CN108546699B - 硝化菌群固定化小球的制备及应用 - Google Patents

硝化菌群固定化小球的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硝化菌群固定化小球的制备工艺，包括以下步骤：(1)称取1.3‑1.8重量份的海藻酸钠和2.2‑2.7重量份的贝壳粉，加入到40‑45重量份、65‑85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；(2)向混合液I中加入5‑10重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为3.5‑5％的CaCl2水溶液中；静置，交联，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。本发明大大提高固定化小球的机械强度，提高了使用期限。同时，所述硝化菌群固定化小球大大增强了硝化细菌降解氨氮和亚硝酸盐的能力，采用了吸附和成球效果好的无毒包埋材料，对环境无二次污染。

Description

硝化菌群固定化小球的制备及应用
技术领域
本发明属于水产养殖领域，具体涉及降解养殖废水中氨氮和亚硝酸盐的方法，尤其涉及用于降解氨氮和亚硝酸盐的硝化菌群固定化小球的制备及应用。
背景技术
水产养殖集约化的快速发展带来了显著的经济效益，但同时也面临最大的难题——养殖系统中水污染的控制；特别是养殖过程中产生的废料残饵、动物排泄物等引起的氨氮、亚硝酸盐和有机物污染物超标的问题。养殖水体中过高浓度的氨氮和亚硝酸盐对鱼虾类的存活、生长代谢、组织结构、生理和免疫功能等均具有较强的毒性，严重威胁水产养殖动物的正常生长和健康。同时，这些污染物超标的养殖废水未经处理被任意排放，可直接导致近海水域的富营养化和周边生态环境的破坏。2017-2018年水产养殖业的污染防治工作迎来了最严厉的监管，浙江省严禁水产养殖场所污水污泥任意排放，要求排入海水水域的化学需氧量COD小于6-10mg/L，非离子氨(以N计)小于0.06-0.1mg/L。因此，对高排污的南美白对虾养殖业，同步高效地去除养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的技术具有重要的意义。
为了解决上述问题，研究人员采用芽孢杆菌和硝化细菌降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐。孟睿等(孟睿，何连生，席北斗等，环境科学与技术，2009，32(11):28-31.)用芽孢杆菌处理罗非鱼养殖废水，6天后COD和亚硝酸盐分别降至84.44mg/L和0.07mg/L，降解率为50.32％和99.15％，但对氨氮无明显降解；采用硝化细菌处理，6天氨氮和亚硝酸盐分别降至2.09mg/L和0.09mg/L，降解率为74.48％和98.90％，但对COD无明显降解。高金伟等(高金伟，张海红，陈瑞楠等，天津农学院学报，2014(1):5-8.)利用硝化细菌与枯草芽孢杆菌联合处理淡水鱼类养殖废水，在第5日氨氮降解率可达82.16％，亚硝酸氮降解率可达94.62％，但COD降解率仅为25％左右。由此可见，在养殖废水处理中仅芽孢杆菌或硝化细菌单一菌种均无法同步去除废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐；而且芽孢杆菌和硝化细菌以游离菌方式联合处理无法实现同步高效降解。
固定化微生物技术因能纯化和保持高效菌种，承受有毒物质冲击及高效降解废水的功能，被广泛应用。H.Shan等(Shan H,Obbard J P.,Applied Microbiology&Biotechnology,2001,57(5-6):791.)利用陶土颗粒固定化硝化细菌处理对虾养殖废水，6天后氨氮从3.5mg/L降至0mg/L。N.J.Manju等(Manju N J,Deepesh V,Cini A,etal.Aquaculture,2009,294(1-2):65-75.)利用木屑颗粒固定化硝化细菌处理对虾养殖废水，7天后氨氮从15mg/L降至为0mg/L。李秋芬等(李秋芬,张艳,王印庚，水产学报，2006，30(6):852-856.)将海水中分离的枯草杆菌、亚硝化单胞菌、盐单胞菌和红球菌制成复合菌制剂，并采用游离菌和生物膜法连用方法处理大菱鲆育苗养殖废水，5天后COD和氨氮分别降至1.57mg/L和0.06mg/L，降解率为73.1％和80.0％。然而，现有技术中，多采用芽孢杆菌与硝化细菌，还有光合细菌，酵母菌，反硝化细菌，乳酸菌、微量元素、辅料(多为有机物)等按一定比例简单混合，制成速效净水剂类的复合菌剂。然而，这些混合菌的生长繁殖速度均比硝化细菌快，在一定程度上抑制了硝化细菌的生长，从而影响了利用硝化细菌去除水体中氨氮和亚硝酸盐的效果。其次这类净水剂多直接往水体中投加，容易造成菌体随水流失影响使用效果。
