CN108553447B - 共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备方法 - Google Patents

共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)将盐酸阿霉素与纳米粒载体材料制备成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒；(2)将所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒分散于水中，形成纳米粒悬浮液，将所述纳米粒悬浮液分散于含有人参皂苷rh2和高分子聚合物的有机溶液中，制备得到S/W1/O初乳；(3)将所述S/W1/O初乳加入含有乳化剂的水溶液中，制备得到S/W1/O/W2复乳；(4)将所述S/W1/O/W2复乳固化成微球，收集所述微球，洗涤，干燥，即得。该方法制备的微球可以实现盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的顺序释放、缓慢释放、并且突释率低、包封率高。

Description

共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备 方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备方法。
背景技术
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，全世界每年有50万妇女死于乳腺癌。化疗在乳腺癌的全身治疗中占据十分重要的位置，但乳腺癌患者化疗多药耐药性的产生目前仍是导致临床治疗失败及预后不良的主要原因。产生多药耐药性的原因有很多种，其中，p-糖蛋白的过度表达，是目前公认的引起多药耐药性的主要原因。盐酸阿霉素是一种广谱强效的化疗药物，通过与癌细胞的DNA结合而杀死细胞，也是治疗乳腺癌最常用的化疗药物之一。目前上市的盐酸阿霉素制剂有注射用盐酸多柔比星和
Figure BDA0001664224660000011
，二者都需要重复大剂量给药，毒副作用大且易导致肿瘤细胞多药耐药性的产生，导致化疗失败。
p-糖蛋白抑制剂和化疗药物联合应用可以提高肿瘤细胞内化疗药物的浓度，逆转乳腺癌细胞的耐药性。但目前应用的p-糖蛋白抑制剂大多具有较强的毒性，某些抑制剂还会影响抗癌药物的药代动力学和体内分布情况，临床试验结果不理想。因此，寻找一种毒性低、疗效高、不影响化疗药物代谢的p-糖蛋白抑制剂是很有必要的。人参皂苷rh2是由红参中提取出的稀有单体皂苷，是人参主要的活性成分之一，毒性低，具有抗肿瘤效应和抑制p-糖蛋白功能，可逆转癌细胞的多药耐药性，恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性。
因此，有必要制备一种共载盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的复合缓释制剂，以降低盐酸阿霉素的给药频率并减少其用量，从而降低其毒副作用，再配合人参皂苷rh2可逆转肿瘤细胞的耐药性的作用，恢复肿瘤细胞对盐酸阿霉素的敏感性，从而提高抗肿瘤效应。
发明内容
基于此，本发明提供了一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，该方法制备的微球可以实现盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的缓慢释放、突释率低，并且可以实现人参皂苷rh2和盐酸阿霉素的顺序释放，先释放出来的人参皂苷rh2可以抑制p-糖蛋白的功能，恢复耐药癌细胞对盐酸阿霉素的敏感性，促进后释放的盐酸阿霉素顺利消灭癌细胞，实现增效减毒的目标。
具体技术方案如下：
一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将盐酸阿霉素与纳米粒载体材料制备成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒；
(2)将所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒分散于水中，形成纳米粒悬浮液，将所述纳米粒悬浮液分散于含有人参皂苷rh2和高分子聚合物的有机溶液中，制备得到S/W1/O初乳；
(3)将所述S/W1/O初乳加入含有乳化剂的水溶液中，制备得到S/W1/O/W2复乳；
(4)将所述S/W1/O/W2复乳固化成微球，收集所述微球，洗涤，干燥，即得所述共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球；
所述纳米粒载体材料选自海藻酸钠、壳聚糖和角叉菜胶中的至少两种。
在其中一些实施例中，所述纳米粒载体材料的分子量为45KDa-80KDa。
在其中一些实施例中，步骤(1)包括：
S1.将盐酸阿霉素水溶液在搅拌条件下加入纳米粒载体材料A的水溶液中，再缓慢滴加纳米粒载体材料B的水溶液，形成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液；
S2.将所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液离心，得纳米粒沉淀，将所得纳米粒沉淀加入冻干保护剂的水溶液中分散，冷冻干燥，即得所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒；
所述纳米粒载体材料A选自海藻酸钠、壳聚糖和角叉菜胶中的至少一种；
所述纳米粒载体材料B选自海藻酸钠、壳聚糖和角叉菜胶中的至少一种；
所述纳米粒载体材料A与所述纳米粒载体材料B不相同。
在其中一些实施例中，所述纳米粒载体材料A为海藻酸钠，所述纳米粒载体材料B为壳聚糖。
在其中一些实施例中，所述盐酸阿霉素水溶液中盐酸阿霉素的浓度为0.1～1mg/ml；所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度都为1～4mg/ml，所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度比为1:0.8～5。
在其中一些实施例中，所述盐酸阿霉素水溶液中盐酸阿霉素的浓度为0.3～0.5mg/ml；所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度都为2.5～3.5mg/ml，所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度比为1:0.8～1.2。
在其中一些实施例中，所述盐酸阿霉素水溶液、所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的体积比为1:0.8～1.2:1.8～2.2。
在其中一些实施例中，所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的pH分别为5.5～6.5和5～6。
在其中一些实施例中，所述冻干保护剂选自甘露醇和海藻糖中的一种或两种，所述冻干保护剂的水溶液的浓度为10～55mg/ml。
在其中一些实施例中，所述冻干保护剂为海藻糖，所述冻干保护剂的水溶液的浓度为45～55mg/ml。
在其中一些实施例中，所述搅拌的速度为100～1000rpm。
在其中一些实施例中，所述纳米粒悬浮液中盐酸阿霉素聚电解质纳米粒与水的质量体积比为0.5～1mg：3μl。
在其中一些实施例中，所述高分子聚合物为聚乳酸(PLA)和/或聚乳酸-羟基乙烯共聚物(PLGA)，所述高分子聚合物的分子量为20000～100000。
在其中一些实施例中，所述高分子聚合物为聚乳酸-羟基乙烯共聚物(PLGA)，所述高分子聚合物的分子量为30000～50000。
在其中一些实施例中，所述有机溶液中的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷和碳酸二甲酯中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述乳化剂选自聚乙烯醇、泊洛沙姆188、吐温-80和吐温-20中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述有机溶液中高分子聚合物的浓度为50mg/ml～200mg/ml，人参皂苷rh2的浓度为2～4mg/ml。
在其中一些实施例中，所述有机溶液中高分子聚合物的浓度为150mg/ml～200mg/ml，人参皂苷rh2的浓度为2.5～3.5mg/ml。
在其中一些实施例中，所述含有乳化剂的水溶液中乳化剂的浓度为10mg/ml～50mg/ml。
在其中一些实施例中，所述含有乳化剂的水溶液中乳化剂的浓度为20mg/ml～30mg/ml。
在其中一些实施例中，所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒与有机溶液的质量体积比为15～35mg:1ml。
在其中一些实施例中，所述有机溶液与所述含有乳化剂的水溶液的体积比为1:1～12。
在其中一些实施例中，所述有机溶液与所述含有乳化剂的水溶液的体积比为1:8～12。
在其中一些实施例中，制备S/W1/O初乳的方法包括：利用细胞破碎仪或高速剪切仪制备S/W1/O初乳；制备S/W1/O/W2复乳的方法包括：利用细胞破碎仪或高速剪切仪制备S/W1/O/W2复乳；细胞破碎仪的功率为300-500W，破碎时间20-40s；所述高速剪切仪的剪切速度为8000-12000rpm，剪切时间20-40s。
在其中一些实施例中，将所述S/W1/O/W2复乳固化成微球包括：将所述S/W1/O/W2复乳加入氯化钠水溶液中，并不断搅拌至挥干有机溶剂，直至微球固化。
在其中一些实施例中，所述氯化钠水溶液的浓度为10mg/ml～110mg/ml，所述S/W1/O/W2复乳与氯化钠水溶液的体积比为1:5～20。
在其中一些实施例中，所述氯化钠水溶液的浓度为90mg/ml～110mg/ml，所述S/W1/O/W2复乳与氯化钠水溶液的体积比为1:8～12。
本发明的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球及其制备方法具有以下优点和有益效果：
本发明将盐酸阿霉素与特定的纳米粒载体材料通过静电吸附作用制备成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒后再与人参皂苷rh2通过S/W1/O/W2复乳法制备得到共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球，与传统的W/O/W复乳法相比，这种方法制备的微球对盐酸阿霉素以及人参皂苷rh2的包封率高(约为60％～80％)，可以实现盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的缓慢释放、并且突释率低，盐酸阿霉素24h释放率为6％～16％，体外可缓慢持续释药约110天，大大降低了给药频率，提高了患者的顺应性，降低盐酸阿霉素的用量，减少毒副作用。另一方面，该复合微球可实现人参皂苷rh2和盐酸阿霉素的顺序释放，先释放出来的人参皂苷rh2可以抑制p-糖蛋白的功能，恢复耐药癌细胞对后释放的盐酸阿霉素的敏感性，促进后释放的盐酸阿霉素顺利消灭癌细胞，从而提高化疗药物盐酸阿霉素的疗效，实现增效减毒的目标，提高抗肿瘤效应。本发明提供的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球呈现表面光滑的球形，粒径在1～30μm之间。
附图说明
图1为微球的扫描电镜图，其中A-D分别为实施例1和对比例1、2、3制备的微球的扫描电镜图；
图2为激光共聚焦图，其中A-C分别为实施例1、2和对比例1制备的微球的激光共聚焦图；
图3为纳米粒的透射电镜图，其中A-B分别为实施例1和对比例3中盐酸阿霉素纳米粒的透射电镜图；
图4为微球的药物体外释放曲线图，其中A为实施例1和对比例1中盐酸阿霉素的体外释放曲线对比图，B为实施例1和对比例2中人参皂苷rh2的体外释放曲线对比图，C为对比例2中盐酸阿霉素与人参皂苷rh2的外释放曲线对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。除非特别说明，本发明采用的试剂，方法和设备为本技术领域常规试剂，方法和设备。
实施例1
本实施例提供一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球，制备方法如下：
(1)精密称取一定质量的盐酸阿霉素，用超纯水配制成浓度为0.4mg/ml的盐酸阿霉素溶液，备用。精密称取一定质量的海藻酸钠(MW＝75KDa)和壳聚糖(MW＝50KDa)，用超纯水分别配制成3mg/ml的海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，调节pH分别为6.00和5.50，用0.22μm滤膜过滤备用。将10ml的3mg/ml海藻酸钠溶液放置搅拌速度为500rpm的搅拌器上，加入10ml的0.4mg/ml盐酸阿霉素溶液，然后缓慢滴加20ml的3mg/ml壳聚糖溶液，形成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液。将纳米粒混悬液15000rpm离心40min，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒沉淀，用2ml的50mg/ml的海藻糖水溶液分散纳米粒沉淀，冷冻干燥48h，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)。(其透射电镜图如图3中的A图所示)。
(2)精密称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，静置冷却，配制成25mg/ml的PVA水溶液(W2)备用。精密称取人参皂苷rh2 9mg，配制成3mg/ml的乙酸乙酯溶液。精密称取一定质量的聚乳酸-羟基乙烯共聚物(PLGA，LA:GA50:50分子量40000)，加入适量的溶有人参皂苷rh2的乙酸乙酯溶液，得到PLGA浓度为150mg/ml的有机相溶液(O)。现用现配，并将配置好的PLGA溶液放入冰中预冷。
(3)取步骤(1)中制备的盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)100mg分散于300μl超纯水中，溶解其中的海藻糖，形成纳米粒混悬液(W1)；然后将上述纳米粒混悬液分散于3ml步骤(2)中得到的有机相溶液(O)中，在冰浴条件下通过细胞破碎仪超声混合30s(400W)，得到S/W1/O初乳，然后将形成的S/W1/O初乳倒入PVA水溶液(W2)中，PVA水溶液与初乳的体积比为10:1，冰浴的条件下高速剪切30S，剪切速度为10000rpm，形成S/W1/O/W2复乳。将S/W1/O/W2复乳置于100mg/ml的氯化钠水溶液中，氯化钠水溶液与S/W1/O/W2复乳的体积比为10:1，500rpm搅拌10h以挥干有机溶剂，固化微球。
(4)离心收集上述微球，用超纯水洗涤三次，然后冷冻干燥48h，得到共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球。
将本实施例制备的冻干盐酸阿霉素聚电解质纳米粒用超纯水分散并稀释至适合的浓度，取20μL置于干净封口膜上，把铜网覆盖在样品溶液上吸附2min，用滤纸吸干；再将铜网覆盖在2％磷钨酸溶液上，吸附1min，用滤纸吸干；制备成透射电镜样品，在透射电镜下观察纳米粒的外形(结果如图3中的A图)结果表明，本实施例所制备的纳米粒呈现粒径均一的圆球形。
将本实施列制备的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球放在贴有导电胶带的金属载物台上，喷金制备成扫描电镜样品，在扫描电镜下观察微球外形(结果见图1中的A图)。结果表明，本实施例所制备的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球表面光滑，球型完整，颗粒规则无黏连。
利用激光共聚焦观察盐酸阿霉素与人参皂苷rh2在微球中的分布(结果见图2中的A图)。用香豆素6(C6)代替人参皂苷rh2载入微球中，在激光共聚焦显微镜下观察药物在微球中的分布。红色荧光代表香豆素6，绿色荧光代表盐酸阿霉素。结果表明，当盐酸阿霉素纳米粒加入量≥75mg时，盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2均匀分布在整个微球，由于盐酸阿霉素需要克服纳米粒载体材料的静电吸附作用才能从微球中释放，故出现相对于人参皂苷rh2后释放的现象。
精密称取实施例1中所制备的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球25mg，采用DMSO溶解后，过滤，通过紫外检测器(检测波长488nm)测定并计算得到微球中盐酸阿霉素的包封率为68.83％±1.89％。取上述过滤后的DMSO溶液1ml与9ml甲醇混合，离心过滤后，用高效液相检测并计算得到人参皂苷rh2的包封率为81.89％±2.01％；检测条件如下：检测波长203nm，柱温40℃，流动相乙腈：水＝50:50，进样速度1ml/min。
实施例2
本实施例提供一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球，制备方法如下：
(1)精密称取一定质量的盐酸阿霉素，用超纯水配制成浓度为0.4mg/ml的盐酸阿霉素溶液，备用。精密称取一定质量的海藻酸钠(MW＝75KDa)和壳聚糖(MW＝50KDa)，用超纯水分别配制成3mg/ml的海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，调节pH分别为6.00和5.50，用0.22μm滤膜过滤备用。将10ml的3mg/ml海藻酸钠溶液放置搅拌速度为500rpm的搅拌器上，加入10m的0.4mg/ml盐酸阿霉素溶液，然后缓慢滴加20ml的3mg/ml壳聚糖溶液，形成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液。将纳米粒混悬液15000rpm离心40min，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒沉淀，用2ml的50mg/ml的海藻糖溶液分散纳米粒沉淀，冷冻干燥48h，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)。
(2)精密称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，静置冷却，配制成25mg/ml的PVA水溶液(W2)备用。精密称取人参皂苷rh2 9mg，配制成3mg/ml的乙酸乙酯溶液。精密称取一定质量的PLGA(LA:GA 50:50，分子量40000)，加入适量的溶有人参皂苷rh2的乙酸乙酯溶液，得到PLGA浓度为150mg/ml的有机相溶液(O)。现用现配，并将配置好的PLGA溶液放入冰中预冷。
(3)取步骤(1)中制备的盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)50mg分散于300μl超纯水中，溶解其中的海藻糖，形成纳米粒混悬液(W1)；然后将上述纳米粒混悬液分散于3ml步骤(2)中得到的有机相溶液(O)中，在冰浴条件下通过细胞破碎仪超声混合30s(400W)，得到S/W1/O初乳，然后将形成的S/W1/O初乳倒入PVA水溶液(W2)中，PVA水溶液与初乳的体积比为10:1，冰浴的条件下高速剪切30S，剪切速度为10000rpm，形成S/W1/O/W2复乳。将S/W1/O/W2复乳置于100mg/ml的氯化钠水溶液中，氯化钠水溶液与S/W1/O/W2复乳的体积比为10:1，500rpm搅拌10h以挥干有机溶剂，固化微球。
(4)离心收集上述微球，用超纯水洗涤三次，然后冷冻干燥48h，得到共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球。
利用激光共聚焦观察盐酸阿霉素与人参皂苷rh2在微球中的分布(结果见图2中的B图)。用香豆素6(C6)代替人参皂苷rh2载入微球中，将少量微球置于载玻片上，然后用盖玻片封片，在激光共聚焦显微镜下观察药物在微球中的分布。红色荧光代表香豆素6，绿色荧光代表盐酸阿霉素。结果表明，当盐酸阿霉素纳米粒加入量≤75mg时，盐酸阿霉素纳米粒主要分布在微球的中心，人参皂苷rh2分布在整个微球，但是微球表面分布相对较多。因此盐酸霉素的突释低而人参皂苷rh2的突释高，同时，人参皂苷rh2的释放比盐酸阿霉素快。
精密称取实施例2中所制备的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球25mg，测定其中盐酸阿霉素的包封率为78.42％±3.24％(测定方法同实施例1)，人参皂苷rh2的包封率为80.96％±1.12％(测定方法同实施例1)。
实施例3
本实施例提供一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球，制备方法如下：
(1)精密称取一定质量的盐酸阿霉素，用超纯水配制成浓度为0.4mg/ml的盐酸阿霉素溶液，备用。精密称取一定质量的海藻酸钠(MW＝75KDa)和壳聚糖(MW＝50KDa)，用超纯水分别配制成3mg/ml的海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，调节pH分别为6.00和5.50，用0.22μm滤膜过滤备用。将10ml的3mg/ml海藻酸钠溶液放置搅拌速度为500rpm的搅拌器上，加入10ml的0.4mg/ml盐酸阿霉素溶液，然后缓慢滴加20ml的3mg/ml壳聚糖溶液，形成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液。将纳米粒混悬液15000rpm离心40min，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒沉淀，用2ml的50mg/ml的海藻糖溶液分散纳米粒沉淀，冷冻干燥48h，得到盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)。
(2)精密称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，静置冷却，配制成25mg/ml的PVA水溶液(W2)备用。精密称取人参皂苷rh2 9mg，配制成3mg/ml的乙酸乙酯溶液。精密称取一定质量的PLGA(LA:GA 50:50，分子量40000)，加入适量的溶有人参皂苷rh2的乙酸乙酯溶液，得到PLGA浓度为200mg/ml的有机相溶液(O)。现用现配，并将配置好的PLGA溶液放入冰中预冷。
(3)取步骤(1)中制备的盐酸阿霉素聚电解质纳米粒(S)100mg分散于300μl超纯水中，溶解其中的海藻糖，形成纳米粒混悬液(W1)；然后将上述纳米粒混悬液分散于3ml步骤(2)中得到的有机相溶液(O)中，在冰浴条件下通过细胞破碎仪超声混合30s(400W)，得到S/W1/O初乳，然后将形成的S/W1/O初乳倒入PVA水溶液(W2)中，PVA水溶液与初乳的体积比为10:1，冰浴的条件下高速剪切30S，剪切速度为10000rpm，形成S/W1/O/W2复乳。将S/W1/O/W2复乳置于100mg/ml的氯化钠水溶液中，氯化钠水溶液与S/W1/O/W2复乳的体积比为10:1，500rpm搅拌10h以挥干有机溶剂，固化微球。
(4)离心收集上述微球，用超纯水洗涤三次，然后冷冻干燥48h，得到共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球。
精密称取实施例3中所制备的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球25mg，测定其中盐酸阿霉素的包封率为66.77％±3.72％(测定方法同实施例1)，人参皂苷rh2的包封率为83.97％±1.89％(测定方法同实施例1)。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：只载有人参皂苷rh2，不共载盐酸阿霉素纳米粒，直接将人参皂苷rh2和PLGA制备成人参皂苷rh2微球，制备方法如下：
(1)精密称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，停止加热，静置冷却，配制成25mg/ml的PVA水溶液(W2)备用。精密称取人参皂苷rh2 9mg，配制成浓度为3mg/ml的乙酸乙酯溶液。精密称取一定质量的PLGA(分子量40000)，加入适量的溶有人参皂苷rh2的乙酸乙酯溶液，得到PLGA浓度为150mg/ml的有机相溶液(O)。现用现配，并且配制好的PLGA溶液放入冰中预冷。
(2)将300μl超纯水(W1)加入3ml步骤(1)中得到的有机相溶液(O)中，在冰浴条件下通过细胞破碎仪超声混合30s(400W)，得到W1/O初乳，再将W1/O初乳加入PVA水溶液(W2)中，PVA水溶液与油相的体积比为10:1，冰浴的条件下高速剪切30S，剪切速度为10000rpm，形成W1/O/W2复乳。将W1/O/W2复乳置于100mg/ml的氯化钠水溶液中，氯化钠水溶液与W1/O/W2复乳的体积比为10:1，500rpm搅拌10h以挥干有机溶剂，固化微球。
(3)离心收集上述微球，用超纯水洗涤三次，然后冷冻干燥48h，得到载人参皂苷rh2的微球。
本对比例制备的载人参皂苷rh2的PLGA微球的扫描电镜图如图1中的B图(测定方法同实施例1)，与实施例1的微球相比，本对比例所制备的微球外观与实施例1相似，大部分球型完整，表面光滑；其激光共聚焦显微镜观察人参皂苷rh2在微球内的分布结果如图2中的C图(测定方法同实施例1)所示，与实施例1中人参皂苷rh2的分布相比，本对比例中人参皂苷rh2主要分布在微球的表面，因此其突释很高(24h释放为57.33％)；人参皂苷rh2的包封率为80.96％±1.12％(测定方法同实施例1)，与实施例1中人参皂苷rh2的包封率相比，没有明显的差别。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，没有将盐酸阿霉素制备成纳米粒，直接将其利用W/O/W复乳法制备共载盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的复合微球。其制备方法如下：
(1)精密称取一定量的聚乙烯醇(PVA)，加入适量的超纯水，加热搅拌直至聚乙烯醇完全溶解，静置冷却，配制成25mg/ml的PVA水溶液(W2)备用。精密称取人参皂苷rh2 9mg，配制成3mg/ml的乙酸乙酯溶液。精密称取一定质量的PLGA(分子量40000)，加入适量的溶有人参皂苷rh2的乙酸乙酯溶液，得到PLGA浓度为150mg/ml的有机相溶液(O)。现用现配，并将配置好的PLGA溶液放入冰中预冷。
(2)取盐酸阿霉素4.25mg分散于300μl超纯水中，形成盐酸阿霉素水溶液(W1)；然后将上盐酸阿霉素水溶液分散于3ml步骤(1)中得到的有机相溶液(O)中，在冰浴条件下通过细胞破碎仪超声混合30s(400W)，得到W1/O初乳，然后将形成的W1/O初乳倒入PVA水溶液(W2)中，PVA水溶液与初乳的体积比为10:1，冰浴的条件下高速剪切30S，剪切速度为10000rpm，形成W1/O/W2复乳。将W1/O/W2复乳置于100mg/ml的氯化钠水溶液中，氯化钠水溶液与W1/O/W2复乳的体积比为10:1，500rpm搅拌10h以挥干有机溶剂，固化微球。
(3)离心收集上述微球，用超纯水洗涤三次，然后冷冻干燥48h，得到共载盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的复合微球。
本对比例制备的复合微球的扫描电镜图如图1中的C图所示(测定方法同实施例1)，结果表明：与实施例1相比，本对比例所制备的微球外观与实施例1相似，大部分球型完整，表面光滑，但是粒径相对于实施例1较小，这是由于实施例1中，盐酸阿霉素纳米粒本身具有一定的体积，因此包封于微球中会使微球的体积增大。
按照实施例1的方法测定本对比例制备的复合微球中的药物包封率，盐酸阿霉素的包封率为50.8％±1.36％，人参皂苷rh2的包封率为80.96％±1.12％，与实施例1相比，本对比例所制备的微球对盐酸阿霉素的包封率显著降低，这是由于盐酸阿霉素是水溶性药物，在微球搅拌固化的过程中，盐酸阿霉素会泄露至水相中，因此包封率降低。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，纳米粒载体材料的种类不同，分别用透明质酸钠(MW＝140KDa)和壳寡糖(MW＝3KDa)替换实施例1中的海藻酸钠(MW＝75KDa)和壳聚糖(MW＝50KDa)。其制备方法同实施例1。
本对比例制备的复合微球的扫描电镜图如图1中D图所示(测定方法同实施例1)，结果表明：本对比例所制备的微球外观与实施例1相似，大部分球型完整，表面光滑。
本对比例制备的盐酸阿霉素聚电解质纳米粒透射电镜图如图3中B图所示(测定方法同实施例1)，结果表明：本对比例制备的纳米粒外形与实施例1相似，均为球形，但是本对比例的纳米粒比实施例1制备的纳米粒粒径大。
按照实施例1的方法测定本对比例制备的复合微球中的药物包封率，盐酸阿霉素的包封率42.35％±1.69％，人参皂苷rh2的包封率为81.25％±2.46％，与实施例1相比，本对比例所制备的微球对盐酸阿霉素的包封率显著降低，可见，纳米粒载体材料的种类对复合微球的包封率具有较大影响，这可能是由于透明质酸钠与壳寡糖制备的纳米粒粒径比实施例1中海藻酸钠和壳聚糖制备的纳米粒粒径大，而微球的粒径相当，因此包封进微球的纳米粒减少，包封率降低。
实施例4
检测共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2复合微球、盐酸阿霉素纳米粒微球以及人参皂苷rh2微球的体外效果：精密称取实施例1、对比例1、对比例2所制备的微球各30mg置于7ml样品离心管中，加入磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.4，含0.2％吐温80)4ml，置于气浴摇床中，在37℃、200rpm的条件下恒温震荡，于第1、3、5、7、12、17、22、27、32、37、42、52、60、80、100、110d取出离心管，10000rpm离心5min，吸取全部上清液并测定其盐酸阿霉素和人参皂苷rh2的浓度；另外再加入等体积新鲜PBS(pH＝7.4，含0.2％吐温80)溶液于样品离心管中，置于摇床内继续震荡。用荧光光谱法测定释放介质中盐酸阿霉素的含量，取释放液3ml放入荧光专用检测皿中，在最大激发波长为488nm，最大发射波长为590nm处测定样品的荧光强度，计算样品中盐酸阿霉素的含量。用高效液相色谱法测定释放介质中人参皂苷rh2的含量，取释放介质1ml，用0.22μm的水系滤膜过滤到进样小瓶中，在波长为203nm，柱温40℃，流动相为乙腈：水＝50:50，进样速度1ml/min的条件下测定人参皂苷rh2的含量(结果分别见图4中的A图、B图、C图)。
实验结果显示，实施例1中盐酸阿霉素缓释时间可以达到110d，24h盐酸霉素的释放量仅为14.93％±0.73％，释放度为77.35％±1.69％，人参皂苷rh2的缓释时间为42天，24h人参皂苷rh2的释放量33.28％±1.79％，释放度为92.62％±0.11％，实现了盐酸霉素与人参皂苷rh2顺序释放的效果。对比例1中人参皂苷rh2的释放度为93.53％±3.48％，与实施例1相比，人参皂苷rh2的释放度没有明显差别，但是对比例1制备的微球人参皂苷rh2的突释很高，第一天释放就高达57.73％±3.43％，这是因为在微球固化过程中，溶于乙酸乙酯的人参皂苷rh2随着乙酸乙酯的挥发迁移至微球的表面，但是在实施例1中，微球中加入了盐酸阿霉素纳米粒，阻碍了大部分人参皂苷rh2往微球表面的迁移，因此突释降低，并且人参皂苷rh2和盐酸阿霉素纳米粒均匀分布于微球。
对比例2中盐酸阿霉素的释放度为100％±1.69％，与实施例1相比，释放速度快，缓释时间为60d，并且24h盐酸霉素的释放量为38.78％±1.73％，突释严重，这是因为盐酸阿霉素为水溶性药物，直接载入微球中由于其亲水性会迁移至微球表面，因此突释严重，但是实施例1中盐酸阿霉素通过静电结合作用载入海藻酸钠、壳聚糖纳米粒中，需要释放介质中的阳离子进入微球置换出盐酸阿霉素才能释放出来，因此盐酸阿霉素的释放减慢，缓释时间更长。而且对比例2制备的微球，盐酸阿霉素的释放速度比人参皂苷rh2还快，因此不能实现先释放人参皂苷rh2后释放盐酸阿霉素的顺序释药目的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将盐酸阿霉素与纳米粒载体材料制备成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒；
(2)将所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒分散于水中，形成纳米粒悬浮液，将所述纳米粒悬浮液分散于含有人参皂苷rh2和高分子聚合物的有机溶液中，制备得到S/W1/O初乳；
(3)将所述S/W1/O初乳加入含有乳化剂的水溶液中，制备得到S/W1/O/W2复乳；
(4)将所述S/W1/O/W2复乳固化成微球，收集所述微球，洗涤，干燥，即得所述共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球；
所述纳米粒载体材料为海藻酸钠和壳聚糖；
所述高分子聚合物为聚乳酸-羟基乙烯共聚物，所述高分子聚合物的分子量为20000～100000；
所述乳化剂为聚乙烯醇。
2.根据权利要求1所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：
S1.将盐酸阿霉素水溶液在搅拌条件下加入纳米粒载体材料A的水溶液中，再缓慢滴加纳米粒载体材料B的水溶液，形成盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液；
S2.将所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒混悬液离心，得纳米粒沉淀，将所得纳米粒沉淀加入冻干保护剂的水溶液中分散，冷冻干燥，即得所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒；
所述纳米粒载体材料A选自海藻酸钠或壳聚糖；
所述纳米粒载体材料B选自海藻酸钠或壳聚糖；
所述纳米粒载体材料A与所述纳米粒载体材料B不相同。
3.根据权利要求2所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述纳米粒载体材料A为海藻酸钠，所述纳米粒载体材料B为壳聚糖。
4.根据权利要求2所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述盐酸阿霉素水溶液中盐酸阿霉素的浓度为0.1～1mg/ml；所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度都为1～4mg/ml，所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的浓度比为1:0.8～5。
5.根据权利要求4所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述盐酸阿霉素水溶液、所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的体积比为1:0.8～1.2:1.8～2.2。
6.根据权利要求2所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述纳米粒载体材料A的水溶液和所述纳米粒载体材料B的水溶液的pH分别为5.5～6.5和5～6。
7.根据权利要求2所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂选自甘露醇和海藻糖中的一种或两种，所述冻干保护剂的水溶液的浓度为10～55mg/ml。
8.根据权利要求1-7任一项所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述有机溶液包含有机溶剂，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷和碳酸二甲酯中的一种或几种。
9.根据权利要求1-7任一项所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述有机溶液中高分子聚合物的浓度为50mg/ml～200mg/ml，人参皂苷rh2的浓度为2～4mg/ml。
10.根据权利要求1-7任一项所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述含有乳化剂的水溶液中乳化剂的浓度为10mg/ml～50mg/ml。
11.根据权利要求9所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述盐酸阿霉素聚电解质纳米粒与有机溶液的质量体积比为15～35mg:1ml。
12.根据权利要求9所述的共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球的制备方法，其特征在于，所述有机溶液与所述含有乳化剂的水溶液的体积比为1:1～12。
13.一种共载盐酸阿霉素纳米粒和人参皂苷rh2的复合微球，其特征在于，由权利要求1-12任一项所述的制备方法制备得到。
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