CN104614370A - 一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，在对巯基苯胺的酸性水溶液中加入含有亚硝酸根的标准溶液后孵化一段时间，加入纳米金溶胶，通过紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶，得到紫外可见吸收光谱数据，以685nm和520nm处吸光度的比值为纵坐标，以亚硝酸根标准溶液浓度为横坐标，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线，将亚硝酸根待测溶液的A685/A520值代入亚硝酸根标准曲线的函数关系式中，实现亚硝酸根的定量检测。该方法步骤简单，不需要对纳米金进行修饰，也不需要特殊的仪器设备，成本低，对亚硝酸根浓度的检测范围广，可实现简便、快速和灵敏的检测，选择性好，检测速度快，是一种具有广阔应用前景的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种基于纳米金的比色法检测亚硝酸根的技术。
背景技术
亚硝酸根普遍存在于自然环境中，如在工业废水、酸雨以及肥料降解过程中都会产生亚硝酸根，另外，亚硝酸根也用作肉类产品的添加剂。但是，过量摄入亚硝酸根会引起中毒，毒作用为麻痹血管运动中枢、呼吸中枢及周围血管，严重者血压下降、昏迷、死亡。而且亚硝酸根会在胃中生产亚硝酸，亚硝酸会与蛋白质分解产物发生反应，易产生亚硝胺类物质，有强致癌作用。因此，对环境或食品中亚硝酸根进行检测就显得非常重要。
目前，亚硝酸根含量的检测有多种方法，如化学发光、荧光、电化学和表面增强光谱、比色等方法（Z. Lin, W. Xue, H. Chen and J. M. Lin, Anal Chem, 2011, 83, 8245-8251；J. F. Han, C. Zhang, F. Liu, B. H. Liu, M. Y. Han, W. S. Zou, L. Yang and Z. P. Zhang, Analyst, 2014, 139, 3032-3038；H. Wu, S. H. Fan, X. Y. Jin, H. Zhang, H. Chen, Z. Dai and X. Y. Zou, Anal Chem, 2014, 86, 6285-6290；A. Rahim, L. S. S. Santos, S. B. A. Barros, L. T. Kubota, R. Landers and Y. Gushikem, Electroanal, 2014, 26, 541-547；Y. H. Luo, G. Q. Wen, J. C. Dong, Q. Y. Liu, A. H. Liang and Z. L. Jiang, Sensor Actuat B-Chem, 2014, 201, 336-342；C. A. Mirkin, W. L. Daniel, M. S. Han and J. S. Lee, J Am Chem Soc, 2009, 131, 6362-6363；N. Xiao and C. X. Yu, Anal Chem, 2010, 82, 3659-3663.），相比较而言比色法具有简单、快速、可现场检测、不需要复杂的仪器等优点。
目前报道的比色法，一般是对纳米粒子表面进行修饰后，在亚硝酸根诱导下聚集而显色的方法。例如，在2009年，Mirkin等人（C. A. Mirkin, W. L. Daniel, M. S. Han and J. S. Lee, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 6362-6363.）报道了基于重氮化反应引起的金纳米粒子的聚集。该方法虽然对亚硝酸根具有很好的选择性，但是需要对检测体系加热至95℃并保持25 min，才能检测出1 mg/L的亚硝酸根。再如，Xiao等人（N. Xiao and C. X. Yu, Anal. Chem., 2010, 82, 3659-3663.）报道了基于对巯基苯胺修饰的金纳米粒子用于亚硝酸根检测的方法，对亚硝酸根的检测下限可达到0.25 mg/L，检测时间只需10 min，但是检测体系仍然需要在95℃时进行反应。因此，在温和的条件下实现环境领域中亚硝酸根的实时、快速检测，并且达到较高的灵敏度和较好的选择性具有十分重要意义；另外，对亚硝酸根浓度检测的范围应该宽广，才具有实际应用的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有亚硝酸根检测技术存在的问题和不足，提供一种快速、简便、灵敏、浓度检测范围广的测量亚硝酸根的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，具体包括如下步骤：
（1）用柠檬酸钠还原氯金酸制得纳米金溶胶；
（2）将对巯基苯胺（4-ATP）溶液和酸溶液混合，加入亚硝酸根标准溶液，得到溶液A；
（3）将溶液A在10～60℃的温度下孵化5～60 min，然后加入浓度为0.08～0.16 mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到溶液B；
（4）将步骤（3）得到的溶液B与步骤（1）得到的纳米金溶胶混合，纳米金发生不同程度的聚集，5~20 min后检测溶液的紫外可见吸收光谱；
