CN108567941B - 土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途 - Google Patents

土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及预防急性顺铂肾损伤药物领域，公开了土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途。本发明的土茯苓提取物对顺铂肾损伤具有保护作用，可有效改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，且药理作用强、安全无毒。

Description

土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物 中的用途
技术领域
本发明涉及预防治疗顺铂肾损伤药物领域，具体涉及土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途。
背景技术
顺铂是临床上最有效和最常用的抗肿瘤化疗药物之一，广泛用于卵巢癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、头颈部鳞癌等多种实体肿瘤。然而顺铂化疗存在多种严重不良反应，如肾毒性、耳毒性、神经毒性以及恶心呕吐等，其中肾毒性为最常见又严重的毒性反应，其发生率高达30％以上。顺铂的代谢产物中有重金属离子Pt2+，易于和蛋白质、酶等生物分子中的巯基(-SH结合)，从而使蛋白质和酶失活，使人体组织或细胞受到损伤，如顺铂的肾毒性主要表现为肾小管上皮细胞蛋白质的损伤，而非DNA的损伤。研究表明，顺铂的疗效与用药剂量成正比，而其引起的肾毒性也呈剂量依赖性，从而限制了顺铂化疗的剂量，影响了抗肿瘤疗效。因此，如何降低顺铂所致肾毒性，更好的发挥其抗肿瘤作用，提高患者化疗疗效及生活质量，是当前急需解决的问题。
顺铂产生肾毒性的机制主要是与顺铂进入机体产生氧自由基、造成氧化应激有关。目前，临床上对顺铂肾毒性的主要防护措施是水化利尿，并以血肌酐、尿素氮等作为监测指标，在肾功能改变时降低剂量或停药，但这还不能有效减少顺铂化疗肾毒性的发生，而且针对性预防药物屈指可数。氨磷汀为一种广谱细胞保护剂，由美国FDA批准作为晚期卵巢癌和非小细胞肺癌患者顺铂化疗肾毒性的保护剂，但由于其价格昂贵且除卵巢癌和非小细胞肺癌以外的其他肿瘤的辅助治疗效果不明，并未得到广泛使用。同样一些研究针对顺铂引起肾毒性的不同机制采用了不同针对性药物治疗，如针对顺铂在肾脏中转运的OCT2抑制剂西咪替丁、针对氧化应激过程的抗氧化剂卡维地洛、针对凋亡途径的西司他丁、针对炎症反应的罗格列酮等。但这些药物可能会增加心血管、消化道等方面不良反应的风险，且这些药物并不是治疗肾损伤和抗肿瘤的常规药物，临床上能否产生满意的疗效仍然未知。因此，寻找安全有效且具有减毒增效作用的顺铂化疗辅助药物，就显得非常迫切和必要。
土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥根茎，味甘淡，性平，归肝、胃经，具有健脾胃、解毒化瘀之功效，主要用于梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛，是我国古代治疗重金属中毒的传统中药，其主要活性成分为落新妇苷，落新妇苷为2R，3R-花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，是土茯苓中主要活性黄酮类化合物，具有利尿、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫抑制等药理活性。现已有研究报道土茯苓中黄酮类化合物具有螯合铅离子，改善重金属铅诱导的肾损伤的作用(Xia DZ,Yu XF,Liao SP,et al.Protectiveeffect of Smilax glabra extract against lead-induced oxidative stress in rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,130(2):414-420.；方月娟，夏道宗.分光光度法测定天然产物提取物对铅离子鳌合能力的研究[J].中华中医药学刊，2016，34(2):295-298.)。到目前为止，未见有关土茯苓中黄酮类化合物对顺铂(CDDP)所致肾损伤保护作用的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的顺铂肾毒性问题，提供土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途。
为了实现上述目的，本发明一方面提供土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途。
通过上述技术方案，本发明的土茯苓提取物对顺铂肾损伤具有保护作用，可有效改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，且药理作用强、安全无毒。
附图说明
图1是小鼠肾组织HE染色(400×)图；
图2是土茯苓联合顺铂对荷瘤小鼠肿瘤大小的影响曲线(±SD，n＝10)
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，发明人经研究发现土茯苓提取物主要通过改善小鼠肾脏氧化损伤，从而对顺铂肾损伤具有保护作用，可有效改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，且药理作用强、安全无毒。
本发明提供了土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途。
在本发明中，所述顺铂肾损伤优选为急性顺铂肾损伤。
根据本发明，为了达到对顺铂肾损伤更好的保护作用，有效改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，所述药物是以含30-40重量％落新妇苷的土茯苓提取物为主要药物活性成分的药物组合物。
根据本发明，为了达到对顺铂肾损伤更好的保护作用，显著改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，所述药物是以含30-40重量％重量％落新妇苷的土茯苓提取物为药物活性成分的药物组合物。
优选情况下，所述药物以土茯苓提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成以口服方式导入体内的剂型，简单、方便、制备成本低。
根据本发明，在口服情况下，可以以任何常规的形式给药，优选情况下，所述药物的剂型为口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂(硬胶囊剂或软胶囊剂)或丸剂，可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明土茯苓药用部分为根、茎，在制备上述用途的药物时，先将干燥的土茯苓粉碎，过20-50目筛，与质量分数为60-70％乙醇水溶液按以1∶20-30的料液重量比进行提取，制得土茯苓提取物，该土茯苓提取物是以落新妇苷为主的黄酮类化合物，不含土茯苓皂苷成分，该土茯苓提取物能够改善顺铂肾损伤主要是因为黄酮类化合物具有领位酚羟基的特殊结构，其能够鳌合二价重金属离子，减少重金属的吸收并促进排泄，从而减轻其细胞毒性，而土茯苓皂苷类化合物不具备该结构，故不具有对顺铂肾损伤保护功能。
本发明可将土茯苓提取物作为药用活性成分，与药用辅料(例如，可以为淀粉、乳糖、糊精、硬脂酸镁、水、甘油、1,2-丙二醇、单糖浆等)结合，按照常规工艺制备成肾组织保护药物。
根据本发明，为了确保药物安全无毒，药物的给药剂量为成人每天0.05-0.3mg/kg。
下面通过药理试验(实施例)说明本发明所述土茯苓提取物以及土茯苓提取物联合顺铂的生物活性。
实施例1
关于土茯苓提取物的生物活性的实验如下：
一、材料和试剂
土茯苓购自浙江中医药大学中药饮片厂；
顺铂注射液，国药准字H20040813，购自江苏豪森药业集团有限公司；
肌酐(Cr)检测试剂盒、尿素氮(BUN)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒和还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
二、土茯苓提取物的制备
将干燥的土茯苓经粉碎、过20目筛，与质量分数为60％乙醇水溶液按照以1:20的料液重量比浸泡后，于60℃提取3次，每次3h，最后合并提取液，冷冻干燥，备用，所得土茯苓提取物中落新妇苷的含量为35重量％。
三、实验动物
雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，18-22g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK(沪)2008-0016。动物实验条件合格证号SYXK(浙)2013-0184。动物实验得到伦理委员会批准。
四、动物试验
1、口服给药
50只C57BL/6J小鼠随机分为5组，对照组、顺铂组、土茯苓低剂量组、土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组，每组10只。对照组和顺铂组以蒸馏水灌胃；土茯苓低剂量组、土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组分别以土茯苓提取物50、100、300mg/kg灌胃，共10天。给药第7天时，顺铂组、土茯苓低剂量组、土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组，单次腹腔注射顺铂10mg/kg；对照组腹腔注射等量生理盐水。
2、血清生化指标测定
末次给药24h后，分离血清，全自动生化仪上测定各组小鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平。
3、肾组织生化指标测定
取小鼠肾脏匀浆，根据试剂盒操作要求，检测肾组织匀浆氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性；采用ELISA法测定肾组织匀浆中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
4、肾组织病理学观察
取另一部分肾脏，用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，400倍显微镜下观察。
5、数据处理
将所有数据均用SPSS 17.0统计软件进行处理，数据以均值±标准差
Figure BDA0001734994030000062
Figure BDA0001734994030000063
表示，组间差异按方差分析进行检验，并用最小显著差法检验作两两比较，以P<0.05时有统计学意义。
6、药理结果分析
1)土茯苓提取物对顺铂诱导的肾损伤小鼠体重增重和肾体指数的影响
测得5组实验中小鼠体重增重和肾体指数的实验数据
Figure BDA0001734994030000061
见表1。
表1
组别 体重增重(g) 肾体指数
对照组 0.93±0.55 7.96±0.19
顺铂组 -1.56±0.81<sup>*</sup> 11.16±0.46<sup>*</sup>
土茯苓低剂量组 -1.21±0.63 9.86±0.39
土茯苓中剂量组 -0.66±0.54<sup>#</sup> 8.95±0.21<sup>#</sup>
土茯苓高剂量组 -0.12±0.32<sup>#</sup> 8.21±0.13<sup>#</sup>
注：与对照组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05。
由表1可知，与对照组相比，顺铂组小鼠体重显著降低，而肾体指数显著升高(P<0.05)；与顺铂组相比，土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组体重下降程度明显降低，肾体指数显著降低(P<0.05)，且呈一定剂量依赖关系。
2)土茯苓提取物对顺铂诱导的肾损伤小鼠肾功能指标的影响
测得5组实验中小鼠肾功能指标，包括SCr、BUN实验数据
Figure BDA0001734994030000073
Figure BDA0001734994030000074
见表2。
表2
组别 SCr(μmol/L) BUN(mmol/L)
对照组 42.13±3.21 11.45±1.26
顺铂组 78.61±8.52<sup>*</sup> 22.98±3.06<sup>*</sup>
土茯苓低剂量组 66.74±6.34 18.68±2.92
土茯苓中剂量组 57.87±4.96<sup>#</sup> 17.13±2.01<sup>#</sup>
土茯苓高剂量组 48.28±3.57<sup>#</sup> 14.11±1.18<sup>#</sup>
注：与对照组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05。
由表2可知，与对照组相比，顺铂组小鼠SCr、BUN水平明显升高，具有显著差异(P＜0.05)；与顺铂组相比，土茯苓低中高剂量组小鼠SCr和BUN降低且呈一定剂量依赖关系，尤其中高剂量组显著(P＜0.05)。
3)土茯苓提取物对顺铂诱导的肾损伤小鼠肾氧化应激指标的影响
测得5组实验中小鼠肾氧化应激指标，包括SOD、CAT和GSH的活性实验数据
Figure BDA0001734994030000071
见表3。
表3
Figure BDA0001734994030000072
Figure BDA0001734994030000081
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组相比，#P<0.05。
由表3可知，与对照组相比，顺铂组小鼠肾组织中SOD、CAT和GSH活性显著降低(P＜0.05)，表明顺铂组小鼠肾脏抗氧化代谢水平下降；与顺铂组相比，土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组小鼠SOD、CAT和GSH活性显著增高(P＜0.05)，表明土茯苓提取物可以一定程度的缓解顺铂诱导的小鼠肾脏氧化损伤。
4)土茯苓提取物对顺铂诱导的肾损伤小鼠肾组织病理学的影响
将对照组、顺铂组、土茯苓低剂量组、土茯苓中剂量组、土茯苓高剂量组5组实验中的小鼠肾组织切片后，采用常规HE染色观察，如图1。由图1可知，对照组小鼠肾脏形态基本正常，顺铂组小鼠肾小管损伤明显，出现局灶性出血，坏死。与顺铂组比较，土茯苓提取物可改善顺铂诱导的小鼠肾损伤，尤其土茯苓高剂量组明显，且呈一定剂量依赖关系。
由以上试验结果表明，土茯苓提取物可显著改善顺铂诱导的小鼠急性肾损伤，对顺铂(CDDP)所致急性肾损伤达到保护作用，其主要通过改善小鼠肾脏氧化损伤来发挥作用，是一种很有前景的肾组织保护剂。
实施例2
关于土茯苓提取物联合顺铂的生物活性的实验如下：
一、材料和方法
1、土茯苓提取物的制备
将干燥的土茯苓经粉碎、过20目筛，与质量分数为70％乙醇水溶液按照以1:30的料液重量比浸泡后，于60℃提取3次，每次3h，最后合并提取液，冷冻干燥，备用，所得土茯苓提取物中落新妇苷的含量为40重量％。
2、实验动物
雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，18-22g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK(沪)2008-0016。动物实验条件合格证号SYXK(浙)2013-0184。动物实验得到伦理委员会批准。
3、细胞培养
人肺癌Lewis细胞株系购自中科院上海细胞库，培养于含10％胎牛血清，1％双抗的DMEM培养液中，置于37℃5％CO2培养箱，生长密度达80％后，用胰蛋白酶消化，1∶3传代培养。
