和ClO4 ‑而不受其他离子的干扰，检测限可低至10‑7mol/L数量级，可以用于检测环境中(如：自来水，污水等)游离的NO3 ‑和ClO4 ‑。

Description

四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用
技术领域
本发明属于离子检测技术领域，具体涉及四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 -和ClO4 -中的应用。
背景技术
硝酸根(NO3 -)是一种非常重要的无机阴离子，它广泛存在于土壤、水体、蔬菜和食物中，对环境和人体健康具有极大危害。过量的氮含量可以引起水体富营养化，导致水生生态系统紊乱，水生生物种类减少，多样性受到破坏。另一方面，硝酸盐易与人体内的血红蛋白发生反应引发消化道癌症或者肝癌等疾病。因此，建立一种高校快速检测硝酸根离子的方法意义重大。然而，关于硝酸根的荧光探针却鲜有报道，尤其是荧光增强型硝酸根离子的荧光探针更罕有报道。
高氯酸根(ClO4 -)广泛存在于自然界中，是持久稳定的环境污染物。由于人体甲状腺吸收碘离子时，高氯酸根会通过竞争结合作用抑制甲状腺对碘离子的吸收摄取，从而使甲状腺激素的分泌减弱，使甲状腺的功能受到破坏，进而会对人体正常的新陈代谢造成影响。尤其是对于孕妇、婴儿等敏感人群，会使甲状腺功能减退，这会直接导致儿童的脑力发育迟缓，造成儿童的低智商。而高氯酸盐来源广泛，其化学和物理性质也较稳定，是一种水溶性相当大的无机盐，极易在地下水、地表水中快速扩散，难于从水体中进行有效的去除，因此，快速有效的检测高氯酸根的含量是极其重要的。然而关于高氯酸根的荧光探针几乎没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为四苯乙烯吡啶盐提供新用途，即在快速、高效、高选择性检测水相中NO3 -和ClO4 -的应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 -和ClO4 -中的应用，所述四苯乙烯吡啶盐的结构式如下所示：
具体检测方法为：
(1)将四苯乙烯吡啶盐加入去离子水与二甲基亚砜体积比为99:1的混合溶剂中，配制成2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液；
(2)四苯乙烯吡啶盐向2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液中加入NO3 -或ClO4 -标准样品，采用荧光光谱仪测量不同浓度NO3 -对应体系在542nm处的荧光强度或不同浓度ClO4 -对应体系在570nm处的荧光强度，并绘制I/I0随NO3 -或ClO4 -浓度变化的标准曲线；
(3)按照步骤(2)的方法用荧光光谱仪测量待测NO3 -或ClO4 -样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中标准曲线的线性方程即可高选择性识别NO3 -或ClO4 -并确定待测样品中NO3 -或ClO4 -的浓度。
本发明的四苯乙烯吡啶盐分子结构简单，合成方便，产率高，能快速有效的识别NO3 -和ClO4 -而不受其他离子的干扰，且检测限低，可达10-7mol/L数量级。本发明可用于检测环境中(如：自来水、污水等)一些游离的NO3 -和ClO4 -。
附图说明
图1是不同浓度NO3 -存在下体系的紫外吸收谱图。
图2是不同浓度NO3 -存在下体系的荧光光谱图。
图3是542nm处的I/I0随NO3 -浓度变化的曲线。
图4是NO3 -浓度为0.8～1.3mmol/L时I/I0与NO3 -浓度的线性关系图。
图5是不同浓度的ClO4 -存在下的紫外吸收谱图。
图6是不同浓度ClO4 -存在下体系的荧光光谱图。
图7是570nm处的I/I0随ClO4 -浓度变化的曲线。
图8是ClO4 -浓度为0～0.3mmol/L时I/I0与ClO4 -浓度的线性关系图。
图9是化合物的选择性实验。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 -中的应用，具体方法如下：
1、将四苯乙烯吡啶盐加入去离子水与二甲基亚砜体积比为99:1的混合溶剂中，配制成2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液。