（5）制作检测亚硝酸根的标准曲线：根据步骤（4）得到的紫外可见吸收光谱数据，以685 nm和520 nm处吸光度的比值（A685/A520）为纵坐标，以亚硝酸根浓度为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线；
（6）检测亚硝酸根样品的浓度：将4-ATP溶液和酸溶液混合，加入实际亚硝酸根样品溶液，在10～60℃的温度下孵化5～60min后加入碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，继续加入纳米金溶胶，检测亚硝酸根待测溶液的纳米金溶胶在685 nm和520 nm处的吸光度，将亚硝酸根待测溶液的A685/A520值代入亚硝酸根标准曲线的函数关系式的y 值中，计算出x 值，再根据x 值计算出亚硝酸根待测溶液的浓度。
所述步骤（2）中溶液A中对巯基苯胺溶液的浓度为20~50 μmol/L。
所述步骤（2）中酸溶液为盐酸、硫酸或磷酸。
所述步骤（2）中溶液A中酸溶液的浓度为25~200 mmol/L。
所述步骤（3）中溶液A与碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为1：4。
所述步骤（4）中溶液B与纳米金溶胶的体积比为1：4。
本发明的原理：如图1所示，4-ATP分子中含有巯基（-SH）和氨基（-NH2），巯基和氨基可以与金形成Au-S键和Au-N键，如果4-ATP中的巯基和氨基分别与不同的两个金纳米粒子结合，则会引起金纳米粒子的团聚，4-ATP浓度越大，金纳米粒子的团聚越明显。但是若在4-ATP中加入亚硝酸根，在酸性条件下亚硝酸根能将4-ATP中的氨基转化成重氮根（-N2 +），而重氮根不能与金结合成键，即酸性条件下亚硝酸根与4-ATP反应生成的重氮盐不会引起金纳米粒子的团聚。待测液中的亚硝酸根浓度越大，溶液B中剩余的4-ATP就越少，所以将溶液B与步骤（1）得到的纳米金溶胶混合后，会产生颜色上的变化，这种变化与亚硝酸根浓度相关。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）对亚硝酸根浓度的检测范围广：当亚硝酸根浓度在1~200 μmol/L时，检测体系的紫外吸收光谱都有较为明显变化（图2），浓度检测范围广，并且当亚硝酸根浓度在1~25 μmol/L范围内，A685/ A520的比值相对亚硝酸根的浓度具有很好的线性关系（图3）。
（2）可实现简便、快速和灵敏的检测：利用本发明通过肉眼即可半定量的检测亚硝酸根，无需借助任何仪器设备，该比色分析方法不需要对金纳米粒子进行修饰，检测方法方便，快速，适用的温度范围广（10～60℃），可以广泛地应用于现场亚硝酸根的检测，对检测体系进行优化后，在室温下亚硝酸根的检测下限可以达到10 μmol/L（0.46 mg/L），低于美国国家环境保护局饮用水标准规定的亚硝酸根含量（1 mg/L）；使用紫外可见分光光度计进行测量，亚硝酸根检测的检测下限可达到1 μmol/L（0.046 mg/L）。
（3）选择性好：其它的金属离子几乎不对亚硝酸根的检测产生干扰，如K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、NO3 -、SO4 2-、F-、Cl-、Br-、C2O4 2-、CH3COO-、H2PO4 -和HCO3 -。
附图说明
图1为亚硝酸根与4-ATP在酸的存在下发生重氮化反应导致金纳米粒子团聚程度不同的原理图。
图2为纳米金溶胶在检测不同浓度亚硝酸根时的紫外可见吸收光谱图，亚硝酸根的浓度依次为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L。
图3为以图2中紫外可见吸收光谱的吸光度的比值（A685/A520）为纵坐标，以亚硝酸根浓度为横坐标，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线。
图4为实施例1中的纳米金溶胶分别加入干扰离子和亚硝酸根后的吸光度比值A685/A520，图中的横坐标1~15分别表示干扰离子K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、NO3 -、SO4 2-、F-、Cl-、Br-、C2O4 2-、CH3COO-、H2PO4 -、和HCO3 - ，16表示NO2 -。
具体实施方式
实施例1
金纳米粒子溶胶制备：将1 g HAuCl4·4H2O溶于100 mL水中，取上述溶液1 mL用100mL水稀释并转移到250 mL干净的三口烧瓶中，加热至沸腾，再加入2 mL浓度为1%的二水合柠檬酸三钠溶液，在磁力搅拌的情况下继续加热沸腾30 min，自然冷却至室温，得到金纳米溶胶备用。