与异养硝化细菌相比，自养硝化细菌具有更强的去除氨氮和亚硝酸盐的能力，但在自然生态系统中，尤其在有机物含量高的养殖水体中，自养硝化细菌无法与异养细菌竞争，难以维持较高的细胞浓度，从而直接影响养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的去除效果，无法在短时间内高效降解氨氮和亚硝酸盐。
发明专利ZL200810198302.9公开了“一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺”。该工艺包括硝化细菌浓缩液的制备、硝化细菌固定化颗粒的制备、硝化细菌固定化颗粒的活化、硝化细菌固定化颗粒反应包的制备以及反应包去除养殖废水亚硝酸盐。其中，硝化细菌固定化颗粒的制备是将聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后向包埋液中加入包埋用硝化细菌浓缩液，混匀后滴入到交联剂中，交联剂由氯化钙溶液和饱和硼酸溶液按1:1～1:3的体积比例混合，用纱布滤出固定化颗粒。该工艺亚硝酸盐降解效果快速、持续、稳定、可以长时间维持高的生物活性、反应包可反复使用、反应包制作方法简单、成本低，有可观的应用前景。然而，该申请采用了聚乙烯醇，毒性比较大，在环境中易引起二次污染；固定化对硝化作用无提高的作用，且仅用于亚硝酸盐的去除。
发明内容
针对现有技术降解养殖废水中亚硝酸盐的所存在的问题，本发明提供了一种硝化菌群固定化小球的制备工艺，以及将所述硝化菌群固定化小球用于降解养殖废水中氨氮和亚硝酸盐。本发明通过固定化的方法显著提高了硝化菌群的硝化作用,避免其他菌对硝化菌群的竞争；同时提高了硝化菌群的使用效率且环境友好性。
本发明的技术方案：
硝化菌群固定化小球的制备工艺，包括以下步骤：
(1)称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
(2)向步骤(1)得到的混合液I中加入5-10重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；所述硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml。
(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为3.5-5％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。所述静置的温度条件为3-5℃。本发明选用吸附和成球效果好的无毒包埋材料，利用多孔的贝壳粉的吸附作用及弱碱性(主要成分碳酸钙)，将氨氮和亚硝酸盐吸附在固定化小球内，使硝化作用的底物浓度局部升高，从而在有机物含量高的养殖废水中为硝化菌群创造了适宜的生境。
其中，所述硝化菌群固定化小球的粒径为3-5mm，机械强度为100-130mN。采用包埋剂海藻酸钠与交联剂氯化钙，通过正交实验优化了固定化配方，从而提高机械强度，延长了使用寿命。通过固定化，使其他细菌与硝化菌群在空间上相互隔离，避免了形成竞争关系。此外，通过固定化，使硝化菌群的硝化作用提高了将近100％，从而大大提高了养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐的降解效率。
其中，步骤(1)所述的硝化菌群通过如下步骤得到：
(I)富集：无菌条件下采集适量养殖虾塘底泥置于无菌密封培养瓶中，加入初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20mg/L的无菌富集培养液，调节pH值至7.5-8.5通入无菌空气进行定向富集培养；当pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回至7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养。当体系中的氨氮和亚硝酸浓度数次低于0.1mg/L时，取上层培养液，待用。步骤(1)所述的无菌富集培养液由适量(NH4)2SO4、NaNO2和盐度28-30‰的海水配制得到；所述的无菌硝化细菌生长培养液由以下组分组成：3.3g(NH4)2SO4、0.41g KH2PO4、0.75ml 1mol/L的MgSO4；0.2ml 1mol/L的CaCl2、0.33ml 30mmol/L FeSO4-50mmol/L EDTA；0.02ml 50mmol/L的CuSO4。
(II)连续培养：取适量步骤(I)得到的上层培养液，按照1:1-1:2的体积比接种于无菌海水中，加入无菌硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为10-15mg/L，调节pH值至7.5-8.5，通入无菌空气进行定向连续培养；pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养，反复多次。当镜检活菌数达到1×107-1×108个/ml，即得到所述的硝化菌群。经离心浓缩，至硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml后，用于制备硝化菌群固定化小球。采集养殖虾塘底泥进行硝化细菌富集和连续培养，直接利用养殖环境中的土著硝化菌群，具有更好的环境适应性，且具菌群多样性。