4、Lewis细胞悬液和荷瘤小鼠的制备
取对数生长期的Lewis肺癌细胞，用0.25％胰蛋白酶消化2-3分钟后，用PBS洗两遍，制成细胞悬液，显微镜下计数，用生理盐水调整细胞悬液浓度至1×107/mL，接种于右侧腋部皮下，每只注射0.2mL，共5只，肿瘤长出后，每日检查肿瘤生长情况。
取皮下接种Lewis肺癌12～14d的荷瘤C57BL/6小鼠作为瘤源动物，剥离瘤组织制成单细胞悬液，计数肿瘤细胞数，调整细胞浓度为1×107/ml。用生理盐水调整细胞悬液浓度至1×107/mL，接种于右侧腋部皮下，每只注射0.2mL，共30只小鼠。肿瘤长出后，每日检查肿瘤生长情况，每4天用游标卡尺测量移植瘤长短径，等瘤径至体积为150-200mm3后分组给药。
5、动物分组及给药
30只荷瘤小鼠随机分为3组，对照组、顺铂组、顺铂+土茯苓组，每组10只。对照组和顺铂组以蒸馏水灌胃；顺铂+土茯苓组选用提取的土茯苓提取物300mg/kg灌胃，共3周。顺铂组、顺铂+土茯苓组，单次腹腔注射顺铂5mg/kg，每周一次，共3次；对照组腹腔注射等量生理盐水。
6、血清生化指标测定
末次给药24h后，分离血清，全自动生化仪上测定各组小鼠血清SCr和BUN水平。
7、数据处理
所有数据均用SPSS 17.0统计软件进行处理，数据以均值±标准差
Figure BDA0001734994030000101
Figure BDA0001734994030000102
表示，组间差异按方差分析进行检验，并用最小显著差法检验作两两比较，以P<0.05时有统计学意义。
二、药理结果分析
1、土茯苓联合顺铂对荷瘤小鼠肿瘤大小的影响
如图2所示，对照组小鼠肿瘤体积持续增加，尤其第三周是显著增加；顺铂组和顺铂+土茯苓组肿瘤体积增长速度显著低于对照组，但顺铂组和顺铂+土茯苓组之间无差异，表明土茯苓不影响顺铂抗肿瘤疗效。
2.土茯苓联合顺铂对荷瘤小鼠肾功能指标的影响
测得3组实验中荷瘤小鼠肾功能指标，包括肾体指数、SCr、BUN实验数据(±SD，n＝10)，见表4。
表4
组别 肾体指数 SCr(μmol/L) BUN(mmol/L)
对照组 11.00±0.47 30.34±2.49 20.74±6.34
顺铂组 13.34±1.94<sup>*</sup> 39.47±6.90<sup>*</sup> 35.31±2.38<sup>*</sup>
顺铂+土茯苓组 11.22±1.05<sup>#</sup> 32.02±6.71<sup>#</sup> 23.40±2.26<sup>#</sup>
注：与对照组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05。
由表4可知，与对照组相比，顺铂组小鼠肾体指数、SCr和BUN水平明显升高，具有显著差异(P＜0.05)；与顺铂组相比，顺铂+土茯苓组小鼠肾体指数、SCr和BUN显著降低(P＜0.05)，表明土茯苓在不影响顺铂抗肿瘤效果，同时具有显著改善顺铂引起的肾损伤的作用。
由此可见，通过建立荷瘤小鼠模型来评价土茯苓提取物300mg/kg剂量对顺铂化疗引起的肾损伤的影响结果显示，土茯苓提取物300mg/kg剂量在不影响顺铂抗肿瘤疗效，同时具有显著改善顺铂化疗引起的肾损伤的作用。
综上，本发明创造性对土茯苓提取物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。本发明的土茯苓提取物主要通过改善小鼠肾脏氧化损伤，从而对顺铂肾损伤具有保护作用，可有效改善肾脏损伤、维持和修复肾脏功能，且药理作用强、安全无毒。本发明的产品原料来源丰富、价廉、安全无毒副作用，制备工艺路线简单、生产成本低廉，可制成口服剂型、片剂等，使用方便，是一种非常有前景和开发价值的肾组织保护剂。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.土茯苓提取物在制备用于预防和/或治疗顺铂肾损伤的药物中的用途；
其中，所述药物是以含30-40重量％落新妇苷的土茯苓提取物为唯一药物活性成分的药物组合物；
所述土茯苓提取物按照以下方法制备获得：
将干燥的土茯苓经粉碎、过20目筛，与质量分数为60-70％乙醇水溶液按照以1:20-30的料液重量比浸泡后，于60℃提取3次，每次3h，最后合并提取液，冷冻干燥，备用，所得土茯苓提取物中落新妇苷的含量为35-40重量％；
所述顺铂肾损伤为急性顺铂肾损伤。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物以土茯苓提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成以口服方式导入体内的剂型。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述药物的剂型为口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂。
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CN101897716B (zh) * 2006-09-27 2012-03-21 山东绿叶天然药物研究开发有限公司 落新妇苷在制备治疗或预防急性肾功能衰竭的药物中的应用

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