绘制检测亚硝酸根的标准曲线：取10个血清瓶，每个血清瓶中依次加入：50 μL浓度为50 μmol/L的4-ATP溶液， 10 μL浓度为1 mol/L的硫酸， 40 μL不同浓度的亚硝酸根溶液，得到100 μL的溶液A，所以4-ATP在溶液A中的浓度为25 μmol/L，硫酸在溶液A中的浓度为0.1 mol/L，而在各个血清瓶中，亚硝酸根在溶液A中的浓度分别为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L。将血清瓶中的溶液A在25℃时孵化15 min，得到溶液B。然后在溶液B中加入0.4 mL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入本实施例中制备的纳米金溶胶2 ml，5 min后用肉眼观察或紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶，亚硝酸根的浓度依次为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L，随着亚硝酸根浓度的增加，纳米金的颜色逐渐从蓝色变为紫色、红色；在亚硝酸根浓度为0和10 μmol/L时，纳米金颜色有明显不同，所以通过肉眼即可检测到10 μmol/L的亚硝酸根（0.46 mg/L）。从图2中紫外可见吸收光谱也可以看出，随着亚硝酸根浓度的减小，在520 nm处的紫外吸收峰逐渐变小，而在685 nm附近的吸收峰逐渐增大，说明纳米金的团聚程度越来越大。如图3所示，以A520表示520 nm处吸收峰的强度，以A685表示685 nm处吸收峰的强度，选用A685/ A520的比值为纵坐标，亚硝酸根浓度为横坐标，亚硝酸根浓度分别为1、5、10、15、20和25 μmol/L，绘图，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y=-0.0233x+0.9382，式中y表示A685/ A520的比值，x表示亚硝酸根在溶液B中的浓度，R2=0.991，说明y与x之间有很好的线性相关关系。
亚硝酸根的加样回收试验，50 μL浓度为50 μmol/L的4-ATP溶液中加入10 μL浓度为1 mol/L的硫酸，加入地表水样40 μL，在25℃时孵化15 min，得到溶液B。然后在溶液B中加入0.4 mL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入实施例1中制备的纳米金溶胶2 ml，5 min后用紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶，得到纳米金溶胶在685 nm和520 nm处的吸光度，将A685/A520值代入本实施例中亚硝酸根标准曲线函数关系式的y 值中，计算出x 值，根据x值即可得到地表水样中亚硝酸根的浓度为28.6±1.4 μmol/L，加标后亚硝酸根的浓度为47.4±2.2 μmol/L，加标浓度为20 μmol/L，加标回收率为94%。
选择性试验：取16个离心管，编为1~16号，每个离心管中分别加入50 μL浓度为50 μmol/L的4-ATP溶液，10 μL浓度为1 mol/L的硫酸；在16号离心管中加入40 μL亚硝酸根溶液，而1~15号离心管中分别只加入一种干扰离子（体积为40 μL），对应的干扰离子分别为K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、NO3 -、SO4 2-、F-、Cl-、Br-、C2O4 2-、CH3COO-、H2PO4 -和HCO3 -，得到混合溶液。上述16号离心管中亚硝酸根浓度为10 μmol/L，1~15号离心管中其它干扰离子的浓度均为100 μmol/L。将1~16号离心管内的混合溶液在25℃时孵化15 min，然后各加入0.4 mL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入本实施例中制备的纳米金溶胶2 ml，5 min后用紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶。根据测得的紫外可见吸收光谱数据，以吸光度的比值A685/A520为纵坐标，横坐标中1~16分别表示上述干扰离子以及亚硝酸根，如图4所示，本发明提供的方法对检测亚硝酸根具有非常好的选择性，相同条件下，10倍浓度的K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、NO3 -、SO4 2-、F-、Cl-、Br-、C2O4 2-、CH3COO-、H2PO4 -或HCO3 -干扰离子对检测亚硝酸根没有影响，所以本发明提供的检测亚硝酸根的方法具有高选择性。
实施例2
取10个血清瓶，每个血清瓶中依次加入：50 μL浓度为40 μmol/L的4-ATP溶液， 20 μL浓度为1 mol/L的磷酸， 40 μL不同浓度的亚硝酸根溶液，得到100 μL的溶液A， 4-ATP在溶液A中的浓度为20 μmol/L，磷酸在溶液A中的浓度为0.2 mol/L，而在各个血清瓶中，亚硝酸根在溶液A中的浓度分别为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L。将血清瓶中的溶液A在10℃时孵化60 min，得到溶液B。然后在溶液B中加入0.4 mL浓度为0.16 mol/L的Na2CO3- NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入实施例1中制备的纳米金溶胶2 ml，20 min后用肉眼观察或紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶。根据测得的紫外可见吸收光谱数据，以685 nm和520 nm处吸光度的比值（A685/A520）为纵坐标，以亚硝酸根浓度为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线。
本实施例的亚硝酸根待测溶液的检测计算方法同实施例1。
实施例3
