CN108546662B - 采用分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理养殖废水的方法 - Google Patents

采用分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理养殖废水的方法 Download PDF

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Abstract

本发明首先提供了解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefacien)YL‑10，于2018年4月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15556。将所述解淀粉芽孢杆菌菌株应用于养殖废水中COD的降解。同时，本发明提供了一种采用固定化的硝化菌群‑芽孢杆菌联合处理养殖废水的方法。本发明将解淀粉芽孢杆菌LY‑10进行固定化，用于高效降解养殖废水中的有机物，同时减少了高浓度的有机物对硝化细菌生长的抑制，显著提高硝化作用。其次，本发明通过分别固定化联合使用的方法，不仅避免了芽孢杆菌对硝化菌群的竞争，还显著提高了硝化菌群的硝化作用以及使用效率，实现同步高效降解对虾养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐。

Description

采用分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理养殖废水的 方法
技术领域
本发明属于水产养殖领域，具体涉及同步高效降解养殖废水中氨氮、亚硝酸盐和COD的方法，尤其涉及采用分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理养殖废水的方法。
背景技术
水产养殖集约化的快速发展带来了显著的经济效益，但同时也面临最大的难题——养殖系统中水污染的控制；特别是养殖过程中产生的废料残饵、动物排泄物等引起的氨氮、亚硝酸盐和有机物污染物超标的问题。养殖水体中过高浓度的氨氮和亚硝酸盐对鱼虾类的存活、生长代谢、组织结构、生理和免疫功能等均具有较强的毒性，严重威胁水产养殖动物的正常生长和健康。同时，这些污染物超标的养殖废水未经处理被任意排放，可直接导致近海水域的富营养化和周边生态环境的破坏。2017-2018年水产养殖业的污染防治工作迎来了最严厉的监管，浙江省严禁水产养殖场所污水污泥任意排放，要求排入海水水域的化学需氧量COD小于6-10mg/L，非离子氨(以N计)小于0.06-0.1mg/L。因此，对高排污的南美白对虾养殖业，同步高效地去除养殖水体中氨氮、亚硝酸盐和有机物的技术具有重要的意义。
为了解决上述问题，研究人员采用芽孢杆菌和硝化细菌降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐。孟睿等(孟睿，何连生，席北斗等，环境科学与技术，2009，32(11):28-31.)用芽孢杆菌处理罗非鱼养殖废水，6天后COD和亚硝酸盐分别降至84.44mg/L和0.07mg/L，降解率为50.32％和99.15％，但对氨氮无明显降解；采用硝化细菌处理，6天氨氮和亚硝酸盐分别降至2.09mg/L和0.09mg/L，降解率为74.48％和98.90％，但对COD无明显降解。高金伟等(高金伟，张海红，陈瑞楠等，天津农学院学报，2014(1):5-8.)利用硝化细菌与枯草芽孢杆菌联合处理淡水鱼类养殖废水，在第5日氨氮降解率可达82.16％，亚硝酸氮降解率可达 94.62％，但COD降解率仅为25％左右。由此可见，在养殖废水处理中仅芽孢杆菌或硝化细菌单一菌种均无法同步去除废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐；而且芽孢杆菌和硝化细菌以游离菌方式联合处理无法实现同步高效降解。
固定化微生物技术因能纯化和保持高效菌种，承受有毒物质冲击及高效降解废水的功能，被广泛应用。H.Shan等(Shan H,Obbard J P.,Applied Microbiology&Biotechnology,2001, 57(5-6):791.)利用陶土颗粒固定化硝化细菌处理对虾养殖废水，6天后氨氮从3.5mg/L降至 0mg/L。N.J.Manju等(Manju N J,Deepesh V,Cini A,etal.Aquaculture,2009,294(1-2):65-75.) 利用木屑颗粒固定化硝化细菌处理对虾养殖废水，7天后氨氮从15mg/L降至为0mg/L。李秋芬等(李秋芬,张艳,王印庚，水产学报，2006，30(6):852-856.)将海水中分离的枯草杆菌、亚硝化单胞菌、盐单胞菌和红球菌制成复合菌制剂，并采用游离菌和生物膜法连用方法处理大菱鲆育苗养殖废水，5天后COD和氨氮分别降至1.57mg/L和0.06mg/L，降解率为73.1％和80.0％。然而，现有技术中，多采用芽孢杆菌与硝化细菌，还有光合细菌，酵母菌，反硝化细菌，乳酸菌、微量元素、辅料(多为有机物)等按一定比例简单混合，制成速效净水剂类的复合菌剂。由于这些混合菌的生长繁殖速度均比自养硝化细菌快，在一定程度上抑制了硝化细菌的生长，从而影响了利用硝化细菌去除水体中氨氮和亚硝酸盐的效果。其次这类净水剂多直接往水体中投加，容易造成菌体随水流失影响使用效果。
与异养硝化细菌相比，自养硝化细菌具有更强的去除氨氮和亚硝酸盐的能力。在自然生态系统中，尤其在有机物含量高的养殖水体中，自养硝化细菌无法与异养细菌竞争，难以维持较高的细胞浓度，从而直接影响养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的去除效果，无法在短时间内同步高效降解氨氮和亚硝酸盐。
发明专利ZL200810198302.9公开了“一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺”。该工艺包括硝化细菌浓缩液的制备、硝化细菌固定化颗粒的制备、硝化细菌固定化颗粒的活化、硝化细菌固定化颗粒反应包的制备以及反应包去除养殖废水亚硝酸盐。其中，硝化细菌固定化颗粒的制备是将聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后向包埋液中加入包埋用硝化细菌浓缩液，混匀后滴入到交联剂中，交联剂由氯化钙溶液和饱和硼酸溶液按1:1～1:3的体积比例混合，用纱布滤出固定化颗粒。该工艺亚硝酸盐降解效果快速、持续、稳定、可以长时间维持高的生物活性、反应包可反复使用、反应包制作方法简单、成本低，有可观的应用前景。然而，该申请采用了聚乙烯醇，毒性比较大，在环境中易引起二次污染；固定化对硝化作用无提高的作用且仅用于亚硝酸盐的去除。