硝化菌群固定化小球的应用，将其应用于养殖废水中氨氮、亚硝酸盐的降解。具体步骤为：将适量硝化菌群固定化小球投入养殖废水中，适宜温度条件下，通气，直至氨氮浓度和亚硝酸盐的浓度均低于0.1mg/L。所述硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml。所述的温度条件为24-30℃，所述通气的时间为24-48h。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了硝化菌群固定化的新工艺，不但大大增强了硝化菌群降解氨氮和亚硝酸盐的能力，而且采用了吸附和成球效果好的无毒包埋材料，对水体中氨氮和亚硝酸盐有一定的吸附作用，使硝化作用的底物浓度在小球内局部升高，有利于硝化菌群生长，所用材料对环境无二次污染。
(2)本发明通过优化工艺，大大提高固定化小球的机械强度，提高了使用期限，减少了工作量，降低了成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：硝化细菌的富集和连续培养
(1)富集-分离阶段：
无菌条件下采集100g养殖虾塘底泥置于3L无菌密封培养瓶中，加入1L由(NH4)2SO4、NaNO2和海水(盐度28‰)配制的初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20mg/L的无菌富集培养液，用NaHCO3调pH至8.3，通入无菌空气进行定向富集培养。当pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回。当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液((NH4)2SO4 3.3g；KH2PO4 0.41g；1mol/L MgSO4 0.75ml；1mol/L CaCl2 0.2ml；30mmol/L FeSO4/50mmol/L EDTA 0.33ml；50mmol/L CuSO4 0.02ml)，调至氨氮终浓度为10-15mg/L。25℃，继续充气培养。当培养液的氨氮和亚硝酸浓度多次出现低于0.1mg/L时，取上层培养液进行连续培养。
(2)连续培养阶段：
取上层培养液以1:1比例接种于无菌海水中，加入硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为10-15mg/L，pH8.3，进行充气培养。每2-4天测氨氮和亚硝酸盐浓度以及pH，及时补加生长培养液至氨氮终浓度为10-15mg/L；补加NaHCO3调pH至8.3。镜检活菌数，达到1010个/ml，得到硝化菌群。
实施例2：硝化菌群高通量测序分析
取连续培养的硝化菌群15mL，用10％盐酸预处理后置于100mL离心管13000×g离心20min，弃去上清液收集沉淀于2mL离心管中。采用北京天根公司快速DNA提取检测试剂盒(KG203)提取DNA，于-20℃冻存备用。DNA浓度和纯度通过超微量分光光度计测定。
委托上海派森诺生物科技股份有限公司，利用IlluminaMiSeq平台对16SrRNA基因V4区进行高通量测序，采用滑动窗口法对双端的FASTQ序列做质量过滤，利用软件FLASH对通过质量过滤的序列进行连接，对连接上的序列进行过滤和去除嵌合体，得到优质序列。基于OTU聚类和注释的分析结果，在各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析。
高通量分析结果显示，硝化菌群中变形菌门(Proteobacteria，61.10％)占绝对优势，具有自养硝化功能的类群丰度达12.69％(主要包括亚硝化单胞菌属、硝化刺菌属、硝化球菌属、硝化杆菌属和硝化螺菌目)并呈高多样性。此外，硝化菌群中还包含丰度达47.44％的具有反硝化功能或者潜在反硝化功能的优势菌群和丰度达12.85％的光合细菌，是高有机负荷下硝化作用的重要补充，并可通过反硝化作用实现真正脱氮。
实施例3：硝化菌群的固定化及应用
(1)称取1.3重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到45重量份、温度条件为65℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
(2)向步骤(1)得到的混合液I中加入5重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；所述硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml。
(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中；在3℃的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
(4)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将步骤(3)得到的硝化菌群固定化小球投入对虾养殖废水中。27℃的温度条件下，通气48h，检测氨氮和亚硝酸盐的浓度。所述养殖废水中硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml。
实施例4：硝化菌群的固定化及应用
与实施例3不同的是，
(1)称取1.5重量份的海藻酸钠和2.7重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到40重量份、温度条件为75℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
(2)向步骤(1)得到的混合液I中加入10重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II。
(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为5％的CaCl2水溶液中；在5℃的温度条件下静置，交联20小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
(4)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将步骤(3)得到的硝化菌群固定化小球投入对虾养殖废水中，24℃的温度条件下，通气36h，检测氨氮和亚硝酸盐的浓度。
实施例5：硝化菌群的固定化及应用
与实施例3不同的是，
(1)称取1.8重量份的海藻酸钠和2.2重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到42重量份、温度条件为85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
(2)向步骤(1)得到的混合液I中加入8重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；
(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为3.5％的CaCl2水溶液中；4℃的温度条件下静置，交联22小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
(4)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将步骤(3)得到的硝化菌群固定化小球投入对虾养殖废水中，30℃的温度条件下，通气24h，检测氨氮和亚硝酸盐的浓度。
实施例6：硝化菌群的固定化及应用
与实施例3不同的是，
(1)称取1.5重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到45重量份、温度条件为80℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
(2)向步骤(1)得到的混合液I中加入5重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；
(3)在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中；4℃的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
(4)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将步骤(3)得到的硝化菌群固定化小球投入对虾养殖废水中。28℃的温度条件下，通气48h，检测氨氮和亚硝酸盐的浓度。
表1实施例3-6制备的硝化菌群固定化小球参数及养殖废水处理结果
Figure BDA0001652221580000071
由表1可知，本发明制备的硝化菌群固定化小球，其粒径为3-5mm，机械强度为103.5-129.7mN。据报道，包木太等(环境科学与技术,2012,35(2):167-172)采用海藻酸钠与活性炭制备包埋小球机械强度为73.5mN。宋丽敏等(应用化工,2016,45(11):2118-2120)使用海藻酸钠与壳聚糖制备包埋小球机械强度为89.2mN。与现有技术相比，本发明所制备的硝化菌群固定化小球，机械强度提高了29-62％，从而降低了固定化小球在处理废水过程中的消耗，减少了固定化小球的投放次数，使得经济成本和人力成本均大大降低。
此外，在硝化菌群固定化小球的作用下，在24-30℃的温度条件下，本发明实施例3-6中对虾养殖废水的氨氮和亚硝酸盐均显著降低。其中，氨氮浓度在24-48h内从初始的7.02±0.02mg/L-4.52±0.09mg/L降至2.19±0.11mg/L-0.039±0.15mg/L，降解率为64.39％-99.41％。亚硝酸盐浓度从初始的6.23±0.11mg/L-4.51±0.07mg/L降至2.47±0.10mg/L-0.051±0.21mg/L，降解率为60.35％-99.10％。这说明，本发明所述的硝化菌群固定化小球，实现对虾养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐的快速高效降解，48h内氨氮和亚硝酸盐的浓度均低于0.1mg/L。
