CN1085912A - 肽化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了单链肽化合物，其中在非末端氨基 酸的Cα原子位置上被权利要求1所定义的基团-A 所取代。基团-A所键合的Cα原子上的天然α侧链 不存在。
本发明的肽衍生物对抑制细胞增殖非常有用，特 别对抑制骨髓组织生成和骨髓细胞有用。

Description

本发明涉及对细胞增殖具有抑制作用的肽的用途以及具有特异性和/或一般性细胞抑制作用的肽。
哺乳动物体中具有结构和功能非常不同的细胞，其分化和进化的机理已是许多研究的焦点。众所周知，对于具有连续循环的细胞体系，其机理通常包括一多能干细胞贮主，干细胞分裂并不断地向该体系中提供新的细胞。干细胞起初是同质的，但由“贮主”提供的干细胞很快就变成另外的形状并进化成所需功能的细胞。
这类干细胞体系的例子有骨髓中的红细胞生成体系以及上皮和表皮体系。
干细胞分裂的操纵或控制在医疗上是很有可能的，许多研究一直集中在解释所涉及的机理及可靠的化学信息。迄今通过激发或抑制步骤，一些生物分子已被确认为对细胞生成和分化具有作用。在这方面，骨髓组织生成已被特别很好地研究过，在其控制中所涉及的分子包括：促菌落因子（Colony-Stimulating  Factors）（CSF），如粒细胞促菌落因子（G-CSF）、巨噬细胞促菌落因子（M-CSF）、粒细胞-巨噬细胞促菌落因子（GM-CSF）、多谱系促菌落因子（multi-CSF;IL-3）[见Metcalf，Science  229：16（1985）]、白细胞介素11（IL-11）[见Paul  et  al  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  87：7521（1990）]、乳铁蛋白[见Broxmeyer  et  al  Blood  Cells11：429（1986）]、prostoglandins[见Pelus  et  al  J.Immunol  140：479（1988）]、酸性（H-亚基）铁蛋白[见Broxmeyer  et  al  Blood  68：1257（1986）]、干扰素（α、β和γ）[见Pelus  et  al  supra.和Broxmeyer  et  al  J.Immunol  131：1300（1983）]、肿瘤坏死因子（α和β）[见Broxmeyer  et  al  J.Immunol  136：4487（1986）]、转化生长因子-β[见Ottman  et  al  J.Immunol  140：2661（1988）]以及苯丙酸诺龙和抑制素[见Broxmeyer  et  al  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  86：779（1989）]。
人们还发现，血调节五肽（PEEDCK）可选择性地抑制骨髓组织生成细胞的增殖[见Paukovits et al Z.Naturforsch 37：1297（1982）]，以及对应于很窄范围的通式的其它肽被发现在红细胞生成中也存在着类似的抑制作用[见EP-A-112656和WO90/02753]。肽单体的氧化形成了由半胱氨酸桥连的二聚分子，这些二聚分子被发现能促进骨髓组织生成[见Laerum et al.Exp.Hematol 16：274（1988）]。（PEEDCK）2二聚物及其它类似化合物公开在WO-A-88/03535中。其它的二聚肽化合物公开在EP-A-408371中，其中的二硫键已被连接选择的肽链的碳或碳/硫桥所取代。因此该桥对水解相当稳定，而其本身非常惰性，不能参与受体-二聚物的相互作用。
尽管我们不想受限于理论研究，但已经有人认为这种肽化合物在体内与基质细胞发生作用，而且这种基质细胞通过其它可溶因子促进或抑制细胞分裂。因此二聚物被认为可诱发或促进激发细胞调节因子的基质生成，而单聚肽可以抑制此过程或者造成预防或阻止细胞分裂的因子的生成。这样，根据目前的考虑，基质细胞可以分别扩大二聚肽和单聚肽的促进作用或抑制作用。
因此一直寻求能在体内有效地抑制细胞增殖的肽化合物。在这一方面，人们应当注意到：不同的抑制程度更应与一定的临床状况相适应，特别地，各个细胞类型的选择性抑制是重要的。
本发明提供了一种肽衍生物，该衍生物包括单链血调节肽，如抑制红细胞生成的肽，其中非末端氨基酸的Cα原子被基团-A取代，天然α-侧链不在所述Cα原子的位置上，其中A基团为-CRARA′-Z，
这里的每个RA分别为氢原子或基团-RA″、-ORA″、-SRA″、-NRA″RA″、CONRA″RA″或-COORA″;
RA′为氢原子或基团RA″;
RA″为烷基、环烷基、烷酰基、羟烷基、anidine、或碳环或杂环基团;
Z为基团-ORB、-NRCRC、-CRDRERF、或除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的、碳环或杂环基团;
其中每个RB为直链或支链，饱和或不饱和的烃基团，如烷基、芳烷基或芳基基团，所说的烃基团可被一个或多个RA基团取代或不被取代，其中RA如上所定，以及可被一个或多个-N-、-O-或-S-杂原子间断或不被间断;
RC为氢原子或基团RB;
RD为氢原子或基团RF;
RE为氢原子或基团RF，或与基团RD一起形成
Figure 931084067_IMG8
C＝0;以及
RF为基团-RB、-ORB、-NRCRC或-SRB，或羟基、羧基、氨基羰基或烷氧基，或者为与连在Cα原子上的氮原子相接的亚甲基，或者为与RD一起形成的亚烷基，或者在RA、RA′、RD和RE中的一个基团不是氢原子的条件下，RF为氢原子。
这里的RA或RB中任意基团是与C相连的有机基团，其中含1至10个碳原子为优选，特别优选含1至6个碳原子。烷基可以是直链或支链的，可以被具有6-10个碳原子的芳基（即形成芳烷基）、烷氧基、羟基、酰氧基、氨基、叠氮基、酰氨基、氨基羰基或羧基取代。芳基包括含有选自O、N或S的一个或多个杂原子的5元或6元杂环芳基，如呋喃基、咪唑基、吡咯基、吡啶基和噻吩基。可以存在于芳基上的取代基包括C1-6烷基、羟基和羧基。实例包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、戊基、羧乙基和苯甲基。
在一种实施方式中，Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳环或杂环基团。
特别优选的Z基团包括苯甲基、吲哚基、羟苯基、咪唑基、萘基、噻吩基、吡啶基、呋喃基、异噁唑基、3，5-二甲基异噁唑基或环己基。
在另一种实施方式中，Z代表基团-ORB（其中RB如上所定义）或-CHRDRF（其中RD代表氢原子或基团-CH3;RF代表可被羟基、氨基或叠氮基取代了的或未取代的烷基;或者RD和RF共同形成亚烷基基团）。
优选地，RA和RA′均代表氢原子，这样，-A就是基团-CH2-Z。
根据本发明，任何具有血调节作用的单链肽都适合于作为本发明被取代的肽。
换一种方式表达，根据本发明，本发明提供了一些化合物，其中所述血调节肽链包括这些结构式：
其中Ra代表
Figure 931084067_IMG9
Re代表
Rf代表
或-NH-CH-COR10
其中n和m各自代表0或1;
p、q和r各自代表1或2;
s代表3或4;
R1和R2均为氢原子或一起代表桥氧基;
R3和R4均为氢原子或一起代表碳-碳键;
R5为氢原子或酰基;
每个R6和R7各自代表羟基或氨基，但羟基为优选;
R8代表氢原子;C2-6烷基;C7-20芳烷基，该芳烷基可以含有一个或多个羟基、氨基或甲氧基取代基;或者易代谢的S-保护基;
R9代表氢原子或甲基;以及
R9代表羟基或取代或未取代氨基、氨基酸谷氨酰胺的残基或含N-末端谷氨酰胺单元的肽及其盐。
所有所述的氨基酸残基可为D型或L型。但是，L型氨基酸为优选。
在N-末端保护基团R5存在时，正如上面所指明的，它可以是含1-20个碳原子的酰基，例如象乙酰基之类的含1-5个碳原子的低级烷酰基，或者是含7-20个碳原子的芳酰基或芳烷酰基，如苯甲酰基或苯乙酰基。
R5也可以是由氨基酸或肽链衍生的酰基。更具体地说，R5可以是由丝氨酸或任何肽衍生的酰基，该肽是由通过N-末端氨基酸的连续分离而从下列氨基酸序列衍生的：
所有具有结构式（Ⅰ）的肽的末端氨基最好被保护起来，例如由烷酰基、芳烷酰基或芳酰基的酰化作用来保护。
这里的R8为C2-6烷基，例如，它可以是乙基、丁基或己基。当R8为芳烷基时，它可为芳甲基，如苯甲基、二苯甲基或三苯甲基。当R8为易代谢基团时，它可为含5-10个碳原子的芳硫基，如吡啶硫基，或者为如上所定义的酰基。
本发明优选的化合物为王肽，也就是n优选为0。
Ra基团中的环基优选为5元环，也就是m优选为0。
尽管结构式（Ⅰ）所定义的肽的血调节活性很低或可忽略，但是，在抑制细胞增殖方面，在本发明的肽化合物衍生物中，它们仍然是有效的。
