CN108552111A - 一种促进免疫低下模型小鼠食欲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及模型动物领域，具体是一种促进免疫低下模型小鼠食欲的方法，包括以下步骤：a)制作南极磷虾蛋白肽混合物：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32‑36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，灌胃量为20‑60g/kg，灌胃周期为10‑14天。本发明优点在于：提供了一种能有效促进改善免疫低下动物的食欲，且解决其食欲低下的问题的方法。
Description
技术领域
本发明涉及模型动物领域，具体地说，是一种促进免疫低下模型小鼠食欲的方法。
背景技术
生物活性肽是蛋白质中25个氨基酸通过肽键以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。近年来的研究表明，生物活性肽具有多种生物学功能：易消化吸收，提高饲料的适口性，促进摄食，提高饲料转化率，加快动物机体内蛋白质合成，提高生长速度等作用。其食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。海洋动物的生长环境与陆生动物截然不同，在长期的生物进化过程中，具有与陆生动物不同的基因组成及蛋白质结构，因此，海洋动物蛋白经生物酶解处理后的产物极有可能蕴含大量具有不同生物学功能的肽段。
南极磷虾隶属节肢动物门、甲壳纲、磷虾目，我们通常所说的南极磷虾一般指南极大磷虾(Euphausia superba Dana)，广泛分布于环南极水域，营养价值丰富，资源蕴藏量巨大，最新估计的现存量在6.5到10亿吨之间，目前广为接受的说法为5亿吨左右，是可供人类利用的海洋动物资源中蕴藏量最为丰富的一种，被视为人类潜在的、重要的后备蛋白库。目前，磷虾资源处于未充分开发状态，尚有巨大的开发利用潜力。研究表明，南极磷虾蛋白质酶解液将富含多种必需氨基酸，尤其是赖氨酸和谷氨酸，还富含生物活性肽。目前多见南极磷虾粉作为水产动物，如真鲷、三文鱼、淡水虹鳟鱼饲料蛋白源的相关研究，而对南极磷虾肽的开发及生物学活性的研究较少。中国专利号为ZL201010575072.0“南极大磷虾蛋白肽混合物的制备方法”公开了以南极磷虾为原料制备南极磷虾蛋白肽混合物，中国专利文献CN103834711A“冰鲜南极磷虾的蛋白水解产物的制备及其用途”则进一步公开了南极磷虾蛋白水解产物可作为组链霉菌发酵所需氮源，组链霉菌产生的总放线菌素产量与蛋白胨等现有商品化氮源组产量相当，且高效液相色谱-质谱分析结果表明南极磷虾蛋白水解产物组发酵产生放线菌素D的结构类似物多样性更好。但关于南极磷虾肽混合物的生物学功能和应用的研究比较少。
动物实验中发现免疫力低下的小鼠，普遍存在对食物缺乏欲望，表现为摄食行为不积极，摄食量下降，长期下去，不仅对消化道系统更对其生长发育产生严重影响，而食欲不振严重者会进一步引发厌食，引发身体一系列后续疾病反应。一般当遇到食欲不振时，可利用具有香味的食物，来刺激并且提高胃液的分泌及增进食欲。但是，目前市面上并没有一种高效价廉的改善食欲的保健食品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效促进改善免疫低下动物的食欲，且解决其食欲低下的问题的方法。
本发明解决上述问题的技术方案如下：通过给免疫低下模型小鼠膳食中补充海洋蛋白多肽粉的方式来实现促进其食欲的目的。具体采用灌胃方式给免疫低下模型小鼠补充南极磷虾蛋白肽混合物的方式，从摄食量和体重增加方面提供一种有效促进免疫低下模型小鼠食欲的方法。
本发明的第一方面，提供一种促进免疫低下模型小鼠食欲的方法，包括以下步骤：
a)制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；
b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，灌胃量为20-60g/kg，灌胃周期为10-14天。
本发明选择上述酶解液的水解度是以体外抗氧化活性的结果为参考依据的。水解度越高，表示蛋白质大分子被酶解成小片段的程度越高，根据文献报告，有生物学功能的多肽分子量范围大多在2-10KDa，如果水解程度过高，有生物学功能的多肽会被进一步水解成游离氨基酸，反而使其生物学功能降低。发明人做过不同水解度的肽液的体外抗氧化活性的实验结果也证实了这一点。
优选的，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中进行酶解(2-4h)，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600U/g碱性蛋白酶，52℃水浴中进行酶解4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度为32.4％。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入1000U/g碱性蛋白酶，55℃水浴中进行酶解2h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度是35.6％。
优选的，所述的步骤b用环丙酰胺对小鼠进行免疫缺陷造模，注射环丙酰胺一周后的小鼠经检测符合免疫低下模型动物标准。
本发明的第二方面，提供南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)在制备促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物中的应用，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成。
优选的，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中进行酶解(2-4h)，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。
本发明的第三方面，提供一种促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物，所述的食品或药物中包括南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液水解度为32-36％，干燥后制成。
优选的，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种能有效促进改善免疫低下动物的食欲，且解决其食欲低下的问题的方法；
2、本发明通过研究南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)是否具有提高免疫低下模型小鼠的食欲，提高其摄食量，从而实现开发南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)为人类功能性保健食品原料或者特殊营养强化剂可能。开发南极磷虾蛋白肽制品不仅可满足人们对食品的营养要求，更能满足人们对食品的保健方面的要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一种提高免疫低下小鼠食欲的方法
(1)南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备
冰冻南极磷虾——解冻——绞成磷虾肉糜——按照原料与水1：1的比例加入超纯水搅拌混匀——调至合适pH(9.5±0.5)——加入600U/g碱性蛋白酶——52℃水浴中进行酶解4h——沸水浴灭酶10min——冷却至室温——300目筛绢过滤除渣——滤液冷冻冻干——南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度为32.4％。
(2)利用环磷酰胺(80mg·kg-1，ip)制造免疫低下昆明种小鼠模型，经检测符合免疫低下模型动物标准。免疫低下模型小鼠分两组，一组小鼠每天灌胃步骤1中制备的南南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)(20g/kg)1次(免疫低下处理实验组)，另一组灌胃等量生理盐水(免疫低下处理对照组)，同时以正常免疫状态的小鼠每天灌胃等量生理盐水作为正对照(免疫正常组)。所有实验小鼠按照实验动物管理条例中的规定进行饲喂和管理。
(3)灌胃周期为10天。灌胃南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的免疫低下处理的实验组小鼠(免疫低下处理实验组)的摄食基本恢复至正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)的摄食水平，体重也与正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)的体重相当，而灌胃生理盐水的免疫低下处理的对照组小鼠(免疫低下处理对照组)的摄食量最少，体重增加最少。具体数据见表1。
表1昆明种小鼠灌胃前后体重及实验期内小鼠摄食量
注：同一列数字上标字母不同表示差异显著，字母相同表示无统计学差异。
实施例2
一种提高免疫低下小鼠食欲的方法
(1)南极磷虾蛋白肽混合物的制备
冰冻南极磷虾——解冻——绞成磷虾肉糜——按照原料与水1：3的比例加入超纯水搅拌混匀——调至合适pH(9.5±0.5)——加入1000U/g碱性蛋白酶——55℃水浴中进行酶解2h——沸水浴灭酶10min——冷却至室温——300目筛绢过滤除渣——滤液喷雾干燥——南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度是35.6％。
(2)利用环磷酰胺(80mg·kg-1，ip)制造免疫低下ICR小鼠模型，经检测符合免疫低下模型动物标准。免疫低下模型小鼠分两组，一组小鼠每天灌胃步骤1中制备的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)(60g/kg)1次(实验组)，另一组灌胃等量生理盐水(对照组)，同时以正常免疫状态的小鼠每天灌胃等量生理盐水作为正对照(正常组)。所有实验小鼠按照实验动物管理条例中的规定进行饲喂和管理。记录每天各组小鼠的摄食量，观察其摄食行为。
(3)灌胃周期为14天。灌胃南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的免疫低下处理的实验组小鼠(免疫低下处理实验组)的摄食基本恢复至正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)的摄食水平，体重也与正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)的体重相当，而灌胃生理盐水的免疫低下处理对照组小鼠(免疫低下处理对照组)的摄食量最少，显著低于前二组小鼠的摄食量。具体数据见表2。
表2 ICR小鼠灌胃前后体重及实验期内小鼠摄食量
注：同一列数字上标字母不同表示差异显著，字母相同表示无统计学差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (7)
1.一种促进免疫低下模型小鼠食欲的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)制作南极磷虾蛋白肽混合物：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物；
b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物，灌胃量为20-60g/kg，灌胃周期为10-14天。
2.根据权利要求1所述的促进免疫低下模型小鼠食欲的方法，其特征在于，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH 9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
3.根据权利要求1所述的促进免疫低下模型小鼠食欲的方法，其特征在于，所述的步骤b用环丙酰胺对小鼠进行免疫缺陷造模，注射环丙酰胺一周后的小鼠经检测符合免疫低下模型动物标准。
4.南极磷虾蛋白肽混合物在制备促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物中的应用，其特征在于，所述的南极磷虾蛋白肽混合物是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成。
5.根据权利要求4所述的南极磷虾蛋白肽混合物在制备促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物中的应用，其特征在于，所述的南极磷虾蛋白肽混合物的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH 9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
6.一种促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物，其特征在于，所述的食品或药物中包括南极磷虾蛋白肽混合物，所述的南极磷虾蛋白肽混合物是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成。
7.根据权利要求6所述的促进免疫低下模型小鼠食欲的食品或药物，其特征在于，所述的南极磷虾蛋白肽混合物的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
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