2、将3mL 2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液加入4mL比色皿中，再向比色皿中加入NaNO3标准样品，分别使所得混合液中NO3 -的浓度为0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0mmol/L，采用紫外分光光度仪测其不同浓度NO3 -对应体系的紫外吸收光谱(见图1)。由图1可见，四苯乙烯吡啶盐的紫外吸收受到NO3 -浓度的影响，伴随着NO3 -浓度的增加而减弱。采用荧光光谱仪测量不同浓度NO3 -对应体系的荧光光谱(见图2)，并绘制在542nm处I/I0随NO3 -浓度变化的曲线(见图3)。
由图2可见，四苯乙烯吡啶盐的荧光强度受到NO3 -浓度的影响，伴随着NO3 -浓度的增加而增强。由图3可见，该体系的I/I0随着体系中NO3 -浓度的增大变化很明显，说明该化合物对NO3 -的检测灵敏度很高。在NO3 -浓度为0.8～1.3mmol/L时，I/I0与NO3 -浓度呈线性关系(见图4)，线性方程如下：
Y＝-878.554+1100.66X
式中Y为I/I0，X为NO3 -浓度，相关系数R2为0.98078，可见I/I0与NO3 -浓度的线性关系很好。利用最低检测限的公式计算最低检测限，四苯乙烯吡啶盐对NO3 -的检测限为4.3×10-7mol/L。
3、按照步骤2的方法用荧光光谱仪测量待测NO3 -样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合步骤3中标准曲线的线性方程即可高选择性识别NO3 -并确定待测样品中NO3 -的浓度。
实施例2
1、将四苯乙烯吡啶盐加入去离子水与二甲基亚砜体积比为99:1的混合溶剂中，配制成2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液。
2、将3mL 2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液加入4mL比色皿中，再向比色皿中加入NaClO4标准样品，分别使所得混合液中ClO4 -的浓度为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mmol/L，采用紫外分光光度仪测其不同浓度ClO4 -对应体系的紫外吸收光谱(见图5)。由图5可见，四苯乙烯吡啶盐的紫外吸收受到ClO4 -浓度的影响，伴随着ClO4 -浓度的增加而减弱。采用荧光光谱仪测量不同浓度ClO4 -对应体系的荧光光谱(见图6)，并绘制在570nm处I/I0随ClO4 -浓度变化的曲线(见图7)。
由图6可见，四苯乙烯吡啶盐的荧光强度受到ClO4 -浓度的影响，伴随着ClO4 -浓度的增加而增强。由图7可见，该体系的I/I0随着体系中ClO4 -浓度的增大变化很明显，说明该化合物对ClO4 -的检测灵敏度很高。在ClO4 -浓度为0～0.3mmol/L时，I/I0与ClO4 -浓度呈线性关系(见图8)，线性方程如下：
Y＝5.46792+1362.0747X
式中Y为I/I0，X为ClO4 -浓度，相关系数R2为0.98506，可见荧光强度与ClO4 -浓度的线性关系很好。利用最低检测限的公式计算最低检测限，四苯乙烯吡啶盐对ClO4 -的检测限为3.8×10-7mol/L。
3、按照步骤2的方法用荧光光谱仪测量待测ClO4 -样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合步骤3中标准曲线的线性方程即可高选择性识别ClO4 -并确定待测样品中ClO4 -的浓度。
为了证明四苯乙烯吡啶盐对NO3 -和ClO4 -检测的选择性，发明人分别对2.0×105mol/L CH3COONa、NaCl、K2CO3、KH2PO4、KI、Na3PO4、Na2S、Na2SO4、KBr、NaNO3、NaClO4的水溶液进行了测试，测试体系的最大荧光强度(I)与空白样品的最大荧光强度(I0)的比值如图9所示。由图9可见，只有当阴离子为NO3 -或ClO4 -时，其I/I0值明显增大，在阴离子为其他阴离子时无明显变化。说明四苯乙烯吡啶盐对检测NO3 -和ClO4 -具有高选择性。