在由结构式（Ⅰ）中描述的肽链形成的肽化合物衍生物中，Rd处的链取代是需要的。
根据本发明，特别优选的肽化合物衍生物具有结构式Ⅱ
Figure 931084067_IMG12
其中Ra、Rb、Rc、Re、Rf、A和n均为上述所定义的，基团-NH-CH-CO-为Rd的衍生形式，Rd与基团-A相连，按此连接方式，天然侧链不再存在。本发明还包括结构式Ⅱ的化合物，其中A与相邻的基团-N-CH-CO-一起形成了脯氨酸残基。
一种结构式Ⅱ中特别优选的肽化合物为
Figure 931084067_IMG13
其中基团-A为上面讨论过的基团。
本发明肽衍生物抑制除了或者甚至不包括造血体系的很宽范围的细胞增殖的能力在医学上即不论是在细胞过渡增殖需要治疗方面如在牛皮癣中，或者是在癌症治疗很可能损伤特定的细胞群方面很有价值。许多种类的细胞对胞毒药物或对抗癌治疗中所用的射线是非常敏感的，一个已知的技术就是在抗癌治疗时利用药物来抑制如造血体系中的那些细胞的增殖，接着，当药物抑制作用消失时，再恢复正常的增殖。本发明的肽对所说的治疗好象具有合适的短的生物半衰期。类似地，对癌症治疗敏感的选择性细胞群的增殖可以与癌细胞本身一起被抑制，因此仅当癌细胞达到增殖的敏感态而正常细胞处于较不敏感态时，才开始抗癌治疗。
当如骨髓细胞、吞噬细胞或粒性白细胞之类的细胞在治疗期间被CSF药物激发时，一种细胞的增殖才发生。细胞生长的抑制可以使这种细胞恢复到正常的生长速率。
在许多自身免疫性疾病中，患者会产生对其组织有活性的白细胞。这种自身免疫的反应可通过抑制白细胞功能而相应地减少至少一段时间。
另一个临床应用是将相应的二聚物或有关的骨髓组织生成促进剂共同使用（如WO-A-88/03535中公开的），从而诱发骨髓细胞中高活性和低活性的交替峰值，这样可以提高红细胞生成的自然二十四小时节律。通过这种方式，可在骨髓低活性期间给予抑制细胞生长这样的治疗，由此降低了骨髓损伤的危险性，而且通过后续活性峰值能促进再生。
一般地说，为了达到抑制作用，病人可口服本发明的肽或注射入病人体中，其剂量为每70Kg体重每天0.001-100mg，例如，1-5mg。如果是静脉内或皮下给药，其剂量可以在每70Kg体重每天1-10mg，如约6mg，可给药达10天。当然，通过鼻、局部（透皮吸收）或直肠给药也是可行的。原则上说，使病人的胞外液产生10-13M至10-5M的肽浓度是需要的。
根据本发明的另一特征，提供了药物组合物，该组合物含有如上文定义的一种或多种肽化合物衍生物或其生理相容的盐活性成分，它们与药物载体或赋形剂相结合。根据本发明，此组合物可以以适合于通过口、鼻、肠胃外或直肠给药的形式存在。
这里使用的术语“药物”包括本发明在兽医上的应用。
根据本发明，该化合物可以以常规的药物给药形式存在，如片剂、包衣片剂、鼻喷雾剂、溶液、乳剂、粉剂、胶囊剂或缓释剂。常规的药物赋形剂及其通常的生产方法可被用来制备这些药剂形式。例如，片剂是通过将活性成分与公知的赋形剂如稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂和/或缓释试剂混合而生产出来的。所述稀释剂有碳酸钙、磷酸钙或乳酸钙，崩解剂有玉米淀粉或藻酸，粘合剂有淀粉或明胶，润滑剂有硬脂酸镁或滑石，缓释试剂有羧基聚亚甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。
如果需要的话，片剂可有若干层。包衣片剂可通过包覆心层而制得，该心层是由类似生产片剂的方法得到的，常用于片剂包衣的试剂有聚乙烯吡咯烷酮或紫胶片、阿拉伯树胶、滑石、二氧化钛或糖。为了获得缓释效果或避免不相容，心层也可以由几层组成。同样为了获得缓释效果，片剂包衣也可由几层组成，其中可使用上述片剂的赋形剂。
也可使用特定器官的载体体系。
例如，注射剂可由常规的方法生产，如通过加入对羟基苯甲酸酯之类的防腐剂或如EDTA一样的稳定剂而生产注射剂。然后再装入注射小瓶或安瓿中去。
鼻喷雾剂可由与水溶液剂相似的方法制成，装入喷雾容器中，该容器装有气溶胶推进剂或提供有手动压缩装置。含一种或多种活性成分的胶囊剂可通过如将活性成分与惰性载体混合、再将该混合物装入胶囊中去的方法制得，所述惰性载体如乳糖或山梨糖。
例如合适的栓剂可以通过将活性成分或活性成分组合物与为本目的设想的常规载体混合而制得，所述载体有天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物。
优选地，含本发明化合物的剂量单位为含结构式（Ⅰ）的肽或其盐0.1-10mg，如1-5mg。
本发明提供了用于抑制细胞分裂、特别是骨髓组织生成和骨髓再生的如上所述的肽化合物和组合物。根据本发明，肽化合物在制备抑制细胞分裂如骨髓组织生成和骨髓再生的药物方面的用途也构成了本发明的另一方面。
根据本发明的又一特征，本发明提供了一种抑制细胞分裂、特别是骨髓组织生成的方法，该方法包括给予有效剂量的如上文所定义的化合物或药物组合物。
然而，新的肽化合物衍生物的主要用途是在生产用于免疫分析技术的材料方面。肽可再与合适的高分子载体共价相连，从而注射到产生抗体的动物（如兔、豚鼠或山羊）体中，所述高分子载体有白蛋白、聚赖氨酸或聚脯氨酸。在体外，也可使用免疫技术。通过公知的吸收技术，采用高分子载体可得到高专一性的抗血清。将放射性（3H、125I、14C、35S）引入到肽分子中，可设计出放射免疫分析，此分析可用于确定不同生物体液如血清（血浆）、尿或脑脊髓液中的肽。
本发明的肽可用任何便利的方法合成。生成氨基酸单元的合适的方法公开在如Robert  M.Williams的“Synthesis  of  Optically  Active  α-Amino  Acids”（Pergamon  Press，1989）中。一般地说，活性侧链基团（氨基、硫羟基和/或羧基）在整个合成的偶联反应中将受到保护，但在整个合成过程中使某些侧链基团不受保护也是可能的，这些基团包括羟基、咪唑基、伯酰胺基、如pyroGlu一样的环氨基酸中的酰胺基。
因此，最后的步骤是将具有通式Ⅰ的肽的完全或部分受保护的衍生物去保护，此过程构成了本发明的进一步方面。
Schoellkopf等人已经描述了通过双内酰亚胺醚的金属取代、再烷基取代而制备各种氨基酸的方法[见，如Tetrahedron  39：2085（1983）和Topics  Curr  Chem  109：65（1983）]。该方法的应用证明其在制备形成本发明基础的取代氨基酸过程中是特别有用的。具体地说，由缬氨酸-甘氨酸二肽衍生的双内酰亚胺醚形成了取代反应的有用的起始化合物，该取代反应可总结如下：
Figure 931084067_IMG14
（其中X为一离去基团，如溴原子）。
如果D-缬氨酸起初用来生成双内酰亚胺醚，那么（S）α-氨基酸衍生物可由这种方法制备。相同地，（R）-α-氨基酸衍生物可通过L-缬氨酸制备。
因此，根据本发明，本发明也提供了生产肽化合物的方法，该方法包括部分或完全受保护的衍生物的去保护。
根据本发明，本发明提供了一种生产肽化合物的方法，该方法包括
a）将双内酰亚胺醚金属取代、再烷基取代，从而生成双内酰亚胺二肽醚;
b）水解步骤（a）的双内酰亚胺二肽醚，从而生成具有NH2-CH（A）-COOH结构的氨基酸，其中A如上文所定义;
c）引入肽链中的剩余氨基酸;以及
d）任何被保护基的去保护。
由该方法生成的取代双内酰亚胺二肽醚和取代α-氨基酸构成了本发明的进一步方面。
另外，本发明还包括了本发明的氨基保护、羟基保护、硫羟基保护和/或羧基保护的肽衍生物。
取代的α-氨基酸一旦生成，即可采用常规方法将肽链中的剩余氨基酸引入。
在形成肽链时，原则上可从C-末端或N-末端开始，但通常采用从C-末端开始的方法，因为这样的酸序列是完整的。
因此，人们可通过将第一个氨基酸适当保护的衍生物与第二个氨基酸适当保护的衍生物反应而从C-末端开始。第一氨基酸衍生物将具有一自由α-氨基基团，而其它反应物将具有一自由或活性羧基和被护氨基。偶联之后，中间产物可通过例如色谱法进行纯化，然后有选择地去掉N-保护。从而允许进一步引入N-被保护及自由或活性的氨基酸残基。此过程不断地进行，直到所需的氨基酸序列形成。
例如，可采用的羧酸活化取代基包括对称或混合酐、或活性酯如对硝基苯酯、2，4，5-三氯苯酯、N-羟基苯并三唑酯（OBt）、N-羟基琥珀酰亚胺酯（OSu）或五氟苯酯（OPFP）。
例如，自由氨基和羧基的偶联可采用二环己基碳二亚胺（DCC）来完成。可采用的另一种偶联剂如N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉（EEDQ）。
一般地说，在低温如-20℃至室温下，在适当的溶剂体系如四氢呋喃、二噁烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷或这些溶剂的混合物中，可便利地实现偶联反应。