发明内容
针对现有技术中养殖废水中氨氮、亚硝酸盐和COD同步去除效果不理想的现状，本发明提供了一种采用分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理养殖废水的方法。本发明首先筛选了COD降解能力最强的解淀粉芽孢杆菌LY-10，并进行固定化，用于高效降解养殖废水中的有机物，同时减少了高浓度的有机物对硝化菌群生长的抑制，显著提高硝化作用。其次，本发明通过分别固定化联合使用的方法，不仅避免了芽孢杆菌对硝化菌群的竞争，还显著提高了硝化菌群的硝化作用以及使用效率。
本发明的技术方案：
一种解淀粉芽孢杆菌菌株，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) YL-10，于2018年4月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15556，保藏地址为中国北京。
所述解淀粉芽孢杆菌菌株的应用，将其应用于养殖废水中COD的降解。其中，所述用于养殖废水中的解淀粉芽孢杆菌浓度为1×107-1×108CFU/ml；所述降解时间为24-48h。与现有的芽孢杆菌相比，所述解淀粉芽孢杆菌LY-10COD降解能力最强，可在48h内实现COD降解率达100％。
采用所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)硝化菌群固定化：1a称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份的贝壳粉(40-60 目)，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I。1b向步骤(1a)得到的混合液I中加入5-10重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；所述硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml。1c在搅拌条件下将混合液 II滴加到重量分数为3.5-5％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球。
(2)芽孢杆菌YL-10固定化：2a称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份的贝壳粉，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III。2b向步骤(2a)得到的混合液I中加入5-10重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV；所述芽孢杆菌的浓度为1×109-1×1010个/ml。2c将混合液IV滴加到重量分数为3.5-5％的CaCl2水溶液中，搅拌成球；在3-5℃的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到芽孢杆菌固定化小球。
其中，步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球的粒径均为3-5mm，机械强度均为100-130mN。本发明选用吸附和成球效果好的无毒包埋材料，利用多孔的贝壳粉的吸附作用及弱碱性(主要成分碳酸钙)，将氨氮和亚硝酸盐吸附在固定化小球内，使硝化作用的底物浓度局部升高，在有机物含量高的养殖废水中为硝化菌群创造了适宜的生境。采用包埋剂海藻酸钠与交联剂氯化钙，通过正交实验优化了固定化配方，从而提高机械强度，延长了使用寿命。
(3)将适量步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中，所述硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml；所述芽孢杆菌的浓度为1×107-1×108个/ml；在24-30℃的温度条件下，通气24-48h，直至COD浓度低于3mg/L, 氨氮和亚硝酸盐的浓度均低于0.1mg/L。通过固定化，使芽孢杆菌与硝化菌群在空间上相互隔离，避免了形成竞争关系。此外，芽孢杆菌高效降解了养殖废水中的有机物，同时减少了高浓度的有机物对硝化菌群生长的抑制；从而实现了同步高效地降解养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐。
其中，步骤(1)所述的硝化菌群通过如下步骤得到：
(I)富集：无菌条件下采集适量养殖虾塘底泥置于无菌密封培养瓶中，加入初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20mg/L的无菌富集培养液，调节pH值至7.5-8.5 通入无菌空气进行定向富集培养；当pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回至7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养。当体系中的氨氮和亚硝酸浓度数次低于0.1mg/L时，取上层培养液，待用。所述的无菌富集培养液由适量(NH4)2SO4、NaNO2和盐度28-30‰的海水配制得到；所述的无菌硝化细菌生长培养液由以下组分组成：3.3g(NH4)2SO4、0.41g KH2PO4、0.75ml1mol/L的MgSO4；0.2ml 1mol/L的CaCl2、0.33ml 30mmol/L FeSO4-50mmol/L EDTA；0.02ml50mmol/L的CuSO4。
