CN102465165B - 一种制备生物活性肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备生物活性肽的方法。该制备生物活性肽的方法，包括如下步骤：a)把活性干酵母与水混合形成酵母乳；b)通过把所述酵母乳进行酶解生成生物活性肽。本发明的制备生物活性肽的方法，通过以活性干酵母为原料，经过把活性干酵母与水混合，并进行酶解，可以得到生物活性肽。该制备方法是以与以往的原料不同的原料来制备生物活性肽的方法，丰富了制备生物活性肽的方法，使得本领域的技术人员在制备生物活性肽时具有更大的可以选择的空间和余地。

Description

一种制备生物活性肽的方法

技术领域

本发明涉及制备生物活性肽的方法。

背景技术

生物活性肽是一类结构相对简单并且具有特殊生理活性的小分子蛋白物质。从营养学角度来说，肽类比同一氨基酸组成的蛋白质的消化吸收率要高，且风味优于单个氨基酸，也不易产生过敏现象。此外，以肽类作为动物氮源的机体蛋白质合成率也高于相应的氨基酸，这说明肽类物质在生物体内具有较高的利用率。

生物活性肽分子质量在180～1000u(单位)之间，呈一定氨基酸顺序的小肽、寡肽、低聚肽，具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤等多种生理活性作用，可获得更高的生物效价和营养价值，是目前研究的热点之一。

长期以来，营养学界一直认为蛋白质消化后主要以游离氨基酸(FAA)的形式被吸收，没有认识到小肠对蛋白质或肽吸收具有生理学意义。蛋白质的消化起始于胃，首先盐酸使之变性，三维结构的蛋白质分解成单股、肽键暴露，在胃蛋白酶和糜蛋白酶等内切酶的作用下，蛋白质分子降解为含氨基酸数量不等的各种多肽。完整肽被小肠细胞吸收后以肽或氨基酸形式释放入血液。Kushak等人在1993年发现以肽的形式存在的氨基酸的吸收比游离氨基酸的吸收速度要快。特别对于幼龄动物，小分子肽比大分子肽有更高的营养价值。

目前制取生物活性肽的原料多采用大豆、花生、鱼粉等。

发明内容

但是，生物活性肽的需求较大，因此有必要开发更多种的制备生物活性肽的方法。

鉴于上述情况，本发明人查阅资料之后发现，以活性干酵母作为原料研究未见报道。然而，活性干酵母本身含有50％左右的蛋白质，氨基酸含量也非常齐全，且富含有B族维生素、丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。随着酵母应用范围的拓展，我国活性干酵母的年产量也逐年增加，酵母工业增长势头强劲，年平均递增超过20％。2008年，国内活性干酵母生产量已达20万吨。酵母工业作为生物工程产业的一个重要组成部分，有着广阔的发展前景。因此，本发明人考虑是否能够使用活性干酵母为原料来制备生物活性肽。

因而，本发明所要解决的技术问题在于，提供一种以与以往的原料不同的原料来制备生物活性肽的方法，拓宽制备生物活性肽的方法的领域，为本领域的技术人员提供另外的可以选择制备生物活性肽的方法。

为此本发明人经过潜心钻研，终于成功研发了一种以与以往的原料不同的原料来制备生物活性肽的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种制备生物活性肽的方法，包括如下步骤：

a)把活性干酵母与水混合形成酵母乳；

b)通过把所述酵母乳进行酶解生成生物活性肽。

优选地，在步骤b)中，在所述进行酶解的过程中使用的酶为木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶。

优选地，所述步骤b)的具体实现为：

b1)把酵母乳连续自溶；

b2)加入酶，进行酶解；

b3)分解之后进行离心分离；

b4)把离心分离得到的上清液进行浓缩，得到浓缩液；

b5)干燥所述浓缩液得到生物活性肽。

本发明还提供一种制备生物活性肽的方法，包括如下步骤：

1)将活性干酵母加水配制成10～22％的酵母乳，通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把酵母乳的pH调节至4.7～5.3；

2)升温至46.5～48.5℃之后，保温10～15小时，在保温期间进行搅拌；

3)升温至54～56℃；

4)通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把pH调节至5.8～6.0；

5)加入木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶，加入的木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶分别占所述活性干酵母的重量的0.05％～0.3％和0.05％～0.3％，进行酶解4～8小时；

6)离心分离；

7)把上清液浓缩，得到浓缩液；

8)干燥即可得到生物活性肽。

优选地，在步骤5)之后步骤6)之前，还有灭酶处理的步骤。

优选地，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为20分钟以上。

优选地，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为25分钟以上35分钟以下。

优选地，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为30分钟。

优选地，得到的浓缩液的浓度为35重量％以上。

优选地，所述干燥为喷雾干燥。

本发明的制备生物活性肽的方法，通过以活性干酵母为原料，经过把活性干酵母与水混合，并进行酶解，可以得到生物活性肽。该制备方法是以与以往的原料不同的原料来制备生物活性肽的方法，丰富了制备生物活性肽的方法，使得本领域的技术人员在制备生物活性肽时具有更大的可以选择的空间和余地。

具体实施方式

为了使得本领域的技术人员能够更加清楚地了解本发明的各个技术方案，下面将进行详细的阐述。

本发明的一个目的(第一目的)是提供一种以与以往的原料不同的原料来制备生物活性肽的方法，拓宽制备生物活性肽的方法的领域，为本领域的技术人员提供另外的可以选择制备生物活性肽的方法。

为了达到上述发明目的，本发明提供的第1个技术方案是，一种制备生物活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)把活性干酵母与水混合形成酵母乳；

b)通过把所述酵母乳进行酶解生成生物活性肽。

在该技术方案中，本发明的制备生物活性肽的方法，以活性干酵母为原料来制备生物活性肽。目前，活性干酵母的产量很大，而生物活性肽的需求也比较旺盛，因此，本发明的第1个技术方案的出现，既可以有效地利用活性干酵母，又可以部分地缓解和满足市场上对于生物活性肽的需求。

本发明提供的第2个技术方案是对第1个技术方案的改进，其改进之处在于，在所述步骤b)中，在所述进行酶解的过程中使用的酶为木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶。

在进行酶解的过程中只有使用特定的酶才能够将酵母乳进行酶解，得到生物活性肽。需要说明的是，在本发明提供的用于酶解的酶是木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶的组合，不能够单独使用木瓜蛋白酶，也不能够单独使用细菌蛋白酶，因为如果单独使用木瓜蛋白酶或者单独使用细菌蛋白酶都不能够使得上述酵母乳酶解，不能够得到生物活性肽。

本发明提供的第3个技术方案是对第1个技术方案或者对第2个技术方案的改进，其改进之处在于，所述步骤b)的具体实现为：

b1)把酵母乳连续自溶；

b2)加入酶，进行酶解；

b3)分解之后进行离心分离；

b4)把离心分离得到的上清液进行浓缩，得到浓缩液；

b5)干燥所述浓缩液得到生物活性肽。

通过使得酵母乳连续自溶，使得酵母乳更加均匀分散，在加入酶之后能够在均一的环境下进行酶解。酶解之后的产物是悬浮液，如果要得到生物活性肽，需要对该悬浮液进行离心分离，离心分离的作用是把上清液中的酶解所得到的生物活性肽与沉淀物分离开来，得到浓缩液，之后对该浓缩液进行干燥即可得到生物活性肽。

本发明的另一个目的(第二目的)是提供一种制备生物活性肽的方法，该制备生物活性肽的制备方法，在制备活性肽时需严格控制酶解条件，既要保证蛋白质能够充分酶解，使更多的活性肽段被水解出来，同时又要适当控制酶解程度，获得较高活性的产物，不至于生成寡肽，或者说生成的寡肽的量很少。