在固相树脂载体上可便利地完成合成。氯甲基化聚苯乙烯（利用1%丁二烯苯交联）是一有用的载体类型;在这种情况下，例如合成将通过N-被保护的赖氨酸与载体偶联而从C-末端开始合成。
大量合适的固相方法在下列文献中公开了，Eric  Atherton，Christopher  J.Logan和Robert  C.Sheppard，J.Chem.Soc.Perkin  I，538-46（1981）;James  P.Tam，Foe  S.Tjoeng和R.B，Merrifield  J.Am.Chem.Soc.102，6117-27（1980）;James  P.Tam，Richard  D.Dimarchi和R.B.Merrifield  Int.J.Peptide  Protein  Res  16：412-25（1980）;Manfred  Mutter和Dieter  Bellof，Helvetica  Chimica  Acta  67  2009-16（1984）。
在溶液中进行偶联反应也是可能的。
在很宽范围内选择氨基酸的保护基是公知的，在下列文献中有实例：Schroeder，E.和Lübke，K.，The  Peptides，Vols.1和2，Academic  Press，New  York和London，1965和1966;Pettit，G.R.，Synthetic  Peptides，Vols.1-4，Van，Nostrand，Reinhold，New  York  1970，1971，1975和1976;Houben-Weyl，Methoden  der  Organischen  Chemie，Synthese  von  Peptiden，Band  15，Georg  Thieme  Verlag  Stuttgart，NY，1983;The  Peptides，Analysis，synthesis，biology  1-7，Ed：Erhard  Gross，Johannes  Meienhofer，Academic  Press，NY，San  Fransisco，London;Solid  phase  peptide  synthesis  Znded.，John  M.Stewart，Janis  D.Young，Pierce  Chemical  Company。
因此，例如可采用的胺保护基包括如下例举的保护基：苄酯基（Z-）、叔丁氧基羰基（Boc-）、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基（Mtr-）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc-）。可以理解，当肽由C-末端生成时，胺保护基将出现在每个新加入的残基的α-氨基上，并需在下步偶联反应之前有选择地除去。
在固相体系中，对这类临时胺保护的一个特别有用的基团是Fmoc基团，它可在有机溶剂中利用呱啶进行有选择性的脱除。对于在溶液中合成，Boc-为一优选的保护基团，它可用常规方法引入和脱除。
氨基酸或肽经常需要在保护前进行甲硅烷基化反应，例如可通过在有机溶剂中加入Fmoc而完成，这样可提高其在有机溶剂中的溶解性。甲硅烷基化和Fmoc保护反应可总结如下：
Figure 931084067_IMG15
例如，可采用的羧基保护基团包括易裂解酯基，如苄基（-OBZL）、对硝基苄基（-ONB）或叔丁基（-TOBu），以及在固体载体上的偶联基团，如连接在聚苯乙烯上的甲基。
硫羟基保护基团包括：对甲氧苄基（Mob）、三苯甲基（Trt）及乙酰氨基甲基（Acm）。
正如上述文献中所详细描述，存在着很多其它这类基团，在上文描述的方法中使用这类基团应属本发明范畴。
有许多方法可除去胺和羧基保护基团。然而必须与所用的合成步骤相一致。侧链保护基团在下步偶联前所采用的脱除临时α-氨基保护基的条件下必须是稳定的。
胺保持基团如Boc和羧基保护基团如tOBu可通过酸处理同时被除去，例如，通过三氟乙酸处理。硫羟保护基团如Trt可利用如碘之类的氧化剂有选择地被除去。
含半胱氨酸的肽可由本文描述的方法合成而得;作为合成最后的步骤，除去包括硫羟保持基在内的所有保护基团。
下面给出的实施例仅仅是为了举例说明本发明。
实施例1
（S）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-5-苯基-4-（E）-戊烯-1-酸
（S）-2-氨基-5-苯基-4-（E）-戊烯-1-酸是由（R）-（一）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪和肉桂酰溴通过类似于U.Schollkopf，U.Groth和C.Deng在Angew.Chem93（1981）793中描述的方法制备而成的。这样，将得到的氨基酸（4.0mmol）加入到六甲基二硅氮烷（15ml）和三甲基氯硅烷（2.0ml）的混合物中，将混合物在100℃下加热并在N2中搅拌一夜。然后将多余的甲硅烷基化试剂蒸馏掉，残余物溶解在CH2Cl2（10ml）中，加入在无水CH2Cl2（5ml）中的9-芴基甲氧羰基氯（4.1mmol），在N2中将混合物在室温条件下搅拌3小时，将CH2Cl2蒸发掉，残余物溶解在THF（9ml）和水（1ml）中，搅拌溶液30分钟并蒸发，残余物溶解在EtOAc中，并将其干燥（MgSO4）、蒸发以得到用于下步肽合成的标题化合物。
实施例2
（2S，4R，5R）-N-9-芴基甲氧羰基-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-0，0-异亚丙基赖氨酸
a）（2R，3R）-1-溴-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基-丁烷
将（2R）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪（3.24g，17.36mmol）溶解在60ml无水THF中，溶液冷却至-78℃。加入BuLi的己烷（10.85ml，17.36mmol）溶液，搅拌溶液30分钟。在加入7.8ml1，3-二甲基-2-咪唑酮后，再持续搅拌15分钟。滴入（2R，3R）-1，4-二嗅-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基丁烷（5.0g，17.36mmol）的10ml THF溶液，所得溶液在一夜中达到室温。利用磷酸盐缓冲剂（pH＝7）水解之后，用EtOEt将反应混合液萃取几次，再将有机溶液干燥（MgSO4）、浓缩，通过快速色谱法将残余物纯化（己烷/乙酸乙酯9/1）。
产率：3.00g（44.1%）。
1H NMR（CDCl3）δ：0.7（d，3H），1.04（d，3H），1.40（s，3H），1.41（s，3H），1.95-2.30（m，3H），3.40-3.58（m，2H），3.68（s，3H），3.70（s，3H），3.97（dd，1H），4.03-4.20（m，3H）13CNMR（CDCl3）δ：16.74，19.03，27.29，27.46，31.88，32.66，37.83，52.40，52.42，52.55，60.76，79.80，109.22，163.21，164.00
FAB-MS  signal  at  m/z391.2（72），141.1（100）。
b）（2R，3R）-1-叠氮-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基-丁烷
将（2R，3R）-1-溴-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-2，3-二羟基-2，3-异亚丙基丁烷（5.51g，14.11mmol）溶解在50ml DMF中，并加入2.93g NaN3（45mmol）和0.1g NBu4I。溶液保持在70-80℃之间过夜，再用50ml水稀释。利用氯仿萃取之后，收集有机层并干燥（MgSO4）。通过快速色谱法将残余物纯化（己烷/乙酸乙酯7/3）。
产率：4.06g（81.5%）。
1H NMR（CDCl3）δ：0.68（d，3H），1.03（d，3H），1.40（s，3H），1.42（s，3H）1.95-2.30（m，3H），3.20-3.80（m，2H），3.65（s，3H），3.68（s，3H），3.95（dd，1H），4.00-4.15（m，3H）13CNMR（CDCl3）δ：16.72，19.02，26.92，27.27，31.85，37.52，52.10，52.36，52.41，60.70，75.09，79.64，109.13，163.17，164.00
FAB-MS  signal  at  m/z  354.3（100），141.1（75）。