Claims (4)

1.四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 -中的应用，所述四苯乙烯吡啶盐的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的四苯乙烯吡啶盐在检测NO3 -中的应用，其特征在于：
(1)将四苯乙烯吡啶盐加入去离子水与二甲基亚砜体积比为99:1的混合溶剂中，配制成2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液；
(2)四苯乙烯吡啶盐向2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液中加入NO3 -标准样品，采用荧光光谱仪测量不同浓度NO3 -对应体系在542nm处的荧光强度，并绘制I/I0随NO3 -浓度变化的标准曲线；
(3)按照步骤(2)的方法用荧光光谱仪测量待测NO3 -样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中标准曲线的线性方程即可高选择性识别NO3 -并确定待测样品中NO3 -的浓度。
3.四苯乙烯吡啶盐在检测ClO4 -中的应用，所述四苯乙烯吡啶盐的结构式如下所示：
4.根据权利要求3所述的四苯乙烯吡啶盐在检测ClO4 -中的应用，其特征在于：
(1)将四苯乙烯吡啶盐加入去离子水与二甲基亚砜体积比为99:1的混合溶剂中，配制成2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液；
四苯乙烯吡啶盐(2)向2×10-5mol/L的四苯乙烯吡啶盐溶液中加入ClO4 -标准样品，采用荧光光谱仪测量不同浓度ClO4 -对应体系在570nm处的荧光强度，并绘制I/I0随ClO4 -浓度变化的标准曲线；
(3)按照步骤(2)的方法用荧光光谱仪测量待测ClO4 -样品的荧光强度，根据待测样品的荧光强度，结合步骤(2)中标准曲线的线性方程即可高选择性识别ClO4 -并确定待测样品中ClO4 -的浓度。
CN201810125850.2A 2018-02-08 2018-02-08 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用 Expired - Fee Related CN108593608B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810125850.2A CN108593608B (zh) 2018-02-08 2018-02-08 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810125850.2A CN108593608B (zh) 2018-02-08 2018-02-08 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108593608A true CN108593608A (zh) 2018-09-28
CN108593608B CN108593608B (zh) 2021-02-05

Family

ID=63608579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810125850.2A Expired - Fee Related CN108593608B (zh) 2018-02-08 2018-02-08 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108593608B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110146476A (zh) * 2019-05-31 2019-08-20 浙江师范大学 一种基于聚集诱导发光定量检测高氯酸根离子浓度的方法和检测试纸

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009091334A1 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 Agency For Science, Technology And Research Self-assembled olefin polymerization catalyst
CN104974745A (zh) * 2014-04-07 2015-10-14 香港科技大学深圳研究院 两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用
CN106008510A (zh) * 2016-05-19 2016-10-12 陕西师范大学 用于检测Hg2+的聚集诱导发光型荧光传感器及其制备方法和应用
WO2017008743A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie bioprobes emitting red or yellow fluorescence
WO2017080413A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie bioprobes emitting red or yellow fluorescence
CN106928141A (zh) * 2017-03-08 2017-07-07 中国矿业大学 四苯乙烯席夫碱红光锌离子探针及制备方法与用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009091334A1 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 Agency For Science, Technology And Research Self-assembled olefin polymerization catalyst
CN104974745A (zh) * 2014-04-07 2015-10-14 香港科技大学深圳研究院 两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用
WO2017008743A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie bioprobes emitting red or yellow fluorescence
WO2017080413A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie bioprobes emitting red or yellow fluorescence
CN106008510A (zh) * 2016-05-19 2016-10-12 陕西师范大学 用于检测Hg2+的聚集诱导发光型荧光传感器及其制备方法和应用
CN106928141A (zh) * 2017-03-08 2017-07-07 中国矿业大学 四苯乙烯席夫碱红光锌离子探针及制备方法与用途

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO GAO ET AL.: "An AIE active monoimidazolium skeleton: high selectivity and fluorescence turn-on for H2PO4 in acetonitrile and ClO4 in water", 《CHEM. COMMUN.》 *
CHI ZHAN ET AL.: "Zincke’s Salt-Substituted Tetraphenylethylenes for Fluorometric Turn-On Detection of Glutathione and Fluorescence Imaging of Cancer Cells", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 *
FANG HU ET AL.: "Highly Solid-State Emissive Pyridinium-Substituted Tetraphenylethylene Salts: Emission Color-Tuning with Counter Anions and Application for Optical Waveguides", 《SMALL》 *
GUOYU JIANG ET AL.: "An AIE based tetraphenylethylene derivative for highly selective and light-up sensing of fluoride ions in aqueous solution and in living cells", 《RSC ADV.》 *
HAO-RAN XU ET AL.: "Tetraphenylethene–pyridine salts as the first self-assembling chemosensor for pyrophosphate", 《ANALYST》 *
M. BINECI ET AL.: "AIE active pyridinium fused tetraphenylethene: Rapid and selectivefluorescent "turn-on" sensor for fluoride ion in aqueous media", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 *
NA ZHAO ET AL.: "A tetraphenylethene-substituted pyridinium salt with multiple functionalities: synthesis, stimuli-responsive emission, optical waveguide and specific mitochondrion imaging", 《J. MATER. CHEM. C》 *
RUI XUE ZHANG ET AL.: "A highly sensitive fluorescent sensor with aggregation-induced emission characteristics for the detection of iodide and mercury ions in aqueous solution", 《J. MATER. CHEM.》 *
XIAOBIAO DONG ET AL.: "A highly selective fluorescence turn-on detection of ClO with 1-methyl-1,2-dihydropyridine-2-thione unit modified tetraphenylethylene", 《CHEM. COMMUN.》 *
XIUJUAN CHEN ET AL.: "A pyridinyl-functionalized tetraphenylethylene fluorogen for specific sensing of trivalent cations", 《CHEM. COMMUN.》 *
XUE YOU ET AL.: "Pyridinium-Substituted TetraphenylethyleneEntailing Alkyne Moiety: Enhancement of Photosensitizing Efficiency and Antimicrobial Activity", 《CHEM. ASIAN J.》 *
YANYAN HUANG ET AL.: "Emissive nanoparticles from pyridinium-substituted tetraphenylethylene salts: imaging and selective cytotoxicity towards cancer cells in vitro and in vivo by varying counter anions", 《CHEM. SCI.》 *
胡方等: "阴离子对四苯乙烯吡啶盐晶态固态发光的调控及其在光波导中的应用", 《中国化学会第29届学术年会摘要集--第16分会：Π-共轭材料》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110146476A (zh) * 2019-05-31 2019-08-20 浙江师范大学 一种基于聚集诱导发光定量检测高氯酸根离子浓度的方法和检测试纸
CN110146476B (zh) * 2019-05-31 2021-05-28 浙江师范大学 一种基于聚集诱导发光定量检测高氯酸根离子浓度的方法和检测试纸