取10个血清瓶，每个血清瓶中依次加入：5 μL浓度为0.5 mmol/L的4-ATP溶液，5 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸，90 μL不同浓度的亚硝酸根溶液，得到100 μL的溶液A，所以4-ATP在溶液A中的浓度为25 μmol/L，硫酸在溶液A中的浓度为25 mmol/L，而在各个血清瓶中，亚硝酸根在溶液A中的浓度分别为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L。将血清瓶中的溶液A在25℃时孵化20 min，得到溶液B。然后在溶液B中加入0.4 mL浓度为0.1 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入实施例1中制备的纳米金溶胶2 ml，15 min后用紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶。根据测得的紫外可见吸收光谱数据，以685 nm和520 nm处吸光度的比值（A685/A520）为纵坐标，以亚硝酸根浓度为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线。
本实施例的亚硝酸根待测溶液的检测计算方法同实施例1。
实施例4
金纳米粒子溶胶制备：将1 g HAuCl4·4H2O溶于100 ml水中，取上述溶液1 mL用100 mL水稀释并转移到250 ml干净的三口烧瓶中，加热至沸腾，再加入4 ml浓度为1%的二水合柠檬酸三钠溶液，在磁力搅拌的情况下继续加热沸腾30 min，自然冷却至室温，得到金纳米溶胶备用。
取10个血清瓶，每个血清瓶中依次加入：50 μL浓度为100 μmol/L的4-ATP溶液， 10 μL浓度为2 mol/L的盐酸， 40 μL不同浓度的亚硝酸根溶液，得到100 μL的溶液A， 4-ATP在溶液A中的浓度为50 μmol/L，盐酸在溶液A中的浓度为0.2 mol/L，而在各个血清瓶中，亚硝酸根在溶液A中的浓度分别为0、1、5、10、15、20、25、50、100和200 μmol/L。将血清瓶中的溶液A在40℃时孵化30 min，得到溶液B。然后在溶液B中加入0.4 mL浓度为0.08 mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH=9.5），接着加入本实施例中制备的纳米金溶胶2 ml，10 min后用肉眼观察或紫外可见分光光度计检测纳米金溶胶。根据测得的紫外可见吸收光谱数据，以685 nm和520 nm处吸光度的比值（A685/A520）为纵坐标，以亚硝酸根浓度为横坐标，根据检测的数据绘图，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线。
本实施例的亚硝酸根待测溶液的检测计算方法同实施例1。
Claims (6)
1.一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于步骤如下：
（1）用柠檬酸钠还原氯金酸制得纳米金溶胶；
（2）将对巯基苯胺溶液和酸溶液混合，加入亚硝酸根标准溶液，得到溶液A；
（3）将溶液A在10～60℃的温度下孵化5～60 min，然后加入浓度为0.08～0.16 mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，得到溶液B；
（4）将步骤（3）得到的溶液B加入到步骤（1）的纳米金溶胶中，混匀，纳米金发生聚集，5~20 min后检测溶液的紫外可见吸收光谱；
（5）根据步骤（4）得到的紫外可见吸收光谱数据，以685 nm和520 nm处吸光度的比值为纵坐标，以亚硝酸根标准溶液浓度为横坐标，拟合后得到亚硝酸根的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系式y=kx+b；
（6）将上述步骤（2）中的亚硝酸根标准溶液换成亚硝酸根待测溶液，重复步骤（1）~（4），检测亚硝酸根待测溶液的纳米金溶胶在685 nm和520 nm处的吸光度A685和A520，将亚硝酸根待测溶液的A685/A520值代入亚硝酸根标准曲线的函数关系式的y 值中，计算出x 值，再根据x 值计算出亚硝酸根待测溶液的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶液A中对巯基苯胺溶液的浓度为20~50 μmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于：所述步骤（2）中酸溶液为盐酸、硫酸或磷酸。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶液A中酸溶液的浓度为25~200 mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于：所述步骤（3）中溶液A与碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液的体积比为1：4。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米金的快速检测亚硝酸根的方法，其特征在于：所述步骤（4）中溶液B与纳米金溶胶的体积比为1：4。
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