c）（2R，3R）-1-苄氧羰基氨基-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪]-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基-丁烷
将（2R，3R）-1-叠氮-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪]-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基丁烷（3.57g，10.12mmol）溶解在60mlEtOH中并加入1.3g  Pd/c。利用氩气吹扫溶液。将氢气吹入溶液中，溶液在氢气中放置过夜，再用硅藻土过滤。残余物在真空中干燥并溶解在30ml二噁烷中。加入15ml 1M NaHCO3溶液（15mmol）并在0℃下加入1.84mlCbzCl（13mmol）。溶液在此温度下搅拌1小时，用水稀释，用氯仿萃取。通过快速色谱法将残余物纯化（己烷/乙酸乙酯8/2）。
产率：2.20g（44.1%）
HNMR（CDCl3）δ：0.67（d，3H），1.03（d，3H），1.35（s，3H），1.38（s，3H），1.90-2.05（m，1H），2.10-2.30（m，2H），3.30-3.55（m，2H），3.64（s，3H），3.68（s，3H），3.92-4.15（m，4H），5.09（s，2H），5.45（m，1H），7.26-7.38（m，5H）13CNMR（CDCl3）δ：16.70，19.05，27.17，31.83，37.69，42.94，52.26，52.41，52.52，60.65，66.72，75.69，79.41，108.61，128.02，128.07，128.47，136.54，156.40，163.24，164.11
FAB-MS  signal  at  m/z  462.3（56），141.1（47），91.0（100）
C24H35N3O6（461.6）：计算：C，62.45;H，7.64;N，9.10
实验：C，62.99;H，7.67;N，8.77
d）（2S，4R，5R）-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-0，0-异亚丙基-赖氨酸甲酯
将（2R，3R）-1-苄氧羰基氨基-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-2，3-二羟基-2，3-0，0-异亚丙基丁烷（0.5g，1.08mmol）溶解在5ml二噁烷中，滴入4.20ml 0.5MHCl（2.10mmol），在室温下，将溶液置于氩气中搅拌5小时。加入氨溶液，直至pH达到9，用氯仿萃取溶液并干燥（MgSO4）。通过球-球（bulb-to-bulb）蒸馏（0.05Torr，25℃）将缬氨酸甲酯（VaLOMe）分离出去。
产率：0.40g（100%）
1H NMR（CDCl3）δ：1.35（s，6H），1.70-2.20（m，4H），3.20-3.60（m，3H），3.70（s，3H），3.73-3.90（m，2H），5.09（s，2H），5.32（m，1H），7.26-7.40（m，5H）13CNMR（CDCl3）δ：27.01，27.05，37.56，42.11，51.99，52.38，66.79，75.79，79.82，108.99，128.00，128.44，136.39，156.46，175.30
（2S，4R，5R）-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-0，0-异亚丙基-赖氨酸
将（2S，4R，5R）-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-0，0-异亚丙基赖氨酸甲酯（0.40g，1.08mmol）溶解在3.5ml水和4ml二噁烷中，并冷却至0℃。加入0.54ml  2N  LiOH溶液（1.08mmol），将溶液置于氩气中搅拌过夜。TLC对照显示出了（2S，4R，5R）-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-异亚丙基赖氨酸的定量生成。将此粗溶液直接用于下步反应。
（2S，4R，5R）-N-9-芴基甲氧羰基-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-0，0-异亚丙基-赖氨酸
将2.5ml 1M NaOH溶液（2.5mmol）和0.518g 9-芴氧羰基氯（2.00mmol）的3ml二噁烷溶液加入到（2S，4R，5R）-N′-苄氧羰基-4，5-二羟基-4，5-异亚丙基赖基酸的粗溶液中，搅拌此混合物一夜。通过加入KHSO4溶液将上述溶液酸化至pH为2，用乙酸乙酯萃取、干燥（MgSO4）。通过快速色谱法纯化残余物（氯仿/MeOH8/2）。
产率：310mg（50.0%）
1H NMR（DMSO/D2O）δ：1.19（s，3H），1.22（s，3H），1.60-2.10（m，2H），2.90-3.30（m，2H），3.50-4.00（m，3H），4.00-4.40（m，3H），4.95（s，2H），7.20-8.00（m，13H）13CNMR（DMSO/D2O）δ：27.59，27.81，37.14，43.15，53.94，65.92，66.01，76.98，80.16，108.40，120.61，125.67，125.79，127.66，128.16，128.22，128.32，128.89，137.55，141.18，144.36，156.14，156.87，176.09
FAB-MS  signal  at  m/z  497.1（3），429.1（4），179.1（31），91.0（64）
C32H34N2O8（574.6）：实验：C，66.89;H，5.96;N，4.88
计算：C，62.53;H，5.60;N，5.03
实施例3
（S）-2-（9-芴基甲氧基羰基氨基）-6-叠氮基己酸
a）1-溴-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-丁烷
将（2R）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪（3.76g，20.43mmol）溶解在60ml无水THF中，溶液冷却至-78℃加入nBuLi的己烷（20.43mmol，12.77ml）溶液，溶液搅拌30分钟。滴入1，4-二溴丁烷（4.41g，20.43mmol）的10ml THF溶液，溶液温度在一夜间达到室温。在利用磷酸盐缓冲液（pH＝7）水解之后，利用EtOEt萃取反应混合液几次，有机溶剂被干燥（MgSO4）。通过快速色谱法纯化残余物（己烷/乙酸乙酯9/1）。
产率：3.88g（59.6%）。
1H NMR（CDCl3）δ：0.68（d，3H），1.04（d，3H），1.23-1.47（m，2H），1.63-1.91（m，4H），2.25（m，1H），3.38（t，2H），3.67（s，3H），3.68（s，3H），3.90-4.05（m，2H）;13CNMR（CDCl3）δ：16.58，19.03，23.29，31.75，32.63，33.13，33.58，52.33，55.13，60.78，163.60。
b）1-叠氮基-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-丁烷
将1-溴-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]-丁烷（3.81g，11.95mmol）溶解在40ml DMF，加入NaN3（50mmol）和0.1g NBu4I。溶液保持在70-80℃之间过夜，用50ml水稀释。在用氯仿萃取之后，收集并干燥（MgSO4）有机层。通过快速色谱法纯化残余物（己烷/乙酸乙酯9/1）。
产率：2.17g（64.6%）。
1HNMR（CDCl3）δ：0.68（d，3H），1.04（d，3H），1.20-1.50（m，2H），1.53-1.91（m，4H），2.26（m，1H），3.25（t，2H），3.68（s，3H），3.69（s，3H），3.90-4.07（m，2H）13CNMR（CDCl3）δ：16.58，19.05，21.83，28.72，31.76，33.56，51.32，52.35，55.16，60.79，163.63。
c）（S）-2-氨基-6-叠氮己酸甲酯