为了能够更好地使得本领域的技术人员更好地理解提出上述发明目的的原因，首先对一些背景的资料进行描述。

目前，制取生物活性肽的方法有很多，许多学者对此进行了研究，并获得了一系列生物活性肽(也可以简称为活性肽)。许庆陵等用木瓜蛋白酶酶解鲢鱼制得降血压肽，体外实验表明ACE(angiotensin converting enzyme)抑制率达80％以上。董士远等用胰蛋白酶酶解紫贻贝，其酶解液对于病原菌Botryiscinerea的抑菌率达60％以上。这些现有技术大多采用大豆、花生、鱼粉为原料，采用廉价的活性干酵母作为原料的研究报道则没有。目前的获得生物活性肽的方法主要有酶解法、物理化学处理法和微生物发酵法。其中，(1)酶解法成本高而且酶反应受多种因素的影响，其生产的小肽往往带有苦味；酶水解蛋白质的方法的优点是：具有反应条件温和，反应时间短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离，成本低廉等优点，优于传统的化学水解法，是制备活性肽较好的方法。(2)物理化学处理法在加热、超声波、盐酸等条件的作用下，均会导致蛋白质不同程度的变性。(3)微生物发酵法是利用微生物丰富的酶系，降解发酵后的豆粕，其蛋白质结构发生了改变，相对分子质量降低。

随着养殖业的不断发展，人畜争粮矛盾日益突出，饲料资源的开发与有效利用尤为重要，人们也逐渐的关注到酵母这个新型饲料资源。酵母在畜牧业生产中得到了实际应用。活性酵母应用于动物饲养中，起源于二十世纪20年代，最早是用做反刍动物的蛋白质补充剂。随后至50年代，人们发现在反刍动物日粮中添加低剂量的活性酵母培养物能提高阉牛的日增重和奶牛的产奶量。现在，通过国内外大量的试验证实：在动物日粮中添加活性酵母，对改善动物对营养物质的消化吸收，提高动物的健康状态，促进生产性能的发挥等具有明显的作用。主要作用机理至今尚无定论，活性酵母及代谢产物中含有未知生长因子促进剂。酵母中含有丰富的蛋白质、各种氨基酸、B族维生素及寡聚糖等营养物质，是饲料中营养的有益补充。活性酵母作为一种真菌益生素具有广阔的研究和开发前景，并且具有巨大的经济效益和社会效益。

结合上述的现有的技术以及背景资料，综合来说，本发明的第二目的就是要充分利用活性酵母资源，开发出一种制备生物活性肽的方法，它既能够保证蛋白质能够充分酶解，使更多的活性肽段被水解出来，同时又能够适当控制酶解程度，获得较高活性的产物。

为了达到上述本发明的第二目的，本发明提供的第4个技术方案是一种制备生物活性肽的方法，包括如下步骤：

1)将活性干酵母加水配制成10～22％的酵母乳，通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把酵母乳的pH调节至4.7～5.3；

2)升温至46.5～48.5℃之后，保温10～15小时，在保温期间进行搅拌；

3)升温至54～56℃；

4)通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把pH调节至5.8～6.0；

5)加入木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶，加入的木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶分别占所述活性干酵母的重量的0.05％～0.3％和0.05％～0.3％，进行酶解4～8小时；

6)离心分离；

7)把上清液浓缩，得到浓缩液；

8)干燥即可得到生物活性肽。

本发明采用自溶法从啤酒废酵母中制取生物活性肽。其中，自溶温度、时间、pH、自溶促进剂(本发明是指柠檬酸或者氢氧化钠)等是影响啤酒废酵母自溶的几个主要因素，本发明通过控制这些参数既能够保证蛋白质能够充分酶解，使更多的活性肽段被水解出来，同时又能够适当控制酶解程度，获得较高活性的产物。

另外，本发明经过多次实验室小试和工厂试验，实验结果表明：从活性干酵母中提取活性肽的工艺可行，酵母蛋白经水解后，大部分被降解成二肽、三肽，极少量被降解为大分子肽(或者称之为多肽)，也极少量被分解为寡肽。最终产品具有很浓的香味，具有一定的诱食效果。

下面对第4个技术方案的各个步骤分别进行说明。

步骤1)：将活性干酵母加水配制成10～22％的酵母乳，通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把酵母乳的pH调节至4.7～5.3。

在本步骤中，百分比指的是重量百分比。

之所以把酵母乳配制成10～22％的浓度，是因为：如果酵母乳浓度小于10％，则提取酵母活性肽的得率较低；如果酵母乳浓度大于22％，将影响酵母自溶程度，不利于活性肽的降解和得率。

在本步骤中，柠檬酸和/或氢氧化钠是适用于本发明的自溶促进剂，而且必须选用这样的自溶促进剂。例如，虽然氢氧化钾也是碱性物质，但是却不能够替代本发明的氢氧化钠，将致使产品中K离子含量过高，影响动物生长性能。

酵母乳的pH调节为4.7～5.3的原因在于：如果酵母乳的pH小于4.7，不利于酵母的自溶降解，不离于酵母破壁。如果酵母乳pH大于5.3，同样酵母的自溶降解程度即受到影响。

步骤2)：升温至46.5～48.5℃之后，保温10～15小时，在保温期间进行搅拌。

之所以升温至46.5～48.5℃，是因为：如果温度低于46.5℃，那酵母的自溶速率将受到影响；如果温度高于48.5℃，酵母的自溶降解程度将受到影响。

保温时间需要在10～15小时，原因在于，如果保温时间小于10小时，酵母的自溶不完全；如果保温时间大于15小时，那么时间太长，浪费时间。

之所以进行搅拌，是为了是酵母自溶速率加快，酵母充分降解自溶。

步骤3)：升温至54～56℃。

步骤4)：通过使用柠檬酸和/或氢氧化钠把pH调节至5.8～6.0。

之所以升温至54～56℃是因为：如果温度低于54℃，不利与酶活性的发挥；如果温度高于56℃，那么酶活力将受到一定抑制，无法发挥酶解作用。

之所以使用柠檬酸和/或氢氧化钠的原因与步骤1)中的相同。

之所以把pH调节至5.8～6.0，是因为：如果pH小于5.8，不利与酶活性的发挥；如果pH大于6.0，同样抑制酶活力的发挥。

步骤5)：加入木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶，加入的木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶分别占所述活性干酵母的重量的0.05％～0.3％和0.05％～0.3％，进行酶解4～8小时。

在本步骤中，必须使用木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶的组合，不能够单独使用木瓜蛋白酶，也不能够单独使用细菌蛋白酶，因为如果单独使用木瓜蛋白酶或者单独使用细菌蛋白酶都不能够使得上述酵母乳酶解，不能够得到具有上述特点的生物活性肽。

之所以加入木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶的特定的重量和采用特定的酶解时间，也是为了既能够保证蛋白质能够充分酶解，使更多的活性肽段被水解出来，同时又能够适当控制酶解程度，获得较高活性的产物。

步骤6)：离心分离。

步骤7)：把上清液浓缩，得到浓缩液。

步骤8)：干燥即可得到生物活性肽。

步骤6)～步骤8)是为了能够快速地得到生物活性肽。

在步骤5)之后步骤6)之前还需要有灭酶处理，灭酶处理是为了使得酶失去活性，灭酶处理优选使用的条件是：温度为80～95℃，时间为20分钟以上。最优选为30分钟以上。

以上是对本发明的第4个技术方案的各个步骤的分别说明，下面说明对这些技术方案的改进方案。

本发明提供的第5个技术方案是对第4个技术方案的改进方案，其改进之处在于，在步骤5)之后步骤6)之前，还有灭酶处理的步骤。

灭酶处理可以使得木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶失去活性，以使得在后续的操作中不会继续进行酶解，从而保持了良好的酶解后的肽的种类的分布，即保持具有二肽、三肽为主体，多肽和寡肽为较少量的状态。

本发明提供的第6个技术方案是对第5个技术方案的改进方案，其改进之处在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为20分钟以上。

采用上述的灭酶处理温度和时间，既可以保证实现灭酶处理，又可以保证实现不太浪费资源。例如如果灭酶处理的温度小于80℃，时间小于20分钟，那么则有可能存在有一定数量的未失去活性的酶。

本发明提供的第7个技术方案是对第5个技术方案的改进方案，其改进之处在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为25分钟以上35分钟以下。

在上述灭酶处理的温度下，在35分钟以下既可以实现灭酶处理，而不需要再延长时间，使得加热的热能无谓地消耗。

本发明提供的第8个技术方案是对第5个技术方案的改进方案，其改进之处在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为30分钟。

此方案为最为优选的方案，在该条件下，既能够实现灭酶处理的效果，又那能够进一步改进生物活性肽中的肽的种类的分布。

本发明提供的第9个技术方案是对第4～8个技术方案的改进方案，其改进之处在于，得到的浓缩液的浓度为35重量％以上。

浓缩液在35重量％以上，将有益于后面的干燥步骤，使得干燥的能量消耗不至于太大。

本发明提供的第10个技术方案是对第4～9个技术方案的改进方案，其改进之处在于，所述干燥为喷雾干燥。

采用喷雾干燥的有益效果在于该干燥工艺速度快，产品含水量低，产品细度高且均匀。

下面列举具体的实施例

实施例1

称取活性干酵母，将活性干酵母加水配制成18％的酵母乳，加入占所述活性干酵母的重量3％的柠檬酸，调节pH至4.7-5.3。

保温处理：把调节好的酵母乳升温至47.5±1℃，保温13小时，连续搅拌；

升温处理：保温完成后升温至55±1℃；

调节pH：升温后，调节pH＝5.9±0.1；

加酶处理及灭酶：pH调节好之后，木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶各加入占所述活性干酵母的重量0.15％的量，作用6小时；

升温至85℃，灭酶30分钟；

分离及浓缩处理：灭酶后采用离心机离心取上清液，将上清液浓缩至35％。

采用喷雾干燥对悬浮液进行干燥；干燥后的产品即为酵母活性小肽产品。

实施例2

称取活性干酵母，将活性干酵母加水配制成18％的酵母乳，用柠檬酸和氢氧化钠，调节pH至5.0。

保温处理：把调节好的酵母乳升温至46.5℃，保温13小时，连续搅拌；

升温处理：保温完成后升温至56℃；

调节pH：升温后，调节pH＝6.0；

加酶处理及灭酶：pH调节好之后，木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶各加入占所述活性干酵母的重量0.20％的量，作用8小时；

升温至90℃，灭酶29分钟；

分离及浓缩处理：灭酶后采用离心机离心取上清液，将上清液浓缩至36％。

采用喷雾干燥对悬浮液进行干燥；干燥后的产品即为酵母活性小肽产品。

实施例3

称取活性干酵母，将活性干酵母加水配制成18％的酵母乳，用柠檬酸和氢氧化钠，调节pH至5.3。

保温处理：把调节好的酵母乳升温至48.5℃，保温10小时，连续搅拌；

升温处理：保温完成后升温至54℃；

调节pH：升温后，调节pH＝5.8；

加酶处理及灭酶：pH调节好之后，木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶各加入占所述活性干酵母的重量0.10％的量，作用8小时；

升温至88℃，灭酶30分钟；

分离及浓缩处理：灭酶后采用离心机离心取上清液，将上清液浓缩至36.5％。

采用喷雾干燥对悬浮液进行干燥；干燥后的产品即为酵母活性小肽产品。

实施例4

称取活性干酵母，将活性干酵母加水配制成15％的酵母乳，用柠檬酸和氢氧化钠，调节pH至5.0。

保温处理：把调节好的酵母乳升温至48.5℃，保温15小时，连续搅拌；

升温处理：保温完成后升温至55℃；

调节pH：升温后，调节pH＝5.9；

加酶处理及灭酶：pH调节好之后，木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶各加入占所述活性干酵母的重量0.18％的量，作用7小时；