(II)连续培养：取适量步骤(I)得到的上层培养液，按照1:1-1:2的体积比接种于无菌海水中，加入无菌硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为10-15mg/L，调节pH值至7.5-8.5，通入无菌空气进行定向连续培养；pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回7.5-8.5；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养，反复多次。当镜检活菌数达到1×107-1×108个/ml，即得到所述的硝化菌群。经离心浓缩，至硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml后，用于制备硝化菌群固定化小球。采集养殖虾塘底泥进行硝化细菌富集和连续培养，直接利用养殖环境中的土著硝化菌群，具有更好的环境适应性，且具菌群多样性。
本发明的有益效果：
(1)本发明将芽孢杆菌和硝化菌群分别固定化，然后联合使用，同步高效降解养殖废水中的有机物、氨氮和亚硝酸盐的方法，弥补了现有技术的缺陷。
(2)本发明采用的芽孢杆菌YL-10具备超强的COD降解能力，可在48h实现COD的100％降解。
(3)本发明提供了针对硝化菌群的固定化配方，不但大大增强了硝化菌群降解氨氮和亚硝酸盐的能力，而且采用了吸附和成球效果好的无毒包埋材料，对水体中氨氮和亚硝酸盐有一定的吸附作用，使硝化作用的底物浓度在小球内局部升高，有利于硝化菌群生长，所用材料对环境无二次污染；此外，通过优化工艺提高固定化小球的机械强度，提高了使用期限，减少了工作量，降低了成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：硝化细菌的富集和连续培养
(1)富集-分离阶段：
无菌条件下采集100g养殖虾塘底泥置于3L无菌密封培养瓶中，加入1L由(NH4)2SO4、 NaNO2和海水(盐度28-30‰)配制的初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20 mg/L的无菌富集培养液，用NaHCO3调pH至8.3，通入无菌空气进行定向富集培养。当pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回。当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液((NH4)2SO4 3.3g；KH2PO4 0.41g；1mol/L MgSO4 0.75ml；1mol/L CaCl20.2ml； 30mmol/L FeSO4/50mmol/L EDTA 0.33ml；50mmol/L CuSO4 0.02ml)，调至氨氮终浓度为 10-15mg/L。25℃，继续充气培养。当培养液的氨氮和亚硝酸浓度多次出现低于0.1mg/L时，取上层培养液进行连续培养。
(2)连续培养阶段：
取上层培养液以1:1比例接种于无菌海水中，加入硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为 10-15mg/L，pH8.3，进行充气培养。每2-4天测氨氮和亚硝酸盐浓度以及pH，及时补加生长培养液至氨氮终浓度为10-15mg/L；补加NaHCO3调pH至8.3。镜检活菌数，达到1010个/ml，得到硝化菌群。
硝化菌群高通量测序分析：
取连续培养的硝化菌群15mL，用10％盐酸预处理后置于100mL离心管13000×g离心 20min，弃去上清液收集沉淀于2mL离心管中。采用北京天根公司快速DNA提取检测试剂盒 (KG203)提取DNA，于-20℃冻存备用。DNA浓度和纯度通过超微量分光光度计测定。
委托上海派森诺生物科技股份有限公司，利用IlluminaMiSeq平台对16SrRNA基因V4区进行高通量测序，采用滑动窗口法对双端的FASTQ序列做质量过滤，利用软件FLASH对通过质量过滤的序列进行连接，对连接上的序列进行过滤和去除嵌合体，得到优质序列。基于OTU 聚类和注释的分析结果，在各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析。
高通量分析结果显示，硝化菌群中变形菌门(Proteobacteria，61.10％)占绝对优势，具有自养硝化功能的类群丰度达12.69％(主要包括亚硝化单胞菌属、硝化刺菌属、硝化球菌属、硝化杆菌属和硝化螺菌目)并呈高多样性。此外，硝化菌群中还包含丰度达47.44％的具有反硝化功能或者潜在反硝化功能的优势菌群和丰度达12.85％的光合细菌，是高有机负荷下硝化作用的重要补充，并可通过反硝化作用实现真正脱氮。
实施例2：芽孢杆菌的筛选
模拟海水养殖废水的制备：取24L无菌海水加入36g饲料混匀后沉降48小时，取上清加入亚硝酸钠和氯化铵溶液，测定模拟废水的COD为55.79±1.02mg/L；氨氮测定值为4.52± 0.09mg/L；亚硝酸盐测定值为4.51mg±0.07/L。
配制TSB培养基(胰蛋白胨1.5％、植物蛋白胨0.5％、氯化钠1％，pH 7.5)进行芽孢杆菌的培养。在37℃、160r/min摇床培养18小时后，测定OD600并计数、离心。分别将解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens，YL-10)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium，H-1)、枯草芽孢杆菌 (B.subtilis，YL-9)、地衣芽孢杆菌(B.lincheniformis，GE6-1)、短小芽孢杆菌(B.pumilus， YL-2)五株芽孢杆菌以1×108CFU/ml的使用浓度加入500ml的人工模拟海水养殖废水中，平行3组。所述五株芽孢杆菌均来自南美白对虾肠道和养殖环境，由中国海洋大学海洋生命学院应用微生物技术实验室分离纯化并鉴定。将未加菌的人工模拟海水养殖废水设为空白对照组。室温20-25℃，保持水体持续充气，每24小时测定一次废水中COD、氨氮及亚硝酸盐浓度。