将1-叠氮基-4-[（2R，5S）-3，6-二甲氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]丁烷（2.17g，7.72mmol）溶解在30ml二噁烷中，滴入1.28ml浓HCl的30ml水溶液（15.45mmol），在室温下将此混合液置于氩气中搅拌一夜。加入氨溶液，直至pH达到9。用氯仿萃取溶液并干燥（MgSO4），通过球-球蒸馏（0.05Torr，25℃）将缬氨酸甲酯（VaLOMe）分离出去。
产率：1.44g（100%）。
1H NMR（CDCl3）δ：1.40-1.87（m，8H），3.28（t，2H），3.43（dd，1H），3.73（s，3H）13CNMR（CDCl3）δ：22.93，28.63，34.36，51.22，51.98，54.26，176.37。
d）（S）-2-氨基-6-叠氮己酸
将（S）-2-氨基-6-叠氮己酸甲酯（1.44g，7.73mmol）溶解在4ml二噁烷中，冷却至0℃。加入3.87ml  2N  LiOH溶液（7.74mmol），将溶液置于氩气中搅拌一夜。TLC对照显示出了（S）-2-氨基-6-叠氮己酸的定量生成。此粗溶液被用于下步反应中。
e）（S）-2-（9-芴基甲氧基羰基氨基）-6-叠氮己酸
将11.6ml 1N NaHCO3溶液（11.6mmol）和3.00g 9-芴氧基羰基氯（11.6mmol）的12ml二噁烷溶液加入到上述（S）-2-氨基-6-叠氮己酸（7.73mmol）粗溶液中，在氩气中继续搅拌一夜。通过加入KHSO4溶液将其酸化至pH为2，用乙酸乙酯萃取并干燥（MgSO4），通过快速色谱法将残余物纯化（己烷/乙酸乙酯/乙酸/7/3/0.5）。
产率：2.00g（65.6%）
1H NMR（DMSO）δ：1.20-1.80（m，2H），3.31（t，2H），3.94（m，1H），4.27（m，3H），7.20-8.00（m，8H）13CNMR（DMSO）δ：23.32，28.26，30.73，47.10，50.94，54.09，66.01，120.48，125.65，127.44，128.02，141.11，144.19，144.25，156.54，174.22。
实施例4
（S）-N-（9-芴基甲氧羰基）-O-甲基-丝氨酸
a）（2R，5S）-3，6-二甲氧基-5-（甲氧基甲基）-2-异丙基-2，5-二氢吡嗪
将1.6Mn-BuLi的己烷（10.85ml，17.36mmol）溶液在-78℃下加入到（R）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-吡嗪（5.53g，30mmol）的无水THF溶液中。30分钟后，将溴甲基甲醚（4.5g，36mmol）的THF（20ml）溶液滴入到上述溶液中。反应混合液被允许在一夜中变成20℃并通过加入1M磷酸盐缓冲剂（pH7，80mmol）。将溶液骤冷。搅拌此混浊混合物10分钟，用水（250ml）和二乙醚（180ml）稀释。液层被分开，用二乙醚（2×150ml）萃取水相。干燥并浓缩（Na2SO4）合并的有机层，通过快速色谱法纯化残余物（硅胶;乙烷：二乙醚为5：1），产量为5.61g。为了分离除去其它非对映体杂质，将材料在-30℃温度下从乙腈中结晶出来，并将冷的沉淀物再溶解在CH2Cl2、干燥（Na2SO4）和浓缩。
产率：4.24g（18.6mmol，62%）。
1NMR（CDCl3）δ：4.05（q，1H，J 3.5Hz），3.99（t，1H，J 3.5Hz），3.80-3.64（m，8H），3.34（s，3H），2.29（dsept，1H，J 3.5，7.0Hz），1.05（d，3H），0.68（d，3H）。13C NMR（CDCl3）δ：164.79，161.58，74.13，60.76，59.51，56.82，52.42。
FAB-MS signal at m/z 229[M++1]。
C11H20N2O3（228.29）。
b）（S）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-3-甲氧基丙酸甲酯
将1M  HCl（18.4ml，18.4mmol）加入到（2R，5S）-3，6-二甲氧基-5-（甲氧甲基）-2-异丙基）-2，5-二氢吡嗪（2.1g，9.2mmol）的二噁烷（18ml）溶液中，混合液在室温下搅拌一夜。将挥发性成分蒸发，残余物再溶解在二噁烷中并再次蒸发。残余物粗品溶解在二噁烷中并加入FmocCl（5.71g，2.-21mmol）。2分钟后，加入1M NaHCO3（44.2ml，44.2mmol）。15分钟后用水（50ml）和CHCl3（100ml）稀释混合物。分离层相，用CHCl3（2×75ml）萃取其中水相。合并的有机层被干燥（Na2SO4）、浓缩，并通过快速色谱法纯化（硅胶;己烷：乙酸乙酯2∶1）。
产率：2.68g（7.54mmol，82%）。
1H NMR（300MHz，CDCl3）δ7.78（d，2H，J 7Hz），7.63（t，2H，J 7Hz），7.41（t，2H，7 Hz），4.56-4.35（m，3H），4.25（t，1H，J 3.0，9.3Hz），3.84（dd，1H，J 3.0，9.3Hz）3.70（s，3H），3.65（dd，1H，J 3.6，9.3Hz），3.36（s，3H）。13C NMR（75MHz，CDCl3）δ170.77，156.01，143.88，143.75，141.25，127.66，127.02，125.12，125.07，119.92，72.27，67.11，59.23，54.37，53.44，52.54，47.12。
c）（S）-（9-芴基甲氧羰基氨基）-3-甲氧基丙酸
将6M  HCl（31ml，184mmol）加入到（S）-（9-芴基甲氧羰基氨基）-3-甲氧基丙酸甲酯（2.18g，6.13mmol）的二噁烷（31ml）溶液中。使混合液冷却并浓缩。通过快速色谱法纯化残余物（硅胶;己烷∶乙酸乙酯∶乙酸10∶10∶1）。
产率：1.91g（5.60mol，91%）（冷冻干燥后）。
1H NMR（DMSO-d6）δ7.87（d，2H，J 7.5Hz），7.74（d，2H，J 7.5Hz），7.41（dt，2H，J 0.6Hz，7.5Hz），7.31（dt，2H，J 0.6Hz，7.5Hz），4.29-4.19（m，4H），3.65-3.54（m，2H），3.24（s，3H），13C NMR（DMSO-d6）：δ172.07，156.46，144.23，144.21，141.11，128.03，127.46，125.73，120.48，71.80，66.19，5860，54.47，47.05。
实施例5
（S）-6-（苄氧羰基氨基）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-己炔-4-酸
a）1-氯-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]丁-2-炔
将1.6M n-BuLi（62.5ml，100mmol）在-78℃下滴入到（R）-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基吡嗪（21.23g，100mmol）的THF（200ml）溶液中。30分钟后，在-78℃温度下将此溶液转移至1，4-二氯丁-2-炔（49.2g，400mmol）的THF（400ml）溶液中。该混合液在一夜间变成20℃。通过加入1M磷酸盐缓冲溶液（250ml）将上述反应聚冷。用二乙醚（300ml）和水（300ml）将混合液稀释。水层被分离并用二乙醚（2×300ml）萃取。合并的有机层被干燥（Na2SO4）、过滤、浓缩并通过快速色谱法纯化（硅胶;己烷∶二乙醚10∶1）。
产率：24.8g（83mmol，83%）。
1H NMR（CDCl3）：δ4.39-4.00（m，8H），2.78（m，AA′X，2H），2.30（dsept，1H，J 3.5，9.5Hz），1.38-1.20（m，6H），1.05（d，3H，7Hz），0.70（d，3H，7Hz）。13C NMR（CDCl3）：δ161.03，159.25，83.76，60.90，54.21，31.68，30.95，25.48，20.62，19.03，15.85，14.21。
b）1-叠氮基-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]丁-2-炔
将1-氯-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]丁-2-炔（19.4g，65mmol）和碘化四丁铵（2g）的无水DMF（200ml）溶液在20℃温度下搅拌一夜。大部分DMF在减压（0.01torr）条件下被分离除去。在二乙醚（250ml）和水（250ml）之间分配残余物。用乙醚（2×250ml）萃取水层。合并的有机层被干燥（Na2SO4）、浓缩并通过快速色谱法纯化残余物（硅胶;己烷∶二乙醚8∶1）。
产率：18.06g（59mmol，91%）。