升温至85℃，灭酶30分钟；

分离及浓缩处理：灭酶后采用离心机离心取上清液，将上清液浓缩至35％。

采用喷雾干燥对悬浮液进行干燥；干燥后的产品即为酵母活性小肽产品。

实验结果表明：上述实施例的从活性干酵母中提取活性肽的工艺可行，酵母蛋白经水解后，大部分被降解成二肽、三肽，极少量被降解为多肽。产品具有很浓的香味，具有一定的诱食效果。

采用上述制备方法制备得到的生物活性肽进行肉鸡养殖，实验结果表明：酵母活性肽可提高肉鸡生长速率3％，能替代部分饲料蛋白原料，降低饲料成本。

采用上述制备方法制备得到的生物活性肽进行保育仔猪养殖，实验结果表明：酵母活性肽促进仔猪采食5％，可使料肉比降低4％，提高了饲料转化率。

具体的肉鸡养殖试验为：试验选用1日龄白羽肉鸡200羽，随机分成4组，每组5个重复，每个重复10羽。4个处理组：对照组(基础日粮)，试验组分别0.5％、1％、2％的酵母活性肽添加剂，试验共6周。实验结果表明：1)在肉鸡日粮中添加0.5～2％的酵母活性肽肉鸡精神正常，死淘率相对于对照组未见增加，其中添加1％的酵母活性肽相对于对照组，平均日增重提高3％。具有很好的促生长作用。2)额外添加1％和2％酵母活性肽，肉鸡饮水量增加，生长迅速。3)酵母活性肽可以替代部分蛋白原料，降低饲料成本。

另外，试验结果表明：酵母活性肽(指的是利用酵母为原料所制备的生物活性肽)作为一种饲料添加剂、生长促进剂，也可作为饲料蛋白补充原料，富含酵母细胞发酵代谢产物、多种微量元素和高纯度生物活性肽，可以用于畜禽、水产、反刍等动物养殖，也可用于人类营养保健当中。

比较例1

比例例1与实施例1的不同之处仅在于，在“加酶处理及灭酶”的步骤中，仅使用木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的使用量为0.15％。

比较例2

比较例2与实施例1的不同之处仅在于，在“加酶处理及灭酶”的步骤中，仅使用细菌蛋白酶，木瓜蛋白酶的使用量为0.15％。

但是实验结果表明，比较例1和比较例2均不能得到“大部分被降解成二肽、三肽，极少量被降解为多肽”的技术效果。

Claims (7)

1.一种制备生物活性肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将活性干酵母加水配制成10～22％的酵母乳，通过使用柠檬酸和／或氢氧化钠把酵母乳的pH调节至4.7～5.3；

2)升温至46.5～48.5℃之后，保温10～15小时，在保温期间进行搅拌；

3)升温至54～56℃；

4)通过使用柠檬酸和／或氢氧化钠把pH调节至5.8～6.0；

5)加入木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶，加入的木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶分别占所述活性干酵母的重量的0.05％～0.3％和0.05％～0.3％，进行酶解4～8小时；

6)离心分离；

7)把上清液浓缩，得到浓缩液；

8)干燥即可得到生物活性肽。

2.根据权利要求1所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，在步骤5)之后步骤6)之前，还有灭酶处理的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为20分钟以上。

4.根据权利要求2所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为25分钟以上35分钟以下。

5.根据权利要求2所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述灭酶处理的温度为80～95℃，时间为30分钟。

6.根据权利要求1所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，得到的浓缩液的浓度为35％以上。

7.根据权利要求1所述的制备生物活性肽的方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥。