CN108573468B - 用于被成像的样品的光学畸变校正方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于被成像的样品的光学畸变校正。描述了用于在具有重复斑点的图案化样品的成像期间动态校正图像畸变的技术。不同组的图像畸变校正系数可以在多周期成像运行的第一成像周期期间针对样品的不同区域被计算出并且随后被实时地应用于在后续周期期间所生成的图像数据。在一个实施方式中，可以通过以下步骤针对具有重复斑点的图案化样品的图像计算图像畸变校正系数：估计图像的仿射变换；锐化该图像；以及迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括计算图像中的斑点位置的平均纯净度，并且其中在搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。

Description

用于被成像的样品的光学畸变校正方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月7日提交的并且题为“Optical Distortion Correctionfor Imaged Samples”的美国临时专利申请第62/468,347号的权益，该美国临时专利申请通过引用的方式以其整体并入本文。本申请还要求于2017年5月5日提交的题为“OpticalDistortion Correction for Imaged Samples”的荷兰专利申请第N2018852号的权益。
背景
用光学透镜成像的一个问题是透镜的几何形状在图像中引起不同类型的畸变。这种畸变可能包括例如放大畸变、偏斜畸变、平移畸变以及诸如桶形畸变和枕形畸变的非线性畸变。这些畸变通常在更偏离图像的中心的图像点中更明显。
在沿一个方向扫描样品的平面的线扫描器中，沿被扫描的图像的垂直于扫描方向的边缘的一个维度上的畸变可能最为明显。例如，由光学系统的物镜或其他光学部件引起的像差可能引入“拉伸畸变”，由此放大倍率沿着一个轴(例如，在沿着该轴扫描线的情况下的x轴)变化。这种畸变对于具有大量(例如，数千、数百万、数十亿等)图案化斑点的底物的多周期成像是特别有害的，因为它可能使被扫描的图像上的斑点的实际位置偏移远离斑点的预期位置。这可能导致在多周期成像运行期间的数据吞吐量的下降和错误率的增加。这个问题通过图1A至图1B图示出。图1A示出了具有带荧光染料的多个样品区域的图案化目标的扫描图像的中心。在图像的中心处，没有斑点50的可检测出的畸变。图1B示出了图1A的扫描图像的右侧。在右侧，斑点50的光学畸变变得明显。
概述
本文中所公开的示例涉及用于校正被成像的样品中的光学畸变的技术。
在第一示例中，一种方法包括：执行包括多个斑点的图案化样品的第一成像周期；将在该第一成像周期期间生成的第一组成像数据划分成第一多个成像数据子集，该第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集对应于该图案化样品的相应区域，该图案化样品的相应区域中的每个区域包括多个斑点；针对该第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数；执行该图案化样品的第二成像周期以生成第二组成像数据；以及将在该第二成像周期期间生成的该第二组成像数据划分为第二多个成像数据子集，该第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集与该第一多个成像数据子集中的一个成像数据子集对应于该图案化样品的相同的相应区域；以及针对该第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集，应用针对该第一多个成像数据子集中的对应于该图案化样品的相同的相应区域的一个成像数据子集所计算出的畸变校正系数。
在第一示例的一个实施方式中，该图案化样品的斑点中的每个斑点包括荧光标记的核酸，该第一成像周期是第一测序周期，并且该第二成像周期是第二测序周期。
在第一示例的一个实施方式中，该第一组成像数据和该第二组成像数据每个各自包括第一颜色通道的成像数据和第二颜色通道的成像数据，并且针对该第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括针对每个成像数据子集的每个颜色通道确定一组畸变校正系数。
在第一示例的一个实施方式中，针对该第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括：估计该成像数据子集的仿射变换；锐化该成像数据子集；以及迭代地搜索用于该成像数据子集的最佳畸变校正系数组。
在第一示例的一个实施方式中，至少使用该样品上的基准的位置来划分该第一组成像数据和该第二组成像数据，并且使用该基准估计用于该第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集的仿射变换。
在第二示例中，一种用于校正包括多个斑点的图案化样品的图像中的光学畸变的方法，包括：估计该图像的仿射变换；锐化该图像；以及迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括计算该图像中的多个斑点位置的平均纯净度(chastity)，并且其中在该搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
在第二示例的一个实施方式中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括：为该图像生成一组光学畸变校正系数；将所估计出的仿射变换应用于该图像中的多个斑点位置；以及在应用所估计出的仿射变换之后，将该一组光学畸变校正系数应用于多个斑点位置中的每个斑点位置。在另一个实施方式中，该方法包括：在将该一组光学畸变校正系数应用于该多个斑点位置中的每个斑点位置之后，提取该多个斑点位置中的每个斑点位置的信号强度。在又一个实施方式中，该方法包括：对所提取的信号强度进行归一化；以及至少使用经归一化的信号强度来计算多个斑点位置的平均纯净度。
在第二示例的特定实施方式中，至少使用经归一化的信号强度来计算该多个斑点位置的平均纯净度包括：针对多个斑点位置中的每个斑点位置，至少使用从与该斑点位置的经归一化的信号强度相对应的点至高斯质心的距离来确定纯净度。
在第二示例的特定实施方式中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括对该图像中的多个斑点进行二次采样，其中如果经锐化的图像的行中的斑点被二次采样，则经锐化的图像的该行中的所有斑点被二次采样。
通过下面结合附图所进行的详细描述，所公开的技术的其他特征和方面将变得明显，附图以示例的方式图示了根据所公开的技术的示例的特征。该概述并不旨在限制由权利要求和等同物限定的本文中所描述的任何发明的范围。
应当理解的是，前述概念的所有组合(假设这样的概念并不是相互不一致的)被认为是本文中所公开的发明主题的一部分。具体而言，出现在本公开结尾处的所要求保护的主题的所有组合被认为是本文中所公开的发明主题的一部分。
附图说明
根据一个或更多个不同的示例，参照以下附图详细地描述本公开。提供这些图仅用于说明的目的并且仅描绘典型的或示例性实施方式。
图1A示出了在一个示例中具有带有荧光染料的多个样品区域的图案化目标的扫描图像的中心。
图1B示出了图1A的扫描图像的右侧。
图2A图示了在一个示例中可以利用其实现本文中所公开的系统和方法的示例图像扫描系统的广义框图。
图2B是图示了可在特定实施方式中实现的示例双通道线扫描模块化光学成像系统的框图。
图3图示了可以根据本文中所公开的实施方式成像的图案化样品的示例配置。
图4是图示了根据本公开的可被实现用于在成像运行期间动态校正图像畸变的示例方法的操作流程图。
图5可视地图示了在一个示例中可以如何将成像数据划分成用于对具有斑点阵列的样品进行成像的N通道成像系统的多个成像数据子集。
图6是图示了计算由成像系统所生成的成像数据的畸变校正系数的示例方法的操作流程图。
图7示出了包括六个基准的示例图块。
图8图示了在一个测序周期期间从双通道碱基识别(base calling)得到的示例云。
图9A图示了在一个示例中的用于恰好在使用流动池(flow cells)的双通道测序仪器上的光学器件的一组图块的畸变曲线的集合。
图9B图示了在一个示例中的用于恰好在使用流动池的另一个双通道测序仪器上的光学器件的一组图块的畸变曲线的集合。
图9C图示了在一个示例中的与用于恰好在使用流动池的四通道测序仪器上的光学器件的一组图块的两个不同颜色通道相对应的四条畸变曲线。