1H NMR（CDCl3）δ4.25-3.99（m，4H），3.84（m，6H），3.84（m，2H），2.83-2.77（m，AA′X，2H），2.33-2.26（m，1H），1.35-1.27（m，6H），1.05（d，3H，J 7.2Hz），0.71（d，3H，J 7.2Hz）。13C NMR（CDCl3）δ164.24，161.16，84.54，73.50，61.00，60.74，54.31，40.20，31.84，25.31，19.03，16.62，14.27，14.21。
c）1-苄氧羰基氨基-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2，5-二氢-2-异丙基-5-吡嗪基]丁-2-炔
将三苯膦（3.7g，14.16mmol）和水（680ml，37.8mmol）在20℃温度下加入到1-叠氮基-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2-异丙基-2，5-二氢-5-吡嗪基]丁-2-炔中。立即观察到了N2-演变。将反应混合物搅拌2小时，然后再浓缩。0℃温度下向残余物的二噁烷（29ml）溶液中加入1M NaHCO3（14.2ml，14.2mmol）和Cbz-氯（2.42g，14.2mmol）。混合液在此温度下保持1小时，然后用二乙醚（3×50ml）萃取。合并的有机层被干燥（Na2SO4）、过滤、浓缩并通过快速色谱法纯化（硅胶;己烷∶乙酸乙酯4∶1）。
产率：4.1g（9.92mmol，84%）。
1H NMR（CDCl3）：δ7.37-7.33（m，5H），5.10（s，2H），4.24-4.03（m，6H），3.97-3.90（m，4H），2.70-2.67（m，AA′X，2H），2.32-2.25（m，1H），1.27（t，4H，J 7Hz），1.04（d，3H，J 7Hz），0.69（d，3H，J 7Hz）。13C NMR（CDCl3）δ164.11，161.35，136.31，128.46，128.42，128.05，127.53，126.89，80.41，66.85，65.25，60.85，60.69，60.65，54.43，31.66，25.32，19.054，16.53，14.29，14.21。
d）（S）-2-氨基-6-（苄氧羰基氨基）-2-己炔酸乙酯
将1M HCl（38.7ml，38.7mmol）加入到1-苄氧羰基氨基-4-[（2R，5S）-3，6-二乙氧基-2，5-二氢-2-异丙基-5-吡嗪基]丁-2-炔（4g，9.67mmol）的二恶烷（38ml）溶液中。在室温下搅拌此混合液一夜。大部分二恶烷在减压条件下被分离除去，用水将含水残余物稀释至100ml。用乙醚（100ml）萃取此混合液。通过加入能形成白油的浓缩NH3，将溶液的pH值调整至9。用CHCl3（3×50ml）萃取该混合液，合并的CHCl3层被干燥（MgSO4）、过滤和浓缩。将残余物在50℃（0.1torr）条件下进行Kugelrohr蒸馏，从而分离出缬氮酸乙酯。剩下的材料为纯产品。
产率：2.57g（8.44mmol，87.3%）
1H NMR（CDCl3）：δ7.34（s，5H），5.11（s，2H），4.18（q，2H，J 7Hz），3.96（m，2H），3.57（t，1H，J 6Hz），2.60（AA′X，2H），1.27（t，3H，J 7Hz）。13C NMR（CDCl3）：δ173.73，160.3，136.24，128.44，128.10，128.05，79.02，78.66，66.93，61.19，53.22，31.15，25.10，14.15。
e）（S）-6-（苄氧羰基氨基）-2-9-芴基）-甲氧羰基氨基）-4-己炔酸
将1M NaHCO3（2.05ml，2.05mmol）和水（3ml）加入到（S）-2-氨基-6-（苄基羰基氨基）-4-己炔酸乙酯（520mg，1.71mmol）的二噁烷（5ml）溶液中。5小时后，加入FmocCl（530mg，2.05mmol）的二噁烷（5ml）溶液。几乎是立即就形成沉淀。通过加入1M HCl酸化该混合液，用CHCl3（3×30ml）萃取。有机层被浓缩并通过快速色谱法纯化（硅胶;己烷∶乙酸乙酯∶乙酸10∶10∶1）。
产率：720mg（1.44mmol，84.5%）。
1H NMR（300MH，DMSO-d6）：δ7.87，（d，2H，J7.5Hz），7.71（d，2H，J 7.5Hz），7.42-7.28（m，9H），5.00（s，2H），4.30-4.20（m，3H），4.10（m，1H），3.77（m，2H），2.58（m，2H）。13C NMR（300MHz，DMSO-d6）：δ172.41，156.28，144.20，141.10，137.35，128.73，128.21，128.03，127.48，125.68，120.49，100.09，79.37，79.03，66.21，65.93，53.49，47.04，30.63，21.78。
实施例6
（S）-2-氨基-3-（2-呋喃基）丙酸
a）（2R，5S）-2，5-二氨-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-糠基吡嗪
用注射器在-78℃温度下将1.55M丁基锂（6.45ml，10mmol）的己烷溶液加入到（2R）-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基吡嗪（1.84g，10mmol）的THF（50ml）的搅拌溶液中，将溶液在-78℃温度下搅拌1小时。慢慢地加入2-氯甲基呋喃（1.3g，11mmol）的THF（10ml）溶液，继续搅拌一夜。在减压条件下分离除去溶液，残余物溶解在乙酸乙酯（50ml）中，用磷酸盐缓冲剂（pH7）萃取。水相用乙酸乙酯（2×20ml）萃取两次。有机层被干燥（MgSO4），溶剂在减压条件下蒸发，通过快速色谱法纯化残余物（二乙醚/己烷15/1，硅胶）。
产率：2.0g（76%），无色粘性液体。
1H NMR（CDCl3）：δ0.65（d，3H，J 6.7Hz），1.00（d，3H，J 6.7Hz），2.20（m，1H），3.11（d，2H，J 5Hz），3.62（t，1H，J 3.5Hz），3.65（d，3H，J 0.9Hz），3.70（d，3H，J 0.9Hz），4.26（dd，1H，J5，J8.5Hz），5.96（d，1H，J3.1Hz），6.23（dd，1H，J 1.8，J 3.1Hz），7.26（dd，1H，J 1.0，J 0.8Hz）。2.20（m，1H），3.11（d，2H，J 5Hz），3.62（t，1H，J3.5Hz），13C NMR（CDCl3）：δ16.54，19.07，31.43，33.03，52.33，52.41，54.95，60.48，107.10，110.24，141.28，152.27，162.53，164.10。
b）（S）-2-氨基-3-（2-呋喃基）丙酸甲酯
在室温条件下，在N2中将（2R，5S）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-糠基吡嗪（2g，7.6mmol）、1M HCl（7.6ml，7.6mmol）和二噁烷（7.6ml）的混合溶液搅拌一夜。在减压条件下分离除去二噁烷，用二乙醚（20ml）萃取水相。向水相中加入氨水，直至pH为9，用CHCl3（3×30ml）萃取、干燥（MgSO4），在减压条件下分离除去溶剂。在40-50℃（0.05mbar）条件下利用球-球蒸馏分离出缬氨酸甲酯。在不进行进一步纯化条件下，采用未蒸馏的标题化合物。
产率1.0g（86%）。
1H NMR（CDCl3）：δ1.5（s，2H），2.92（dd，1H，J 15，J 7.2Hz），3.04（dd，1H，J 15，J 5Hz），3.68（d，3H，J 0.5Hz），3.73（dd，1H）J 7.2，J 5.1Hz），6.06（dd，1H，J 0.7，J3.2Hz），6.24（dd，1H，J2.9，J 2Hz），7.28（dd，1H，J 0.7，J1.9Hz）。13C NMR（CDCl3）：δ33.45，52.00，53.67，107.44，110.20，141.83，151.32，174.97。
c）（S）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-3-（2-呋喃基）丙酸
将（S）-2-氨基-3-（2-呋喃基）丙酸甲酯（1g，6.5mmol）与2M LiOH（3.27ml，6.5mmol）和二噁烷（3.27ml）在0℃温度下混合，并在N2中搅拌一夜。第二天，反应混合物的TLC对照（CHCl3/MeOH/NH3为1/1/0.1）显示出不含酯。将溶解在二噁烷（10ml）中的1M NaHCO3（9.75ml，9.75mmol）和9-芴基甲氧羰基氯（2.5g，9.75mmol）加入到上述溶液中，再继续搅拌1小时。在减压条件下分离除去二噁烷，用10%KHSO4溶液将水溶液酸化成pH为2。用CHCl3（3×20ml）萃取溶液，干燥（MgSO4）、蒸发，通过快速色谱法纯化（己烷/乙酸乙酯/乙酸10/10/1）。