Also Published As

Publication number Publication date
CN108593608B (zh) 2021-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mikuška et al. Simultaneous determination of nitrite and nitrate in water by chemiluminescent flow-injection analysis
Yan et al. Fluorescence fingerprint of waters: Excitation-emission matrix spectroscopy as a tracking tool
CN104777156A (zh) 一种基于碳点荧光关-开模式检测肌醇六磷酸的方法
Wang et al. 2, 2′-Dihydroxyazobenzene-based fluorescent system for the colorimetric ‘turn-on’sensing of cyanide
CN104819970A (zh) 一种超分子配合物荧光探针测定水中多菌灵的方法
CN103901015A (zh) 一种对乳制品中硫氰酸根和三聚氰胺进行共检的检测方法
CN103604792A (zh) 一种测定溴离子的共振瑞利散射方法
CN103411943A (zh) 基于藻红B的荧光淬灭法或比色法检测Ag+、Hg2+和Fe3+的方法
Duan et al. A selective fluorescence quenching method for the determination of trace hypochlorite in water samples with nile blue A
Sultan Flow injection titrimetric analysis of vitamin C in pharmaceutical products
JP4372567B2 (ja) 紫外光による水および水溶液測定方法
Powers et al. Optical properties and photochemical transformation of the dissolved organic matter released by Sargassum
Fourrier et al. Characterization of the vertical size distribution, composition and chemical properties of dissolved organic matter in the (ultra) oligotrophic Pacific Ocean through a multi-detection approach
Dey et al. FRET-based ‘ratiometric’molecular switch for multiple ions with efficacy towards real-time sampling and logic gate applications
CN104614370A (zh) 一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法
Fang et al. Determination of eight essential amino acids in mixtures by chemometrics–spectrophotometry without separation
Bulgariu et al. Direct determination of nitrate in small volumes of natural surface waters using a simple spectrophotometric method
Fukushima et al. Colorimetric detection of iodide ion by a nuclear fast red-based Hg2+ complex in aqueous media
CN108593608A (zh) 四苯乙烯吡啶盐在检测NO3-和ClO4-中的应用
Konkayan et al. A highly sensitive and selective method for the determination of an iodate in table-salt samples using malachite green-based spectrophotometry
Xiong et al. Recyclable fluorescent chemodosimeters based on 8-hydroxyquinoline derivatives for highly sensitive and selective detection of mercury (II) in aqueous media and test strips
CN102331414B (zh) 黄曲霉毒素b1的荧光增敏剂及其运用
CN106153559A (zh) 一种快速测定水体中臭氧含量的方法
Abbas et al. First derivative spectrophotometric determination of uranium (VI) and vanadium (V) in natural and saline waters and some synthetic matrices using PAR and cetylpyridinum chloride
Shariati-Rad et al. Introduction of a spectrophotometric method for simultaneous determination of nitrite and nitrate in water samples using partial least squares

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210205

Termination date: 20220208

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee