CN108587931A - 一株降解青霉素的粘质红酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株降解青霉素的粘质红酵母及其应用，属于微生物技术领域。本发明的粘质红酵母于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2018202，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明的粘质红酵母与现有具有青霉素降解能力的菌株相比，其耐受青霉素的浓度(20g/L)是国内已知的其他菌株的50倍；在相同时间内青霉素浓度降低的值远高于其他菌株所能达到的值，有期望运用于实际生产中对菌渣的处理，将具有极高的降解菌渣中残留的青霉素的能力。
Description
技术领域
本发明涉及一株降解青霉素的粘质红酵母及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
青霉素自1928年被发现以来，因其抗菌特性被广泛应用于医疗临床方面，直至今天仍被大量使用。青霉素可以阻碍细菌黏肽的合成，使细胞壁不能顺利合成，进而导致细菌破裂死亡。一些青霉素制药厂发酵生产的过程中会产生大量的固体废弃物菌渣，主要含有微生物菌丝体、未代谢利用完的有机物、无机盐、少量残留青霉素及其降解产物，青霉素菌渣可以被制成有机肥用于蔬菜和粮食作物增产以及作为生产蛋白饲料的饲料添加剂用于喂养牲畜，均取得了较好的资源化利用效果。但是，生产发酵过程中产生的菌渣未能有简单高效的处理方式，如果处理不完全可能会残留有较多的青霉素，其在资源化利用过程中，会通过食物链在动植物体内积累，并会随着动物粪便、尿液等排入土壤或水环境中，造成潜在的生态风险。抗生素在环境中的分布，可诱导环境微生物产生抗性基因，从而会对生态系统多样性、稳定性、遗传性及公共健康产生表观或潜在的威胁。
我国是世界最大的青霉素生产国和出口国，每年产生大量青霉素菌渣，传统菌渣仅作为废弃物进行填埋或者焚烧处理，浪费了大量有机资源，且不能有效处理掉菌渣中残留的青霉素，对环境存在巨大的潜在威胁。目前我国还没有完整且成熟的化学集中处理工艺，且耗资较大，不适用于菌渣大规模的处理。相比之下，利用堆肥化处理青霉素菌渣，通过堆肥过程中微生物作用降解残留青霉素，拥有绿色、环保、经济、处理方式简单等优点。因此，从土壤或菌渣中筛选得到一种具有高效降解青霉素能力的菌株，将大大缩短堆肥化的时间，提高菌渣中残留青霉素降解效率，不仅实现了菌渣的无害化处理，还可以对菌渣的进一步回收利用，具有极大的实际意义和经济价值。
近几年来虽然有筛选具有降解青霉素能力的菌株的例子，但国内外的研究并不多，且存在着菌株耐受青霉素浓度不高，降解青霉素效率低等问题，无法满足实际生产中菌渣处理的需要。因此，筛选一株高效降解青霉素的菌株，从而实现对菌渣的有效处理和回收，将对环境和工业带来极大的实际意义和利用价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株能够高效降解青霉素的粘质红酵母。
本发明的第一个目的是提供一株降解青霉素的粘质红酵母，分类学命名为粘质红酵母Rhodotorula mucilaginosa Anti-Pen20，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2018202，保藏地址为中国武汉武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述粘质红酵母细胞为卵圆形，无鞭毛，有出芽现象。
在本发明的一种实施方式中，所述粘质红酵母的最适生长温度范围为25-30℃，最适pH范围是4.0-7.0。
本发明的第二个目的是提供所述粘质红酵母在降解青霉素中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在含青霉素菌渣中接种所述粘质红酵母，发酵降解青霉素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘质红酵母的接种量为1％-20％。
本发明的第三个目的是提供所述粘质红酵母在肥料、饲料制备中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种包含所述粘质红酵母的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明的第五个目的是提供所述微生物菌剂在降解青霉素中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述微生物菌剂在肥料、饲料制备中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供的菌株与现有具有青霉素降解能力的菌株相比，其耐受青霉素的浓度(20g/L)是国内已知的其他菌株的50倍；在相同时间内青霉素浓度降低的值远高于其他菌株所能达到的值，有期望运用于实际生产中对菌渣的处理，将具有极高的降解菌渣中残留的青霉素的能力。
生物材料保藏
粘质红酵母Anti-Pen20，分类学命名为粘质红酵母Rhodotorula mucilaginosaAnti-Pen20，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2018202，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1是粘质红酵母Anti-Pen20在透射电镜下的细胞形态；
图2是粘质红酵母Anti-Pen20在含有浓度为20g/L的青霉素的培养基中的生长曲线图；
图3是粘质红酵母Anti-Pen20处理含青霉素培养基的高效液相色谱图；
其中，a是指检测培养基加入青霉素未接入菌液的0h的色谱图象，b是指检测培养基加入青霉素未加入菌液的72h的色谱图象，c是指检测培养基加入青霉素加入Anti-Pen20菌液后72h的色谱图象，d是指检测培养基加入Anti-Pen20菌液未加青霉素的72h的色谱图象；
图4是粘质红酵母Anti-Pen20测序比对后制作的系统发育树图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：菌株筛选
称取样品土壤各10g，分别放入装有100ml无菌和一层玻璃珠的锥形瓶中，摇床震荡10min，充分打散，制成10-1g·L-1菌悬液，用蒸馏水10倍逐级稀释至10-5g·L-1，10-6g·L-1，10-7g·L-1浓度，取此三个浓度菌悬液分别涂布到预先制备好的含有青霉素浓度为12g/L的YPD培养基上，涂布量均为100μL。置于30℃恒温培养箱中培养。培养24h后将长出来的菌株转移到浓度为20g/L青霉素的YPD培养基上，再经过多次分离纯化操作，得到单菌落的菌株，命名为Anti-Pen20。
如图1所示，在透射电镜下，细胞为卵圆形，无鞭毛，有出芽现象。采用酵母基因组DNA提取试剂盒，提取纯培养物的全基因组，并通过真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR，经测序比对并查阅相关模式菌株制作系统发育树，Anti-Pen20与粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)的亲缘关系超过了99％，鉴定菌株为粘质红酵母。已于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2018202，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：菌株生理生化研究
(1)最适生长温度实验
将菌株接种于YPD培养基上，分别置于25℃、30℃、37℃、40℃恒温培养箱中进行培养，培养1-2d，观察并记录各菌株生长情况。得知菌株的最适生长温度范围为25-30℃。
(2)最适生长pH实验
配制pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的YPD培养基，用HCl溶液和NaOH溶液进行pH值调节，pH计进行pH值测定。将菌株接种于pH值不同的淀粉培养基上，于30℃恒温培养箱中进行培养，培养1-2d，观察并记录各菌株生长情况。得知菌株的最适生长PH范围为4.0-7.0。
(3)菌株的生长情况
菌株在检测培养基条件下：KH2PO3 3g/L，K2HPO3 1g/L，NH3NO3 0.5g/L，Na2SO40.1g/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·2H2O 1mg/L，Fe2SO4·7H2O 1mg/L，CaCl2 0.5mg/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，蒸馏水补足。如图2所示，当加入青霉素使浓度为20g/L，接种量为1％时，30℃恒温振荡培养Anti-Pen20在前7个小时内生长较慢，培养的第8-16h为菌株的生长对数期，在培养20h后进入了生长稳定期。
在最优的温度与pH条件下，外加碳氮源，菌株接种量为10％，在30℃的恒温摇床中培养对不同的青霉素初始浓度的降解情况见表1。
表1 Anti-Pen20在不同的青霉素初始浓度下的降解率
将Anti-Pen20菌株与其他研究中所述的具有青霉素降解能力的菌株相比，结果见表2，在最佳降解条件下，其耐受青霉素的浓度(20g/L)是国内已知的其他菌株的50倍，降解青霉素的效率大大高于其他菌株，有期望运用于实际生产中对菌渣的处理，将具有极高的降解菌渣中残留的青霉素的能力。
表2国内已有的几种研究降解青霉素的菌株的比较
参考文献：
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实施例3：发酵液中青霉素浓度检测
设置3组检测培养基，第一组在检测培养基中加入青霉素使之浓度为20g/L且不加入菌液，第二组在检测培养基中加入青霉素使之浓度为20g/L且接种10％的Anti-Pen20菌液，第三组在检测培养基中直接接种10％的Anti-Pen20菌液未加入青霉素，置于30℃恒温摇床中培养后取发酵液进行处理，通过高效液相色谱仪对发酵液进行分析，以青霉素标准溶液(0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L的青霉素溶液，以检测培养基作为溶剂)为标准，结果如图3所示，结果显示第一组青霉素的浓度几乎不变，而第二组在培养72h后对青霉素的降解率可达到90％，说明在自然条件下青霉素自身几乎不发生降解，而在加入了Anti-Pen20菌液之后，青霉素浓度显著下降，当降低青霉素的初始浓度为1g/L时Anti-Pen20对青霉素的降解率可达到99％。第三组可以更加直观排除检测培养基中的物质干扰，便于分析青霉素的降解产物。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.一株粘质红酵母，其特征在于，分类学命名为粘质红酵母Rhodotorulamucilaginosa Anti-Pen20，于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2018202，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述粘质红酵母在降解青霉素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是在含青霉素菌渣中接种所述粘质红酵母，发酵降解青霉素。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粘质红酵母的接种量为1％-20％。
5.权利要求1所述的粘质红酵母在肥料、饲料制备中的应用。
6.一种包含权利要求1所述的粘质红酵母的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
8.权利要求6所述的微生物菌剂在降解青霉素中的应用。
9.权利要求6所述的微生物菌剂在肥料、饲料制备中的应用。
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