产率：1.3g（53%），白色晶体。
1H NMR（CDCl3）：δ2.95（dd，1H，J 9.9，J 15.2Hz），3.08（dd，1H，J4.4，J15.2Hz），3.6（br.s，1H），4.16-4.26（m，4H），6.12（d，1H，J2.9Hz），6.33（t，1H，J2.3Hz），7.29（t，2H，J7.32Hz），7.39（t，2H，J7.48Hz），7.49（br.s，1H），7.64（dd，2H，J7.17，J2.14Hz），7.85（d，2H，J7.48Hz）。13CNMR（CDCl3）：δ29.8，46.98，66.04，107.45，110.85，120.48，125.57，125.63，127.50，128.07，141.06，142.21，144.09，151.84，156.26，160.35。
实施例7
（S）-2-氨基-3-（3，5-二甲基-4-异噁唑基）丙酸
a）（2R，5S）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-（3，5-二甲基-4-异噁唑基甲基）吡嗪
在-78℃温度下用注射器将1.55M丁基锂（10ml，15.5mmol）的二噁烷溶液加入到（2R）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪（2.85g，15.5mmol）的THF（50ml）的搅拌溶液中，并在-78℃下搅拌溶液1小时。慢慢地加入4-氯甲基-3，5-二甲基异噁唑（2.34g，16mmol）的THF（10ml）溶液，继续搅拌一夜。在减压下分离除去溶剂，残余物溶解在乙酸乙酯（50ml）中，用磷酸缓冲剂（pH7）萃取。用乙酸乙酯（2×20ml）萃取水相两次。有机层被干燥（MgSO4），在减压下蒸发溶剂，通过快速色谱法纯化残余物（二乙醚/己烷4/1，硅胶）。
产率：3g（64%），无色粘性液体。
1H NMR（CDCl3）：δ0.60（d，3H，J 6.7Hz），0.97（d，3H，J 6.7Hz），2.17（s，3H），2.26（s，3H），2.73（dd，1H，J 5.9，J 14.6Hz），2.86（dd，1H，J 4.4，J 14.7Hz）3.59（t，1H，J 3.4Hz），3.63（d，3H，J 0.3Hz），3.68（d，3H，J 0.3Hz），4.11（m，1H）。13C NMR（CDCl3）：δ10.21，11.16，16.41，18.99，26.99，31.29，52.26，52.33，55.93，60.46，109.82，160.18，162.33，164.24，166.34。
b）（S）-2-氨基-3-（3，5-二甲基-4-异噁唑基）-丙酸甲酯
在室温条件下，在N2中搅拌（2R，5S）-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-（3，5-二甲基-4-异噁唑基甲基）吡嗪（2g，6.8mmol）、1.0M HCl（13.6ml，13.6mmol）和二噁烷（13.6ml）的混合溶液一夜。在减压下分离出二噁烷并用二乙醚（20ml）萃取水相。向水相中加入氨水，直至pH值为9，用CHCl3（3×30ml）萃取、干燥（MgSO4），并在减压下分离除去溶剂。在40℃-50℃（0.05mbar）条件下，通过球-球蒸馏分离出缬氨酸甲酯。在不进行进一步纯化的条件下，使用未蒸馏的标题化合物。
产率：1.3g。
1H NMR（CDCl3）：δ1.52（br.s，2H），2.21（s，3H），2.31（s，3H），2.56（dd，1H，J 7.5，J 14.6Hz），2.74（dd，1H，J 6.2，J 14.6Hz），3.55（t，1H，J 6.7Hz），3.69（s，3H）。13C NMR（CDCl3）：δ0.18，11.06，27.94，52.06，54.45，109.45，159.63，166.31，175.18。
c）（S）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-3-（3，5-二甲基-4-异噁唑基）丙酸
在0℃温度下，将（S）-2-氨基-3-（3，5-二甲基-4-异噁唑基）-丙酸甲酯（1.3g，6.6mmol）与2M LiOH（3.3ml，6.6mmol）和二噁烷（3.3ml）混合并在N2中搅拌一夜。第二天，反应混合物的TLC对照（CH3/MeOH/NH3为1/1/0.1）显示出不含酯。将溶解在二噁烷（10ml）中的1M NaHCO3（10ml，10mmol）和9-芴基甲氧基羰基氯（2.6g，10mmol）加入到上述溶液中，再继续搅拌1小时。在减压条件下分离出二噁烷，用10%KHSO4溶液将水溶液酸化成pH为2。用CHCl3（3×20ml）萃取溶液、干燥（MgSO4）、蒸发，通过快速色谱法纯化（己烷/乙酸乙酯/乙酸10/10/1）。
产率：1.6g（59%），白色晶体。
1H NMR（CDCl3）：δ2.10（s，3H），2.19（s，3H），2.65（dd，1H，J 9.46，J 14.65Hz），2.76（dd，1H，J 5.4，J14.65）。
肽的固相合成
固相肽合成实质上是根据芴基甲氧羰基（Fmoc）-聚酰胺合成方法进行的（Atherton  &  Sheppard，Solid  phase  peptide  Synthesis：a  practical  approach  Oxford：IRL  Press  at  Oxford  University  Press，1989）。使用了商业上可购买到的合成树脂;对于批量合成，不论是人工的还是使半自动仪器（Labortec肽合成器5P  650），它们是具有酸性不稳定（Wang，J.Am.Chem.Soc.，95，1328-1333，1973）或酸性超不稳定交联剂（Merger等人，Tetra-hedron  Letters  29，4005-4008，1988）的聚苯乙烯。另一方面，肽是通过使用LKB  Biolynx  4170自动肽合成器在全自动流动树脂模中组合而成的（Atherton等人，J.Chem.Soc.，Chem.-Commun.，1151-2，1981）。销售的合成树脂已经含有受保护的所需C-末端Fmoc-氨基酸残基。通过使用二环己基碳化二亚胺（DCC）/1-羟基苯并三唑（HOBt）（Koenig  &  Geiger，Chem.Ber.，103，2034-2040，1970）活化或者使用偶联剂PyBOP（Coste等人，Tetrahedron  Lett.，31  205-208，1990），可获得各种具有侧链被保护Fmoc-氨基酸五氟苯基酯（Kisfaludy  &  Schoen，Synthesis，325-327，1983）的链长。赖氨酸侧链氨基由叔丁氧羰基官能团保护，谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基被保护成叔丁基酯。
在所需序列的固相组合完成之后，利用已添加了适当化学清除剂（King等人，Int.J.Peptide  Protein  Res.，36，255-268，1990）的三氯乙酸，可由含附随物质侧链去保护的合成树脂裂解出肽。在蒸发后，用二乙醚沉淀将肽离析出来并干燥。由制备反相高性能液相色谱法完成纯化。
表1
具有一般结构Pyr-Glu-Asp-Xaa-Lys-OH的
单体肽的分析数据
HPLC方法b纯度cFAB-MS
Xaaa
(保留时间,分) (%) [M+H]+
缬氨酸  0-30-20(17)  100  601.4
正亮氨酸  0-30-20(23)  99  615.4
亮氨酸  0-30-20(22)  98  615.4
色氨酸  20-50-20(14)  96  688.3
酪氨酸  0-30-20(13)  98
赖氨酸  0-30-20(10)  100  630.4
谷氨酸  0-30-20(10)  99  631.6
谷氨酰胺  0-30-20(12)  100  630.3
组氨酸  0-30-20(13)  99  639.4
脯氨酸  0-30-20(15)  99  599.3
1-萘基丙氨酸  30-90-20(15)  99  699
噻吩-2-基丙氨酸  0-30-20(20)  100  655.3
吡啶-2-基丙氨酸  0-30-20(12)  95
呋喃-2-基丙氨酸
3,5-二甲基异噁唑-4-
基丙氨酸
环己基丙氨酸  10-40-20(23)  98  655.4
烯丙基甘氨酸
0-甲基丝氨酸
2-氨基-6-叠氮基己酸
2-氨基-4,5-二羟基-6-苄氧
羰基氨基己酸
a所有氨基酸均有L构型，即它们在天然氨基酸中能找到。
b该方法以在A时间内流动相B的梯度表达，因此，例如10-40-20指的是在20分钟时间内梯度起点为10%B，而结束时则为40%B。流动相：A）0.1%TFAB）0.1%TFA的40%MeCN溶液。柱：Vydac TP 54，C18，0.46×25cm，5μm颗粒，100
Figure 931084067_IMG16
孔;流动1ml/分。
c指的是PHLC色谱图峰的积分（λ＝215nm）。
表2
肽的氨基酸分析数据
（Pyr-Glu-Asp）2-桥接残基-（Lys-OH）2
Pyr-Glu-Asp-Xaa-Lys-OH中含Xaa的肽
Xaa=Val  Xaa=Leu  Xaa=Nle  Xaa=Ser  Xaa=Trp
发现的残基数目(理论)
Val  0.81(1)
Nle  0.94(1)
Leu  0.97(1)
Trp 0.51a(1)
Lys  0.77(1)  0.68(1)  0.89(1)  0.90(1)  1.00(1)
Glu  2.09(2)  2.01(2)  2.11(2)  2.11(2)  2.33(2)
Asp  1.00(1)  1.00(1)  1.00(1)  1.00(1)  0.68(1)
a在酸分解过程中，色氨酸部分地被破坏。
HOBt＝羟基苯并三唑
Pfp＝五氟苯基
Fmoc＝9-芴基甲氧羰基
Boc＝叔丁氧基羰基
DCC＝二环己基碳化二亚胺
Cin＝（S）-2-氨基-5-苯基-4-（E）-戊烯-1-酸
BuLi＝正丁基锂
THF＝四氢呋喃
DMF＝二甲基甲酰胺
pGLu-Glu-Asp-[Cin]-Lys
利用Labortec肽合成器合成肽。将Fmoc-Lys（Boc）-Sasrin聚合物（1.0g，0.6mmol;Bachem A.G.;取代物0.6mmol/g）装入-100ml反应烧瓶中。将（S）-2-（9-芴基甲氧羰基氨基）-5-苯基-4-（E）-戊烯-1-酸（578mg，1.4mmol），DCC（290mg，1.4mmol）和HOBt（211mg，14mmol）的DMF（20ml）溶液加入到聚合物中去，反应进行9小时。然后用CH2Cl2、30%MgOH的CH2Cl2溶液及DMF（kaiser阴性试验）清洗聚合物。
合成的剩下部分是用Fmoc-Asp（OtBu）-Opfp（0.89g，1.5mmol）、Fmoc-Glu（OtBu）-Opfp（0.90g，1.5mmol）和pGlu-五氯苯基酯（0.57g，1.5mmol）通过标准方法进行的。将HOBt（0.23mg，1.5mmol）加入到允许进行1小时的各个偶联步骤中去。通过Kaiser阴性试验来确定偶联反应的完成情况。在与Fmoc-氨基酸偶联反应之后，用DMF清洗聚合物，由20%呱啶的DMF溶液裂解保护基团，再用DMF清洗聚合物。在最后偶联反应之后，用MeOH/CH2Cl2和CH2Cl2清洗聚合物并干燥。通过TFA∶CHCl21∶1将肽从聚合物中裂解出来，溶液被冷冻干燥，将残余物溶解在水中、过滤（0.45μ），滤液被冷冻干燥。为了进一步纯化，将粗肽溶解在水中，在Beckman超球ODS上进行制备HPLC，A为0.1%TFA的水溶解，B为0.1%TFA的MeCN∶H2O＝40∶60溶液。在冷冻干燥后收集到的含同质肽的馏分之后就可获得纯肽（＞95%）。

Claims (25)

1、一种肽化合物衍生物，该衍生物含有一种单链血调节肽，其中非末端氨基酸的Cα原子被基团-A取代且天然α侧链不在所述的Cα原子的位置，其中-A为基团-CRARA′-Z，
这里的每个RA分别为氢原子或基团-RA″、-ORA″、-SRA″、-NRA″RA″、CONRA″RA″、-COORA″；
RA′为氢原子或基团RA″；
RA″为烷基、环烷基、烷酰基、羟烷基、anidine或碳环或杂环基团；
Z为基团-ORB、-NRCRC、-CRDRERF或除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳环或杂环基团；
其中每个RB为如烷基、芳烷基或芳基基团之类的直链或支链、饱和或不饱和烃的基团，也还可以被一个或多个RA基团取代，其中RA如上所定义，以及还可以被一个或多个-N-、-O-或-S-杂原子间断；
RC为氢原子或基团RB；
RD为氢原子或基团RF；
RE为氢原子或基团RF，或与基团
RD一起形成
Figure 931084067_IMG1
基团；以及
RF为基团-RB、-ORB、-NRCRC或-SRB，或羟基、羧基、氨基羰基或烷氧基，或者为与连在Cα原子上的氮原子相接的亚甲基，或者为与RD一起形成的亚烷基，或者在RA、RA′、RD和RE中的一个基团不是氢原子的条件下，RF为氢原子。
2、根据权利要求1的肽化合物，其中Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳环或杂环基团。
3、根据权利要求2的肽化合物，其中-A为
-CH2-Z
其中Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳环或杂环基团。
4、根据权利要求3的肽化合物，其Z代表苯甲基、吲哚基、羟基苯基、咪唑基、萘基、噻吩基、吡啶基、呋喃基、异噁唑基、3，5-二甲基异噁唑基或环己基。
5、根据权利要求1的肽化合物，其中-A为
-CH2-Z
其中Z为基团-ORB（这里的RB如权利要求1所定义）或-CHRDRF;
RD表示氢原子或基团-CH3;
RF代表被羟基、氨基或叠氮基取代的烷基或未取代的烷基，或者
RD和RF一起形成亚烷基基团。
6、根据权利要求1-5之一的一种肽化合物，其中所述单链血调节肽具有结构式Ⅰ
其中Ra表示
Figure 931084067_IMG3
其中n和m分别为0或1;
p、q和r分别为1或2;
s代表3或4;
R1和R2均为氢原子或合为一桥氧基;
R3和R4均为氢原子或组成一碳-碳键;
R5为氢原子或酰基;
每个R6和R7分别为羟基或氨基，但羟基为优选;
R8代表氢原子;C2-6烷基;C7-20芳烷基，该芳烷基可以含有一个或多个羟基、氨基或甲氧基取代基;或者易代谢的S-保护基;
R9代表氢或甲基;
R10代表羟基或氨基、氨基酸谷氨酰胺的残基或含N-末端谷氨酰胺单元的肽。
7、根据权利要求6的肽化合物，其中在结构式Ⅰ的肽链中，n代表0。
8、根据权利要求6或7的肽化合物，其中在结构式Ⅰ的肽链中，m代表0。
9、根据权利要求6至8之一的一种肽化合物，其中所述基团-A与结构式Ⅰ中氨基酸Rd的Cα原子相连。
10、根据权利要求6至9之一的一种肽化合物，具有结构式Ⅱ
Figure 931084067_IMG4
其中-A与权利要求1至5之一中定义的相同，Ra、Rb、Rc、Re、、Rf和n为权利要求6中所定义的。
11、根据权利要求1至10之一的一种肽化合物，具有结构式
Figure 931084067_IMG5
其中-A与权利要求1至5之一中定义的相同。
12、根据权利要求1至11之一的化合物的氨基保护、羟基保护、硫羟保护和/或羧基保护衍生物。
13、一种药物组合物，该组合物包含根据权利要求1至11之一的一种肽化合物以及药物载体或赋形剂。
14、权利要求1至11之一的肽化合物用于抑制细胞分裂。
15、权利要求1至11之一的肽化合物用于抑制骨髓的组织生成或再生。
16、权利要求1至11之一的肽化合物的用途，该化合物用于制造抑制细胞分裂的药物。
17、根据权利要求15的用途，该化合物用于制造抑制骨髓的组织生成或再生的药物。
18、权利要求1至11之一的肽化合物的用途，该化合物用于抑制细胞分裂。
19、根据权利要求18的用途，该化合物用于抑制骨髓的组织生成或再生。
20、一种抑制患者体内细胞分裂的方法，所述方法包含给予患者有效剂量的权利要求1至11之一的一种化合物。
21、根据权利要求20的方法，其中骨髓组织生成细胞或者骨髓细胞的分裂被抑制。
22、生产权利要求1至11之一中的一种肽化合物的方法，该方法包括部分或完全被保护衍生物的去保护。
23、生产权利要求1至11之一中的一种肽化合物的方法，所述方法包括
a）将双内酰亚胺醚金属取代、再烷基取代，从而生成双内酰亚胺二肽醚;
b）水解步骤（a）的双内酰亚胺二肽醚，从而生成具有NH2-CH（A）-COOH结构的氨基酸，其中A如上文所定义;
c）将其余氨基酸引入肽链中;以及
d）任何被保护基的去保护。
24、一种氨基酸衍生物，具有结构式
Figure 931084067_IMG6
其中-A与权利要求1至5之一所定义的相同。
25、内酰亚胺二肽醚具有结构式
Figure 931084067_IMG7
其中-A与权利要求1至5之一所定义的相同。
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