注：
固定化小球的机械强度的测定方法：将载玻片放置于电子天平上，取同组等大的小球三枚，正三角形放置于载玻片上，将盖玻片从正上方水平盖住，天平调零，向盖玻片上垂直施加均匀递增的力直至小球破裂，读出微球所能承受的最大质量Mi(g)，然后换算成压力Fi(mN)，单个微球的机械强度表示为Fi＝G×Mi/3，G＝9.8g/mN。
氨氮的测定：根据国标GB17378.4-2007第36条第2节，使用次溴酸盐氧化法测定氨氮浓度。
亚硝酸盐的测定：根据国标GB17378.4-2007第37条，使用萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐浓度。

Claims (9)

1.硝化菌群固定化小球的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：
（1）称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份多孔的贝壳粉，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；
（2）向步骤（1）得到的混合液I中加入5-10重量份的硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；所述硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml；
（3）在搅拌条件下，将混合液II滴加到重量分数为3.5-5%的 CaCl2水溶液中；在3-5℃的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
2.根据权利要求1所述的硝化菌群固定化小球的制备工艺，其特征在于：所述硝化菌群固定化小球的粒径为3-5mm，机械强度为100-130mN。
3.根据权利要求1所述的硝化菌群固定化小球的制备工艺，其特征在于：所述硝化菌群通过如下步骤得到：
（1）自养富集：无菌条件下采集适量养殖虾塘底泥置于无菌密封培养瓶中，加入初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20mg/L的无菌富集培养液，调节pH值至7.5-8.5，通入无菌空气进行定向富集培养；当pH下降至7.0时，再次调节pH值至7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L，继续充气培养；当体系中的氨氮和亚硝酸浓度数次低于0.1mg/L时，取上层培养液，待用；
（2）连续培养：取适量步骤（1）得到的上层培养液，按照1:1-1:2的体积比接种于无菌海水中，加入无菌硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为10-15mg/L，调节pH值至7.5-8.5，通入无菌空气进行定向连续培养；当pH下降至7.0时，再次调节pH值至7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入无菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养，反复多次；当镜检活菌数达到1×107-1×108个/ml，即得到所述的硝化菌群。
4.根据权利要求3所述的硝化菌群固定化小球的制备工艺，其特征在于：所述步骤（2）制得的硝化菌群经离心浓缩，至浓度为1×109-1×1010个/ml后，用于制备硝化菌群固定化小球。
5.根据权利要求3所述的硝化菌群固定化小球的制备工艺，其特征在于：步骤（1）所述的无菌富集培养液由适量(NH4)2SO4、NaNO2和盐度28-30‰的海水配制得到；所述的无菌硝化细菌生长培养液由以下组分组成：3.3g (NH4)2SO4、0.41g KH2PO4、0.75ml 1mol/L的MgSO4；0.2ml 1mol/L的CaCl2、0.33ml 30mmol/L FeSO4-50mmol/L EDTA；0.02ml 50mmol/L的 CuSO4。
6.采用如权利要求1-5中任意一项所述的制备工艺得到的硝化菌群固定化小球的应用，其特征在于：将其应用于养殖废水中氨氮和亚硝酸盐的降解。
7.根据权利要求6所述的硝化菌群固定化小球的应用，其特征在于：具体步骤为：将适量硝化菌群固定化小球投入养殖废水中，适宜温度条件下，通气，直至氨氮浓度和亚硝酸盐浓度均低于0.1mg/L。
8.根据权利要求7所述的硝化菌群固定化小球的应用，其特征在于：所述养殖废水中硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml。
9.根据权利要求7所述的硝化菌群固定化小球的应用，其特征在于：所述的温度条件为24-30℃，所述通气的时间为24-48h。
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