图10A是示例实验结果的盒须图，其图示了在没有畸变校正的情况下，使用线扫描器测序的流动池的斑点通过纯净度过滤器的百分比(％PF)，在图块相对于X的视场上进行分组。
图10B是示例实验结果的盒须图，其示出了在畸变校正之后，经测序的流动池的斑点通过纯净度过滤器的百分比。
图11是图示了用于确定可以被用于优化成像透镜(例如，物镜)的设计的光学畸变校正参数的示例方法的操作流程图。
图12是示出了在应用五阶多项式校正畸变之后，透镜的视场上的像素中的示例残余光学畸变的残余畸变图。
图13图示了可以被用于实现本公开中所描述的实施方式的各种特征的示例计算模块。
附图不是详尽的且不将本公开限于所公开的精确形式。
详细描述
如在本文中用于指代样品的术语“斑点”或“特征”旨在表示图案中的可以根据相对位置与其他的点或区域区分开的点或区域。单个斑点可以包括特定类型的一个或更多个分子。例如，斑点可以包括具有特定序列的单个靶核酸分子，或斑点可以包括具有相同序列(和/或其互补序列)的几个核酸分子。
如本文中所使用的，术语“基准(fiducial)”旨在表示物体中或物体上的可区分的参考点。参考点可以呈现在物体的图像中或者呈现在从检测物体得到的另一个数据集中。参考点可以通过物体平面中的x和/或y坐标来指定。可替代地或另外地，参考点可以由与xy平面正交的z坐标来指定，例如由物体和检测器的相对位置来定义。可以相对于物体的一个或更多个其他特征或从物体得到的图像或其他数据集的一个或更多个其他特征来指定参考点的一个或更多个坐标。
如本文中所使用的，术语“图块”通常是指样品的相同区域的一个或更多个图像，其中一个或更多个图像中的每一个图像代表相应的颜色通道。图块可以形成一个成像周期的成像数据集的成像数据子集。
如本文中所使用的，术语“纯净度”通常指计分度量，其提供对图块上的斑点位置的整体“质量”的测量。可以在将畸变校正系数应用于斑点位置之前和之后确定纯净度。平均纯净度指在图块上的所有斑点位置或斑点位置的子集上的纯净度的平均值。
如本文所使用的，术语“xy平面”旨在表示由笛卡尔坐标系中的直线轴线x和y所定义的2维区域。当参考检测器和通过检测器所观察到的物体而使用时，该区域还可以被指定为与检测器和被检测的物体之间的观察方向正交。当在本文中用于指代线扫描器时，术语“y方向”是指扫描的方向。
如本文中所使用的，术语“z坐标”旨在表示指定沿着与xy平面正交的轴线的点、线或区域的位置的信息。在特定实施方式中，z轴正交于物体的通过检测器所观察到的区域。例如，可以沿着z轴指定光学系统的聚焦方向。
如本文中所使用的，术语“扫描线”旨在表示检测物体的xy平面中的二维横截面，该横截面是矩形或长方形的(oblong)，并且导致横截面与物体之间的相对移动。例如，在荧光成像的情况下，物体的具有矩形或长方形形状的区域可以(在排除其他区域处)被特别地激发和/或可以在扫描时的给定时间点(在排除其他区域处)特别地获取来自该区域的发射。
本文中所公开的实施方式涉及在具有多个重复斑点的图案化样品的成像期间动态地校正图像畸变。图像畸变校正系数可以在多周期成像运行 (例如，测序运行)的第一成像周期期间被计算并且随后被实时地应用于在随后的周期期间所生成的图像数据。
在第一实施方式中，在样品的校准(例如，第一)成像周期期间生成的成像数据可以被分成与图案化样品的相应区域相对应的多个成像数据子集(例如，图块)。每个图块可以包含与图案化样品的区域中的相应的多个采样斑点相对应的多个斑点。可以针对每个图块计算一组畸变校正系数。在图块包括用于多个颜色通道的成像数据的情况中，则可以针对图块的每个颜色通道生成一组畸变校正系数。在图案化样品的后续成像周期期间，在校准成像周期期间所计算出的每组畸变系数可以被应用于相应的图块。以这种方式，可以针对样品的不同区域独立地校正图像畸变。这个区域特定畸变校正允许校正全局刚性配准未考虑的畸变。例如，可以由透镜的形状引发(不被线性仿射变换考虑的)非线性畸变。另外，被成像的底物还会由于制造工艺而在图案中引入畸变，例如，由于底物的非刚性，通过结合或移动阱(wells)而引入的3D浴缸效应。最后，保持器内的底物的倾斜(tilt)不会被线性仿射变换考虑。
在第二实施方式中，描述了用于生成用于图块的畸变校正系数的特定方法。该方法包括以下步骤：使用图块中的基准来估计图块的单一仿射变换；锐化该图块；并且运行对使图块中的多个斑点的平均纯净度最大化的畸变校正系数的搜索。通过仅执行图像的单一仿射变换，所公开的方法可以显著减少搜索最佳的一组畸变校正系数所需要的时间。在特定实施方式中，对畸变校正系数的搜索可以迭代以下步骤：生成一组畸变校正系数；将所生成的畸变校正系数应用于图像中的每个斑点位置；提取图像中每个斑点位置的信号强度；对信号强度进行空间归一化；计算图块中多个斑点位置的平均纯净度；以及使用至少所计算出的平均纯净度来确定是否迭代搜索畸变校正系数。
在特定实施方式中，用于生成畸变校正系数的所公开的方法可以用于校正图像数据中的图像畸变，该图像数据包括将四个不同样品(例如，四种不同的DNA碱基类型)的标识编码为两个图像的强度的组合的两个不同的颜色通道图像。
在描述本文中所公开的系统和方法的各种实施方式之前，描述可以利用其实现本文中所公开的技术的示例环境是有用的。一个这样的示例环境是图2A中所图示的成像系统100的环境。该示例成像系统可以包括用于获得或产生样品的图像的设备。图2A中概述的示例示出了背光设计实施方式的示例成像配置。应当注意的是，尽管可以在示例成像系统100的上下文中不时地描述本文中的系统和方法，但是这些仅仅是可以利用其实现本文中所公开的图像畸变校正方法的实施方式的示例。
从图2A的示例中可以看出，受试者样品位于样品容器110上(例如，如本文中所描述的流动池)，该样品容器被定位在物镜142下方的样品台 170上。光源160和关联的光学器件将诸如激光的光束引导到位于样品容器110上的选定样品位置。样品发出荧光并且由物镜142收集所得到的光并且将其引导至相机系统140的图像传感器以检测荧光。样品台170相对于物镜142被移动以将样品容器110上的下一个样品位置定位在物镜142 的焦点处。样品台170相对于物镜142的移动可以通过移动样品台自身、物镜、成像系统的一些其他部件或前述的任何组合来实现。另一实施方式还可以包括在静止样品上移动整个成像系统。
流体传送模块或设备100将试剂(例如，荧光标记的核苷酸、缓冲液、酶、裂解试剂等)的流引导至(并且穿过)样品容器110和废液阀120。样品容器110可以包括在其上设置样品的一个或更多个底物。例如，在系统分析大量不同核酸序列的情况下，样品容器110可以包括待测序的核酸被结合、附接或联合在其上的一个或更多个底物。在各种实施方式中，底物可以包括核酸可以附接的任何惰性底物或基质，例如，诸如玻璃表面、塑料表面、胶乳、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶片。在一些应用中，底物处于形成在跨样品容器110的矩阵或阵列中的多个位置处的通道或其他区域内。
在一些实施方式中，样品容器110可以包括使用一种或更多种荧光染料成像的生物样品。例如，在特定实施方式中，样品容器110可以实现为包括半透明盖板、底物和夹在其间的液体的图案化流动池，并且生物样品可以位于半透明盖板的内表面或底物的内表面处。流动池可以包括至底物中的大量(例如，数千、数百万或数十亿)的阱或区域，其被图案化成所定义的阵列(例如，六边形阵列、矩形阵列等)。每个区域例如使用通过合成测序可以形成诸如DNA、RNA或可以被测序的另一种基因组材料的生物样品的簇(例如，单克隆簇)。流动池还可以被划分成多个间隔开的流道(例如，八个流道)，每个流道包括六边形的簇阵列。美国专利第 8,778,848号中描述了可以被用于本文中所公开的实施方式中的示例流动池。
该系统还包括温度站致动器130和加热器/冷却器135，其可以可选地调节样品容器110内的流体的条件的温度。可以包括相机系统140以监测和追踪样品容器110的测序。相机系统140可以例如被实现为电荷耦合器件(CCD)相机(例如，时间延迟积分(TDI)CCD相机)，其可以与滤光片切换组件145中的各种滤光片、物镜142和聚焦激光器/聚焦激光器组件150相互作用。相机系统140不限于CCD相机并且可以使用其他相机和图像传感器技术。在特定实施方式中，相机传感器可具有在约5μm与约15μm之间的像素大小。
来自相机系统140的传感器的输出数据可被传送到实时分析模块(未示出)，该实时分析模块可被实现为软件应用程序，该软件应用程序分析图像数据(例如，图像质量计分)、向图形用户界面(GUI)报告或显示激光束的特性(例如，聚焦、形状、强度、功率、亮度、位置)，并且如下面进一步描述的，动态地校正图像数据中的畸变。
可以包括光源160(例如，可选地包括多个激光器的组件内的激发激光器)或其他光源以经由通过光纤接口(其可以可选地包括一个或更多个再成像透镜、光纤安装件等)的照明来照射样品内的荧光测序反应。还在所示出的示例中呈现了低瓦特灯165、聚焦激光器150以及反向二向色件。在一些实施方式中，聚焦激光器150可以在成像期间被关闭。在其他实施方式中，可替代的聚焦配置可以包括第二聚焦相机(未示出)，其可以是象限检测器、位置敏感检测器(PSD)或类似的检测器以与数据收集并发地测量从表面反射的散射波束的位置。
虽然图示为背光设备，但是其他示例可以包括来自激光器或其他光源的光，其通过物镜142被引导到样品容器110上的样品上。样品容器110 可以最终安装在样品台170上以提供样品容器110相对于物镜142的移动和对准。样品台可以具有一个或更多个致动器以允许其沿三个维度中的任一个移动。例如，就笛卡尔坐标系而言，可以提供致动器以允许台沿相对于物镜的X、Y和Z方向移动。这可以允许样品容器110上的一个或更多个样品位置被定位为与物镜142光学对准。
在这个示例中，聚焦(z轴)部件175被示出为被包括以控制光学部件相对于样品容器110在聚焦方向(通常被称为z轴或z方向)上的定位。聚焦部件175可包括物理耦合到光学台或样品台或两者的一个或更多个致动器，以使样品台170上的样品容器110相对于光学组件(例如，物镜142) 移动，以提供用于成像操作的适当聚焦。例如，致动器可以诸如例如通过机械的、磁性的、流体的而物理耦合到相应的台，或以其他方式直接或间接附接至台或者与台相接触。一个或更多个致动器可以被配置为在将样品台保持在同一平面内(例如，保持垂直于光轴的水平或水平姿态)的同时沿z方向移动台。一个或更多个致动器也可以被配置为使台倾斜。这可以被完成，例如，使得样品容器110可以被动态调整以考虑其表面中的任何斜率。
系统的聚焦通常是指将物镜的焦平面与将在所选样品位置处成像的样品对准。然而，例如，聚焦还可以指对系统进行调整以获得用于表示样品的期望特性，诸如用于测试样品的图像的期望水平的锐度或对比度。因为物镜的焦平面的可用景深可能小(有时在1μm或更小的量级上)，所以聚焦部件175紧紧跟随正在被成像的表面。因为样品容器不如被固定在仪器中那样完全平坦，所以聚焦部件175可以被设定为在沿着扫描方向(在本文中称之为y轴)移动时遵循其轮廓(profile)。
从样品位置处的被成像的测试样品发出的光可以被引导至相机系统 140的一个或更多个检测器。光圈可以被包括并且被定位成仅允许从焦点区域发出的光传递到检测器。可以包含光圈以通过滤除从焦点区域以外的区域发出的光的成分来提高图像质量。发射滤光片可以被包括在滤光片切换组件145中，其可以被选择以记录所确定的发射波长并且除去任何杂散激光。
尽管未示出，但可以提供控制器以控制扫描系统的操作。例如，控制器可以被实现为控制诸如聚焦、台移动和成像操作的系统操作的方面。在各种实施方式中，可以使用硬件、算法(例如机器可执行指令)或前述的组合来实现控制器。例如，在一些实施方式中，控制器可以包括具有关联存储器的一个或更多个CPU或处理器。作为另一个示例，控制器可以包括控制操作的硬件或其他电路，诸如计算机处理器和其上存储有机器可读指令的非暂时性计算机可读介质。例如，此电路可以包括下列中的一个或更多个：现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)、可编程逻辑器件(PLD)、复杂可编程逻辑器件(CPLD)、可编程逻辑阵列(PLA)、可编程阵列逻辑(PAL)或其他类似的处理设备或电路。作为又一个示例，控制器可以包括此电路与一个或更多个处理器的组合。
图2B是图示了可在特定实施方式中实现的示例双通道线扫描模块化光学成像系统200的框图。应当注意的是，尽管可以在示例成像系统200 的上下文中不时地描述本文中的系统和方法，但是这些仅仅是可以利用其实现本文中所公开的技术的实施方式的示例。
在一些实施方式中，系统200可以用于核酸的测序。可适用的技术包括核酸附着在阵列中的固定位置(例如，流动池的阱)并且阵列被重复成像的那些技术。在这样的实施方式中，系统200可以在两个不同的颜色通道中获得图像，其可以用于将特定的核苷酸碱基类型与另一个区分开。更具体地，系统200可以实施被称为“碱基识别”的过程，其通常指针对在成像周期时的图像的给定斑点位置确定碱基识别(例如，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T))的过程。在双通道碱基识别期间，从两个图像提取的图像数据可以被用于通过将碱基标识编码为两个图像的强度的组合来确定四种碱基类型之一的存在。对于两个图像中的每一个图像中的给定斑点或位置，可以基于信号标识的组合是[开，开]、[开，关]、[关，开]还是[关，关]来确定碱基标识。
再次参照成像系统200，该系统包括设置在其中的具有两个光源211 和212的线生成模块(LGM)210。光源211和212可以是相干光源，诸如输出激光束的激光二极管。光源211可以以第一波长(例如，红色波长) 发射光，并且光源212可以以第二波长(例如，绿色波长)发射光。从激光源211和212输出的光束可以被引导通过波束成形透镜或透镜213。在一些实施方式中，单个光成形透镜可以被用于使从两个光源输出的光束成形。在其他实施方式中，单独的波束成形透镜可以被用于每个光束。在一些示例中，波束成形透镜是鲍威尔透镜，使得光束被成形为线图案。LGM 210的波束成形透镜或成像系统的其他光学部件被配置为将由光源211和 212发射的光成形为线图案(例如，通过使用一个或更多个鲍威尔透镜，或其他波束成形透镜，衍射或散射部件)。
LGM 210还可以包括被配置为将通过单个接口端口的光束引导至发射光学模块(EOM)230的反射镜214和半反射镜215。光束可以穿过快门元件216。EOM 230可以包括物镜235和使物镜235纵向移动更靠近或远离目标250的z台(z-stage)236。例如，目标250可以包括液体层252 和半透明盖板251，并且生物样品可以位于半透明盖板的内表面以及位于在液体层下方的底物层的内表面处。然后，z台可以移动物镜以将光束聚焦到流动池的任一内表面上(例如，聚焦在生物样品上)。如本领域已知的，生物样品可以是DNA、RNA、蛋白质或响应于光学测序的其他生物材料。
EOM 230可以包括半反射镜233以将从聚焦跟踪模块(FTM)240发射的聚焦跟踪光束反射到目标250上，并且然后将从目标250返回的光反射回到FTM 240中。FTM 240可以包括聚焦跟踪光学传感器以检测所返回的聚焦跟踪光束的特性并且生成反馈信号以优化物镜235在目标250上的聚焦。
EOM 230还可以包括半反射镜234以引导光通过物镜235，同时允许从目标250返回的光穿过。在一些实施方式中，EOM 230可以包括镜筒透镜232。透射通过镜筒透镜232的光可以穿过滤光片元件231并且进入相机模块(CAM)220中。CAM 220可以包括一个或更多个光学传感器221 以响应于入射光束来检测从生物样品发射的光(例如，响应于从光源211 和212接收的红光和绿光的荧光)。
来自CAM 220的传感器的输出数据可以被传送到实时分析模块225。在各种实施方式中，实时分析模块执行计算机可读指令，该计算机可读指令用于分析图像数据(例如，图像质量计分，碱基识别等)、向图形用户界面(GUI)报告或显示波束的特性(例如，焦点、形状、强度、功率、亮度、位置)等。这些操作可以在成像周期期间实时执行以最小化下游分析时间并且在成像运行期间提供实时反馈和故障排除。在实施方式中，实时分析模块可以是通信地耦合到成像系统200并控制成像系统200的计算设备(例如，计算设备1000)。在下面进一步描述的实施方式中，实时分析模块225可以另外地执行用于校正从CAM 220接收的输出图像数据中的畸变的计算机可读指令。
图3图示了根据本文中所公开的实施方式的可以被成像的图案化样品 300的示例配置。在这个示例中，样品300被图案化为可以在成像运行期间同时被成像的有序斑点或特征310的六边形阵列。尽管在这个示例中图示了六边形阵列，但是在其他实施方式中，可以使用直线阵列、圆形阵列、八角形阵列或一些其他阵列图案对样品进行图案化。为了便于说明，样品 300被图示为具有数十至数百个斑点310。然而，如本领域技术人员将理解的，样品300可以具有数千、数百万或数十亿个被成像的斑点310。此外，在一些情况下，样品300可以是包括在成像运行期间被采样的斑点310 的(垂直于聚焦方向的)多个平面的多平面样品。
在特定实施方式中，样品300可以是被图案化为被划分成流道的数百万或数十亿个阱的流动池。在这个特定实施方式中，流动池的每个阱可以包含使用通过合成测序进行测序的生物材料。
如上所述，由于光学畸变可能使扫描图像的斑点的实际位置偏移远离斑点的预期位置，故光学畸变对于具有大量斑点的图案化样品300的多周期成像可能是特别不利的。这种畸变效应可能沿着视场的边缘变得特别明显，从而可能使得来自这些斑点的成像数据不可用。这可能导致在多周期成像运行期间的数据吞吐量下降和错误率增加。下面描述的实施方式涉及在成像运行(例如，测序运行)期间动态校正图像畸变，由此在成像运行期间提高数据吞吐量和降低错误率。
图4是图示了根据本公开的可被实现用于在成像运行期间动态校正图像畸变的示例方法400的操作流程图。尽管将在双通道成像系统(例如，成像系统200)的上下文中不时地描述方法400，但方法400可应用于具有任何数量的通道(例如，一个通道、三个通道、四个通道等)的成像系统。
在操作410处，执行图案化样品的校准成像周期。在校准成像周期期间，可以通过使用一个或更多个相干光源扫描样品区域(例如，使用线扫描器)来收集整个样品的图像数据。借助于示例，成像系统200可以与系统的光学器件相协调地使用LGM 210以利用具有红色光谱内的波长的光对样品进行线扫描以及利用具有绿色光谱内的波长的光对样品进行线扫描。响应于线扫描，位于样品的不同点处的荧光染料可以发荧光，并且所得到的光可以被物镜235收集并且被引导至CAM 220的图像传感器以检测荧光。例如，每个斑点的荧光可以由CAM 220的几个像素检测。然后可以将从CAM 220输出的图像数据传送到实时分析模块225以用于图像畸变校正(例如，由物镜235的几何形状引起的图像畸变的校正)。
在各种实施方式中，校准成像周期可以是多周期成像运行(例如，DNA 测序运行)的最开始的成像周期。特别地，成像系统可以在每一次成像运行的开始期间自动确定畸变校正系数，从而防止成像系统随着时间的畸变漂移。
在操作430处，由校准成像周期生成的成像数据被划分成与图案化样品的相应区域相对应的多个成像数据子集(例如，图块)。换句话说，成像数据子集包括一个成像周期的成像数据集的像素的子集。图5可视地图示了可如何将成像数据划分成用于对具有斑点阵列的样品(例如，样品300) 成像的N通道成像系统的多个成像数据子集。为了简单起见，未通过图5 示出图像畸变。如所示出的，对于每个通道，图像数据可以被细分成与样品的区域相对应的多个图块445或成像数据子集。每个成像数据子集本身包括多个图像斑点443，该多个图像斑点可能从它们在样品上的(特别是沿着图块的边缘的)预期位置畸变。借助于示例，用于2通道成像器的成像数据子集可以包括针对每个通道的样品的相应区域(例如，通道1的右上方图块和通道2的右上方图块)的图像数据。如由图5所示，成像数据被划分成用于每个颜色通道的28个图块。将图像数据划分成多个图块445 允许图像处理操作的并行化。另外地，如下面进一步描述的，这允许针对样品的每个区域的独立畸变校正，这可以校正定位在样品上的额外畸变 (即，不是由于光学器件引起的畸变)。这种畸变可能由流动池的倾斜或由诸如浴缸形状的流动池的3D曲率引起的倾斜被引入。
在各种实施方式中，可以使用基准标记物或基准在成像系统的视场中的布置来确定成像数据子集在样品中或在样品上的尺寸。成像数据子集可以被划分使得每个成像数据子集或图块的像素具有预定数量的基准(例如，至少三个基准、四个基准、六个基准、八个基准等)。例如，成像数据子集的像素总数可以基于成像数据子集的边界与基准之间的预定像素距离来确定。图7图示了包括六个基准510的图块500的一个这样的示例。如下面进一步描述的，这些基准可以被用作用于对准图像和确定畸变系数的参考点。
在下面进一步描述的特定实施方式的操作450处，针对每个成像数据子集独立地计算一组图像畸变校正系数。在成像数据子集包括多个颜色通道的情况下，可以针对每个颜色通道计算单独的一组畸变校正系数。可以应用这些图像畸变校正系数来校正校准成像周期中的图像数据的畸变。
在操作470处，执行图案化样品的下一个成像周期，并且生成新的图像数据。在操作490处，在校准成像周期期间计算的畸变校正系数被应用于当前成像周期的成像数据以校正畸变。每一组所计算出的畸变系数可以被应用于当前周期的成像数据中的对应图块。此后，操作470和490可以被迭代。如此，在初始成像周期期间计算的畸变校正系数可以被应用于随后的成像周期以独立地校正成像数据的不同图块中的畸变。
图6是图示了计算用于由成像系统生成的成像数据的畸变校正系数的示例方法450的操作流程图。应当注意的是，虽然示例方法450被示为被应用于成像数据子集445，但是实际上它可以被应用于全部成像数据集(例如，整个样品的图像数据)。
方法450采用与在成像周期期间生成的样品的区域相对应的成像数据子集445作为输入，并且输出用于多项式的一组畸变校正系数469，其可以被用于校正i)成像数据子集；和ii)在随后的成像周期期间拍摄的样品的相同区域的成像数据的畸变。在成像数据子集包括用于第一颜色通道的成像数据和用于第二颜色通道的成像数据的情况下，可以为成像数据子集的每个通道生成一组畸变校正系数。尽管方法450的实施方式将主要参照确定用于双通道成像数据的畸变校正系数来描述，但应当注意的是，方法 450可以被应用于确定与任何数量的通道相对应的成像数据的畸变校正系数。还应当注意的是，在多通道成像系统中，可以针对与每个通道相对应的成像数据独立地执行操作451-452和461-465。因此，为了简单起见，这些操作将主要被描述为仿佛它们是针对单个通道执行的。为了更加简单，方法450的描述将把成像数据子集445称为图像。
在操作451处，使用图像基准来估计针对图像的仿射变换。例如，如在图7中所示，可以在图像中找到靶眼环基准510(由黑边围绕以增强对比度的光环)以确定它们在图像中的实际位置。在实施方式中，可以通过执行与参考虚拟基准的位置的互相关并且获取互相关分值被最大化的位置来找到图像中的基准的位置。可以使用离散函数的互相关方程执行互相关，方程(1)
Figure GDA0002227964980000161
其中可以使用计分方程(2)计算图像中的基准与虚拟基准之间的拟合优度的测量：
分数＝1-(RunnerUp_CC-Minimum_CC)/(Maximum_CC-MInimum_CC)(2)，其中Minimum_CC是互相关的最小值，Maximum_CC是互相关的最大值，并且RunnerUp_CC是距Maximum_CC的位置4个像素的半径之外的最大互相关值。在美国专利申请第14/530,299号中更详细地描述了用于确定基准的位置的特定方法。
给出基准的理论位置的先验知识(例如，基于基准之间应当有多少等距间隔的斑点)，可以确定将基准的理论位置映射到它们在图像上的实际位置的仿射变换。所估计的仿射变换可以映射从基准的预期位置的平移、旋转和放大。
给出图像的理论位置xi，yi(即，其中基准的像素应当使用实际样品配置)和(其中基准的像素实际上出现在图像上的)实际图像位置xw，yw，仿射变换可以在数学上由方程(3)表示：
Figure GDA0002227964980000171
其中第一矩阵是平移矩阵，第二矩阵是通过x方向上的缩放因子sx和y方向上的缩放因子sy来缩放图像点的缩放矩阵，并且第三矩阵是旋转矩阵，其使图像点围绕z轴(即，在垂直于图像的聚焦方向上)旋转角度θ。可替代地，仿射变换可由方程(4)表示：
Figure GDA0002227964980000172
其中a11和a23系数提供了沿着x和y方向的图像点的平移，并且其他四个系数提供了图像点的缩放和放大的组合。给出图像上的三个基准的实际位置(u1，v1)，(u2，v2)，(u3，v3)以及三个基准的理论位置(x1，y1)，(x2，y2)，(x3，y3)，可以通过求解方程(5)来估计仿射变换：
Figure GDA0002227964980000173
可以通过解最小二乘方程(6)来求解方程(5)：
(6)
Figure GDA0002227964980000174
针对六个变量中的每一个求取误差函数的六个偏导数，并且将这个表达式设置为零给出由方程(7)以矩阵形式表示的六个方程：
Figure GDA0002227964980000175
在操作452处，图像被锐化。例如，可以使用拉普拉斯卷积或本领域已知的其他图像锐化技术来锐化图像。
在操作460处，运行使图像中的多个斑点的平均纯净度最大化的畸变校正系数的迭代搜索。在各种实施方式中，搜索可以是图案化搜索。可替代地，可以应用本领域已知的其他合适的搜索算法。下面进一步描述搜索操作460的步骤。
在某些实施方式中，可以通过对图像内的斑点进行二次采样来加速搜索算法。特别是这些实施方式的双通道实施方式中，二次采样必须包括一定数量的行中的每个斑点。这样做可以解决对于具有[关，关]信号强度的信号的双通道(双色)编码(例如，碱基识别)所独有的问题。在碱基识别的情况下，指定为“关”(未标记)簇的G碱基簇可能被错误地注册为“开”。可替代地，可以从簇之间的空间(即，阱之间的区域)提取信号并将其注册为“关”信号。这个问题通过对一行中的每个阱和足够数量的行进行采样来克服，使得G基簇不驱动纯净度成本函数。
在操作461处，生成一组畸变校正系数。畸变校正系数可以提供图像的畸变校正功能的多项式表示。在实施方式中，畸变校正系数可以对应于二阶多项式、三阶多项式、四阶多项式或五阶多项式或者甚至更高阶多项式。在成像系统是线扫描器的实施方式中，畸变校正可以在数学上由方程 (8)表示：
(8)
Figure GDA0002227964980000181
其中
Figure GDA0002227964980000182
是图像坐标(x，y)的图像内的经畸变校正的位置，a1…an是描述n 阶多项式的畸变校正系数，并且cx是x的图像中的中心点，并且其中y是线扫描器的扫描方向。在这个实施方式中，可以相对于x来测量y中的畸变，因为这是具有最大畸变的维度。在一些情况下，其中y中的畸变是可忽略的(例如，如由成像要求确定的)，则可以假定dy＝0并且图像内的经畸变校正的位置简化为方程(9)：
Figure GDA0002227964980000191
在实施方式中，搜索操作460可以在搜索的第一步骤期间以畸变校正系数的0值开始(即，假设图像中没有畸变)。可替代地，先前获知的一组系数值可以被用于开始搜索。
在操作462处，将在操作451处所估计的仿射变换应用于图像中的斑点位置。例如，可以根据上述的方程(4)应用仿射变换。
在操作463处，在将所估计的仿射变换应用于斑点位置之后，将所生成的畸变校正系数应用于图像中的斑点位置。例如，对于线扫描器，在二维地校正畸变的情况下，可以应用方程(8)。可替代地，如果y中的畸变是可忽略的，则可以应用方程(9)。
在操作464处，针对图像中的每个斑点位置提取信号强度。例如，对于给定的斑点位置，可以通过确定斑点位置中的像素的强度的加权平均来提取信号强度。例如，可以执行中心像素和相邻像素的加权平均，诸如双线性内插。在实施方式中，图像中的每个斑点位置可以包括几个像素(例如，1-5个像素)。
在可选操作465处，所提取的信号强度被空间归一化，以考虑采样成像上的照明变化。例如，强度值可以被归一化，使得第5和第95百分位数分别具有为0和为1的值。
在操作466处，图像的归一化信号强度(例如，每个通道的归一化强度)可以被用于计算图像中多个斑点的平均纯净度。用于计算平均纯净度的示例方法在下面进一步描述。
在一个实施方式中，可以针对实施碱基识别的双通道系统计算平均纯净度，如上所述，碱基识别通常指的是在成像周期期间针对图像的给定斑点位置确定碱基识别(例如，A、C、G或T)的过程。可以通过将数学模型拟合到强度数据来执行碱基识别。可以使用的合适数学模型包括例如k 均值聚类算法、类k均值聚类算法、期望最大化聚类算法、基于直方图的方法等。可以将四个高斯分布拟合于该组双通道强度数据，使得对数据集中所表示的四个核苷酸中的每一个应用一个分布。
在一个特定实施方式中，可以应用期望最大化(EM)算法。作为EM 算法的结果，对于每个X，Y值(分别指代两个通道强度中的每一个)，可以生成代表某个X，Y强度值属于四个高斯分布中的这些数据所拟合的一个高斯分布的似然的值。在四个碱基给出四个独立的分布的情况下，每个 X，Y强度值也将具有四个相关的似然值，一个用于四个碱基中的每一个。四个似然值中的最大值表示碱基识别。这由图8图示出，图8示出如果簇在两个通道中都是“关”，则碱基识别是G。如果簇在一个通道中是“关”并且在另一个通道中是“开”，则碱基识别是C或T(取决于哪个通道为开)，并且如果簇在两个通道中都为“开”，则碱基识别为A。
更一般地，对于涉及任意数量的通道的碱基识别实施方式，可以至少使用通道的强度点到其相应的高斯分布的中心的距离来确定给定图像斑点的纯净度。图像斑点的强度点越接近被识别的碱基的分布中心，则似然越大，被识别的碱基越精确并且其纯净度值越高。在四通道实施方式中，给定斑点的碱基识别的质量(即，纯净度值)可以表示为最高强度值除以该最高值加第二最高值。在双通道实施方式中，给定数据点的碱基识别的质量或纯度可以表示为到最接近质心的距离除以到第二最接近质心的距离的函数。在数学上，对于双通道实施方式的给定点的纯净度可以由方程 (10)表示：
C＝1.0-D1/(D1+D2) (10)，
其中D1是到最近的高斯平均值的距离，并且D2是到高斯平均值的下一个最近距离。可以使用马氏(Mahalanobis)方法测量距离(其考虑到沿由每个高斯质心以及所考虑的点定义的线的分布的宽度)。
在判定467处，确定搜索460是否应当迭代。在各种实施方式中，该确定可以取决于平均纯净度确定是否已经收敛到畸变校正系数的最优集合上，搜索460是否已经迭代了预定次数，是否已经计算了预定的平均纯净度值，或其一些组合。例如，如果一组系数提高整体平均纯净度，那么这些系数可能变成下一次迭代搜索和采样一组新系数的起始点。在特定实施方式中，搜索460可以迭代数十次、数百次甚至数千次(例如，使用图案化搜索)。
图9A至图9B各自分别图示了用于恰好在使用流动池的双通道测序仪器上的光学器件的一组图块的畸变曲线的集合。图9A来自一台仪器并且图9B来自另一台仪器，示出了从仪器到仪器的可变性。曲线由表面(第一个数字)和流道(第二个数字)两者形成。如曲线图所图示的，畸变可能随流动池的流道和表面两者而变化。图9C图示了用于恰好在使用流动池的四通道测序仪器上的光学单元的单个图块的两个不同颜色通道的四条畸变曲线。如此，根据本文中所公开的实施方式的对流通池的不同区域中的图像畸变的独立校正(通过区域和颜色通道两者)可以进一步改善图像质量。
图10A是实验结果的盒须图，其图示了在没有畸变校正的情况下使用线扫描器测序的流动池的斑点通过纯净度过滤器(％PF)的百分比，在图块相对于X的视场范围上进行分级。可以在成像周期期间应用纯净度过滤以滤除来自“不良图像质量”斑点的数据。例如，如果在一定数量的测序周期后斑点没有超过预定的纯净度值，则斑点可以被忽略作为数据点。在图10A中，子图块编号指示斑点相对于图块图像的中心在x方向上的距离。对于给定的x方向，在图块的所有ys(其中y是扫描方向)上对结果进行平均。如所示出的，在没有畸变校正的情况下，图块边缘的小百分比的斑点穿过纯净度过滤器，并且用于这些斑点的数据变得不可用。图10B是根据本公开的实验结果的盒须图，其示出了使用畸变校正时测序的流动池的斑点通过纯净度过滤器的百分比。如图所示，朝着图块的边缘，穿过纯净度过滤器的斑点的数量显著地提高。
在另外的实施方式中，可以通过优化成像系统中的成像透镜(例如，物镜)的光学设计来减少成像系统中的光学畸变。光学透镜的设计可以通过至少使用应用于由透镜拍摄的图像的预定图像畸变校正算法(例如，本文中所描述的图像畸变校正算法)对其进行定制来优化。例如，如果图像畸变校正算法期望透镜中有0.2至0.4个像素的畸变，则与没有畸变相对照，设计具有期望的畸变水平的透镜可能是有利的。
图11是图示了用于确定可以被用于优化成像透镜(例如，物镜)的设计的光学畸变校正参数的示例方法600的操作流程图。方法600接收透镜的视场和图像传感器的像素大小作为输入并且从五阶多项式的拟合位置输出最大绝对光学畸变和最大误差。
在操作610处，计算点扩散函数质心的矢量。点扩散函数的矢量可以通过将最大畸变(DistMax)变量初始化为零并在Dist>DistMax时迭代以下步骤来计算：
·计算场高F处的近轴Y高度(Yref)；
·计算惠更斯点扩散函数的质心(Yreal)；
·计算畸变：Dist＝100*ABSO(Yreal-Yref)/Yref；和
·将Yreal存储在矢量(Vyreal)中，并将F存储在矢量(VF)中。
在操作620处，计算点扩散函数的多项式拟合。这种多项式拟合，在特定实施方式中，可以通过计算以下形式的VF和Vyreal的五阶多项式拟合来计算：Vyreal＝a1*F+a3*F^3+a5*F^5，其中a1表示放大倍率， a3是三阶系数并且a5是五阶系数。
在操作630处，可以将每个质心与拟合位置进行比较。这种比较可以通过将来自拟合位置的最大误差(ErrMax)变量初始化为零并且在 Err>ErrMax时迭代以下步骤来进行：
·计算场高F的近轴Y高度(Yref)；
·计算惠更斯点扩散函数的质心(Yreal)；
·从a1、a3和a5计算预期的质心位置(Yexp)；和
·计算误差Err＝abs(Yexp-Yreal)/Spix，其中Spix是图像传感器的像素大小。
在这个示例中，在操作640处，透镜的设计至少使用来自拟合位置的确定的最大误差和确定的最大绝对畸变进行优化。在实施方式中，这种优化可以基于最小二乘法最小化技术：对所确定的最大误差和确定的具有波前误差的最大绝对畸变的平方和取平方根(rss)。
图12是示出在应用五阶多项式来校正畸变之后，透镜的视场上的像素中的残余光学畸变的残余畸变图。
图13示出了可用于实现本文中所公开的系统和方法的各种特征，诸如方法400和450的一个或更多个方面的前述特征和功能的示例计算部件。例如，计算部件可以被实现为实时分析模块225。
如本文中所使用的，术语模块可以描述可以根据本申请的一个或更多个实施方式执行的给定的功能单元。如本文中所使用的，可以利用任何形式的硬件、软件或其组合来实现模块。例如，可以实现一个或更多个处理器、控制器、ASIC、PLA、PAL、CPLD、FPGA、逻辑部件、软件例程或其他机构以组成模块。在实施方式中，本文中所描述的各种模块可以被实现为离散模块或者所描述的功能和特征可以部分地或全部地在一个或更多个模块之间共享。换句话说，对于本领域的普通技术人员在阅读本说明书之后将明显的是，本文中所描述的各种特征和功能可以在任何给定的应用中实现并且可以以各种组合和排列实现在一个或更多个单独的或共享的模块中。尽管各种特征或功能性元件可以被单独描述或声明为单独的模块，但本领域的普通技术人员将理解的是，这些特征和功能可以在一个或更多个公共软件和硬件元件之间共享，并且这种描述并非要求或暗示使用单独的硬件或软件部件来实现这样的特征或功能。
在使用软件全部或部分地实现应用的部件或模块的情况下，在一个实施方式中，这些软件元件可以被实现为与能够执行所描述的与其相关的功能的计算或处理模块一起操作。在图13中示出一个这样的示例计算模块。根据这个示例计算模块1000描述了各种实施方式。在阅读此描述后，如何使用其它计算模块和/或架构实现本申请对于相关领域的技术人员来说将变得明显。
现在参照图13所示，计算模块1000可以表示例如在台式机、膝上型电脑(laptop)、笔记本电脑(notebook)和平板电脑内发现的计算或处理能力；手持式计算设备(平板电脑、PDA、智能电话、蜂窝电话、掌上电脑等)；大型机、超级计算机、工作站或服务器；或任何其他类型的专用或通用计算设备，对于给定的应用或环境会是令人满意或合适的。计算模块1000还可以表示嵌入在给定设备内或以其他方式可用于给定设备的计算能力。例如，可以在其他电子设备中，诸如数码相机、导航系统、蜂窝电话、便携式计算设备、调制解调器、路由器、WAP、终端和可以包括某种形式的处理能力的其他电子设备中，找到计算模块。
计算模块1000可以包括例如一个或更多个处理器、控制器、控制模块或其他处理设备，诸如处理器1004。例如，可以使用通用或专用处理引擎，诸如微处理器、控制器或其它控制逻辑来实现处理器1004。在图示的示例中，处理器1004连接到总线1002，但是可以使用任何通信介质来促进与计算模块1000的其他部件的交互或者进行外部通信。
计算模块1000还可以包括一个或更多个存储器模块，本文中简称为主存储器1008。例如，可以优选地将随机存取存储器(RAM)或其他动态存储器用于存储将由处理器1004执行的信息和指令。主存储器1008还可以用于在将由处理器1004执行的指令的执行期间存储临时变量或其他中间信息。计算模块1000同样可以包括耦合到总线1002的只读存储器 (ROM)或其他静态存储设备，用于存储用于处理器1004的静态信息和指令。
计算模块1000还可以包括一种或更多种形式的信息存储机构1010，该信息存储机构可以包括例如介质驱动器1012和存储单元接口1020。介质驱动器1012可以包括驱动器或其他机构以支持固定或可移除的存储介质1014。例如，可以提供硬盘驱动器、固态驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)或其他可移除的或固定的介质驱动器。因此，存储介质1014可以包括例如硬盘、固态驱动器、磁带、盒式磁带、光盘、CD、DVD或蓝光，或者其他固定或可移除的介质，其被介质驱动器1012读取、写入到介质驱动器1012或由介质驱动器1012访问。如这些示例所说明的，存储介质1014可以包括具有存储在其中的计算机软件或数据的计算机可用存储介质。
在可替代的实施方式中，信息存储机构1010可包括用于允许计算机程序或其它指令或数据被加载到计算模块1000中的其他类似工具。这样的工具可包括例如固定的或可移除的存储单元1022和接口1020。这样的存储单元1022和接口1020的示例可以包括程序盒和盒式接口、可移除存储器(例如，闪存或其他可移除存储器模块)和存储器插槽、PCMCIA插槽和卡以及允许将软件和数据从存储单元1022传送到计算模块1000的其他固定的或可移除的存储单元1022和接口1020。
计算模块1000还可以包括通信接口1024。通信接口1024可以被用于允许在计算模块1000与外部设备之间传送软件和数据。通信接口1024的示例可以包括调制解调器或软调制解调器、网络接口(诸如以太网、网络接口卡、WiMedia、IEEE 802.XX或其他接口)、通信端口(例如，诸如 USB端口、IR端口、RS232端口
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接口或其他端口)或其他通信接口。经由通信接口1024传送的软件和数据通常可以在信号上携带，该信号可以是电子信号、电磁信号(其包括光学信号)或能够由给定的通信接口1024 交换的其它信号。这些信号可以经由通道1028被提供到通信接口1024。这个通道1028可以携带信号并且可以使用有线或无线通信介质来实现。通道的一些示例包括电话线、蜂窝电话链路、RF链路、光学链路、网络接口、局域或广域网和其它有线或无线通信通道。
在此文件中，例如，术语“计算机可读介质”、“计算机可用介质”和“计算机程序介质”通常用于指代非暂时性、易失性或非易失性的例如存储器1008、存储单元1022和介质1014。这些和其他各种形式的计算机程序介质或计算机可用介质可以参与将一个或更多个指令的一个或更多个序列运载至处理设备用于执行。体现在介质上的这样的指令通常被称为“计算机程序代码”或“计算机程序产品”(其可以以计算机程序或其他分组的形式被分组)。当被执行时，这样的指令可以使计算模块1000能够执行如本文中所论述的本申请的特征或功能。
尽管上面根据各种示例性实施方式和实现进行了描述，但是应当理解，在一个或更多个单独的实施方式中描述的各种特征、方面和功能不限于它们对它们利用其来描述的特定实施方式的适用性，而是可以单独地或以各种组合来应用于本申请的一个或更多个其他实施方式，无论这些实施方式是否被描述，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施方式的一部分。因此，本申请的广度和范围不应受任何上述示例性实施方式的限制。
应当理解的是，前述概念的所有组合(假设这样的概念并不是相互不一致的)被认为是本文中所公开的发明主题的一部分。具体而言，出现在本公开结尾处的所要求保护的主题的所有组合被认为是本文中所公开的发明主题的一部分。
在包括权利要求书的整个本公开中所使用的术语“大体上”和“大约”被用于描述并考虑诸如由于处理中的变化而引起的小波动。例如，它们可以指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
在可应用的范围内，本文中的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅被用于将由这些术语所描述的各个物体示出为单独的实体并且不意味着暗示时间顺序的意义，除非在本文中另有明确声明。
除非另有明确说明，否则在本文件中所使用的术语和短语及其变体应被解释为开放式而非限制性的。作为前述的示例：术语“包括”应被解读为意指“包括但不限于”等；术语“示例”被用于提供所讨论的项的示例性实例，而不是其详尽的或限制性的列表；术语“一(a)”或“一个(an)”应被解读为意指“至少一个”、“一个或更多个”等；并且诸如“常规”、“传统”、“正常”，“标准”、“已知”和具有类似含义的术语的形容词不应被解释为将所描述的项限制于给定时间段或者将所描述的项限制于在给定的时间内可获得的项，而是应当被解读为涵盖现在或将来的任何时间可用或已知的常规、传统、正常或标准技术。同样地，在此文件涉及对本领域普通技术人员来说会是显然或已知的技术的情况下，这样的技术涵盖现在或将来的任何时间对技术人员来说显然或已知的那些技术。
在某些情况下，诸如“一个或更多个”、“至少”，“但不限于”的拓展单词和短语或其他类似短语的存在不应被解读为意指在没有这样的拓展短语的情况下意指或要求较窄的情况。术语“模块”的使用并不暗指描述或要求保护的作为模块的一部分的部件或功能全部被配置在公共封装中。实际上，模块的任何或所有的各种部件，无论是控制逻辑还是其他部件，可以被组合在单个封装中或单独维护并且可以进一步分布在多个分组或封装中或跨多个位置。
此外，根据示例性框图、流程图和其他图示描述了本文中阐述的各种实施方式。对于本领域的普通技术人员在阅读本文件之后将变得明显的是，所说明的实施方式及其各种可替代实施方式可以被实现，而不局限于所图示的示例。例如，框图及它们的所附描述不应被解释为强制为特定架构或配置。
虽然上面已经描述了本公开的各种实施方式，但是应当理解的是，它们仅借助于示例而不是限制的方式来呈现。同样地，各个图可以描绘用于本公开的示例架构或其他配置，其被完成以帮助理解可以包括在本公开中的特征和功能。本公开不限于所图示的示例架构或配置，而是可以使用各种可替代架构和配置来实现所期望的特征。事实上，可以如何实施可替代的功能、逻辑或物理分区和配置以实现本公开的期望特征，对于本领域技术人员而言将是明显的。而且，除了本文中所描绘的那些之外的许多不同的组成模块名称可以被应用于各个分区。另外地，除非上下文另有规定，否则关于流程图、操作描述和方法权利要求，本文中所呈现的步骤的顺序不应强制各种实施方式被实现为以相同顺序执行所记载的功能。
在下文的一个或更多个实施方式中可实现本公开的各方面：
1)一种方法，包括：
对包括多个斑点的图案化样品执行第一成像周期；
将在所述第一成像周期期间生成的第一组成像数据划分成第一多个成像数据子集，所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集对应于所述图案化样品的相应区域，所述图案化样品的相应区域中的每个区域包括多个斑点；
针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数；
对所述图案化样品执行第二成像周期以生成第二组成像数据；以及
将在所述第二成像周期期间生成的所述第二组成像数据划分为第二多个成像数据子集，所述第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集与所述第一多个成像数据子集中的一个成像数据子集对应于所述图案化样品的相同的相应区域；以及
针对所述第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集，应用针对所述第一多个成像数据子集中的对应于所述图案化样品的相同的相应区域的一个成像数据子集所计算出的畸变校正系数。
2)根据1)所述的方法，其中，所述图案化样品的所述多个斑点中的每个斑点包括荧光标记的核酸，其中，所述第一成像周期是第一测序周期，并且其中，所述第二成像周期是第二测序周期。
3)根据1)所述的方法，其中，所述第一组成像数据和所述第二组成像数据每个各自包括第一颜色通道的成像数据和第二颜色通道的成像数据，并且其中，针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括针对每个成像数据子集的每个颜色通道确定一组畸变校正系数。
4)根据1)所述的方法，其中，针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括：
估计所述成像数据子集的仿射变换；
锐化所述成像数据子集；以及
迭代地搜索用于所述成像数据子集的最佳畸变校正系数组。
5)根据4)所述的方法，其中，迭代地搜索用于所述成像数据子集的最佳畸变校正系数组包括：在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
6)根据4)所述的方法，其中，至少使用所述样品上的基准的位置来划分所述第一组成像数据和所述第二组成像数据，并且其中，使用所述基准估计用于所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集的仿射变换。
7)一种用于校正包括多个斑点的图案化样品的图像中的光学畸变的方法，包括：
估计所述图像的仿射变换；
锐化所述图像；以及
迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括计算所述图像中的多个斑点位置的平均纯净度，并且其中，在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
8)根据7)所述的方法，其中，所述图像包括与第一颜色通道相对应的第一图像数据集和与第二颜色通道相对应的第二图像数据集，并且其中，估计所述仿射变换和锐化所述图像的操作被应用于所述第一图像数据集和所述第二图像数据集中的每一个。
9)根据7)所述的方法，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括：
为所述图像生成一组光学畸变校正系数；
将所估计出的仿射变换应用于所述图像中的所述多个斑点位置；以及
在应用所估计出的仿射变换之后，将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置。
10)根据6)所述的方法，还包括：在将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置之后，提取所述多个斑点位置中的每个斑点位置的信号强度。
11)根据7)所述的方法，还包括：
对所提取的信号强度进行归一化；以及
至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度。
12)根据11)所述的方法，其中，至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度包括：针对所述多个斑点位置中的每个斑点位置，至少使用从与所述斑点位置的经归一化的信号强度相对应的点至高斯质心的距离来确定纯净度。
13)根据7)所述的方法，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括对所述图像中的多个斑点进行二次采样，其中，如果经锐化的图像的行中的斑点被二次采样，则经锐化的图像的该行中的所有斑点被二次采样。
14)一种非暂时性计算机可读介质，具有存储在其上的指令，所述指令在由一个或更多个处理器执行时使系统：
估计图像的仿射变换，其中，所述图像是包括多个斑点的图案化样品的图像；
锐化所述图像；以及
迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括计算所述图像中的多个斑点位置的平均纯净度，并且其中，在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
15)根据14)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述图像包括与第一颜色通道相对应的第一图像数据集和与第二颜色通道相对应的第二图像数据集，并且其中，估计所述仿射变换和锐化所述图像的操作被应用于所述第一图像数据集和所述第二图像数据集中的每一个。
16)根据14)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括：
为所述图像生成一组光学畸变校正系数；
将所估计出的仿射变换应用于所述图像中的所述多个斑点位置；以及
在应用所估计出的仿射变换之后，将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置。
17)根据16)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述指令在由所述一个或更多个处理器执行时还使所述系统：
将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置；以及
提取所述多个斑点位置中的每个斑点位置的信号强度。
18)根据17)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述指令在由所述一个或更多个处理器执行时还使所述系统：
对所提取的信号强度进行归一化；以及
至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度。
19)根据18)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度包括：针对所述多个斑点位置中的每个斑点位置，至少使用从与所述斑点位置的经归一化的信号强度相对应的点至高斯质心的距离来确定纯净度。
20)根据18)所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述图案化样品的所述多个斑点中的每个斑点包括荧光标记的核酸。

Claims (20)

1.一种方法，包括：
对包括多个斑点的图案化样品执行第一成像周期；
将在所述第一成像周期期间生成的第一组成像数据划分成第一多个成像数据子集，所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集对应于所述图案化样品的相应区域，所述图案化样品的相应区域中的每个区域包括多个斑点；
针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数；
对所述图案化样品执行第二成像周期以生成第二组成像数据；以及
将在所述第二成像周期期间生成的所述第二组成像数据划分为第二多个成像数据子集，所述第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集与所述第一多个成像数据子集中的一个成像数据子集对应于所述图案化样品的相同的相应区域；以及
针对所述第二多个成像数据子集中的每个成像数据子集，应用针对所述第一多个成像数据子集中的对应于所述图案化样品的相同的相应区域的一个成像数据子集所计算出的畸变校正系数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述图案化样品的所述多个斑点中的每个斑点包括荧光标记的核酸，其中，所述第一成像周期是第一测序周期，并且其中，所述第二成像周期是第二测序周期。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一组成像数据和所述第二组成像数据每个各自包括第一颜色通道的成像数据和第二颜色通道的成像数据，并且其中，针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括针对每个成像数据子集的每个颜色通道确定一组畸变校正系数。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，针对所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集计算一组图像畸变校正系数包括：
估计所述第一多个成像数据子集中的所述成像数据子集的仿射变换；
锐化所述第一多个成像数据子集中的所述成像数据子集；以及
迭代地搜索用于所述第一多个成像数据子集中的所述成像数据子集的最佳畸变校正系数组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，迭代地搜索用于所述第一多个成像数据子集中的所述成像数据子集的最佳畸变校正系数组包括：在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，至少使用所述图案化样品上的基准的位置来划分所述第一组成像数据和所述第二组成像数据，并且其中，使用所述基准估计用于所述第一多个成像数据子集中的每个成像数据子集的仿射变换。
7.一种用于校正包括多个斑点的图案化样品的图像中的光学畸变的方法，包括：
估计所述图像的仿射变换；
锐化所述图像；以及
迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括至少使用从多个斑点位置中的每个斑点位置提取的信号强度来计算所述图像中的所述多个斑点位置的平均纯净度，所述平均纯净度指所述多个斑点位置上的纯净度的平均值，所述纯净度指计分度量，所述计分度量提供对所述多个斑点位置中的每个斑点位置的整体质量的测量，并且其中，在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述图像包括与第一颜色通道相对应的第一图像数据集和与第二颜色通道相对应的第二图像数据集，并且其中，估计所述仿射变换和锐化所述图像的操作被应用于所述第一图像数据集和所述第二图像数据集中的每一个。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括：
为所述图像生成一组光学畸变校正系数；
将所估计出的仿射变换应用于所述图像中的所述多个斑点位置；以及
在应用所估计出的仿射变换之后，将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括：在将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置之后，提取所述多个斑点位置中的每个斑点位置的信号强度。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括：
对所提取的信号强度进行归一化；以及
至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度包括：针对所述多个斑点位置中的每个斑点位置，至少使用从与所述斑点位置的经归一化的信号强度相对应的点至高斯质心的距离来确定纯净度。
13.根据权利要求7所述的方法，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括对所述图像中的多个斑点进行二次采样，其中，如果经锐化的图像的行中的斑点被二次采样，则经锐化的图像的该行中的所有斑点被二次采样。
14.一种非暂时性计算机可读介质，具有存储在其上的指令，所述指令在由一个或更多个处理器执行时使系统：
估计图像的仿射变换，其中，所述图像是包括多个斑点的图案化样品的图像；
锐化所述图像；以及
迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括至少使用从多个斑点位置中的每个斑点位置提取的信号强度来计算所述图像中的所述多个斑点位置的平均纯净度，所述平均纯净度指所述多个斑点位置上的纯净度的平均值，所述纯净度指计分度量，所述计分度量提供对所述多个斑点位置中的每个斑点位置的整体质量的测量，并且其中，在所述搜索的每次迭代期间应用所估计出的仿射变换。
15.根据权利要求14所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述图像包括与第一颜色通道相对应的第一图像数据集和与第二颜色通道相对应的第二图像数据集，并且其中，估计所述仿射变换和锐化所述图像的操作被应用于所述第一图像数据集和所述第二图像数据集中的每一个。
16.根据权利要求14所述的非暂时性计算机可读介质，其中，迭代地搜索用于经锐化的图像的最佳畸变校正系数组包括：
为所述图像生成一组光学畸变校正系数；
将所估计出的仿射变换应用于所述图像中的所述多个斑点位置；以及
在应用所估计出的仿射变换之后，将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置。
17.根据权利要求16所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述指令在由所述一个或更多个处理器执行时还使所述系统：
将所述一组光学畸变校正系数应用于所述多个斑点位置中的每个斑点位置；以及
提取所述多个斑点位置中的每个斑点位置的信号强度。
18.根据权利要求17所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述指令在由所述一个或更多个处理器执行时还使所述系统：
对所提取的信号强度进行归一化；以及
至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度。
19.根据权利要求18所述的非暂时性计算机可读介质，其中，至少使用经归一化的信号强度来计算所述多个斑点位置的平均纯净度包括：针对所述多个斑点位置中的每个斑点位置，至少使用从与所述斑点位置的经归一化的信号强度相对应的点至高斯质心的距离来确定纯净度。
20.根据权利要求18所述的非暂时性计算机可读介质，其中，所述图案化样品的所述多个斑点中的每个斑点包括荧光标记的核酸。
CN201810185711.9A 2017-03-07 2018-03-07 用于被成像的样品的光学畸变校正方法 Active CN108573468B (zh)

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