模拟海水养殖废水中的COD浓度(55.79±1.02mg/L)经五株芽孢杆菌处理后均呈显著降低趋势(p＜0.05)。其中解淀粉芽孢杆菌YL-10的COD降解能力最强，48h内COD浓度降至 0mg/L，降解率达100％。其次为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，48h内COD浓度分别降解至 13.74±4.76mg/L(降解率为73.95％)和23.37±6.30mg/L(降解率为55.73％)。运用TukeyHSD 法对结果进行分级，显示解淀粉芽孢杆菌的COD降解效率显著优于其他四株芽孢杆菌(p＜ 0.05)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)YL-10具有最强的COD降解能力，48h 内COD降解率达100％。已经于2018年4月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15556，保藏地址为中国北京。
实施例3：处理养殖废水
采用所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，包括以下步骤：
(1)硝化菌群固定化：
1a称取1.3重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到45重量份、温度条件为65℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I。
1b向步骤(1a)得到的混合液I中加入5重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；所述硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml。
1c在搅拌条件下将混合液II滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为122.0mN的硝化菌群固定化小球。
(2)芽孢杆菌YL-10固定化：
2a称取1.3重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉，将其加入到45重量份、温度条件为65℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III。
2b向步骤(2a)得到的混合液III中加入5重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV；所述芽孢杆菌的浓度为1×109-1×1010个/ml。
2c将混合液IV滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中，搅拌成球；在适宜的温度条件下静置，交联22小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为120.1mN的芽孢杆菌固定化小球。
(3)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将适量步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中，所述硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml；所述芽孢杆菌的浓度为1×107-1×108个/ml；在27℃的温度条件下，通气48h，检测氨氮、亚硝酸盐和COD的浓度。
实施例4：处理养殖废水
与实施例3不同的是，
采用所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，包括以下步骤：
(1)硝化菌群固定化：
1a称取1.5重量份的海藻酸钠和2.7重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到40重量份、温度条件为75℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I。
1b向步骤(1a)得到的混合液I中加入10重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II。
1c在搅拌条件下将混合液II滴加到重量分数为5％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联20小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为108.1mN的硝化菌群固定化小球。
(2)芽孢杆菌YL-10固定化：
2a称取1.5重量份的海藻酸钠和2.7重量份的贝壳粉，将其加入到40重量份、温度条件为75℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III。
2b向步骤(2a)得到的混合液III中加入10重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV。
2c将混合液IV滴加到重量分数为5％的CaCl2水溶液中，搅拌成球；在适宜的温度条件下静置，交联20小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为106.7mN的芽孢杆菌固定化小球。
(3)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将适量步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中。在24℃的温度条件下，通气36h，检测氨氮、亚硝酸盐和COD的浓度。
实施例5：处理养殖废水
与实施例3不同的是，
采用所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，包括以下步骤：
(1)硝化菌群固定化：
1a称取1.8重量份的海藻酸钠和2.2重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到42重量份、温度条件为85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I。
1b向步骤(1a)得到的混合液I中加入8重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II。
1c在搅拌条件下将混合液II滴加到重量分数为3.5％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为104.3mN的硝化菌群固定化小球。
(2)芽孢杆菌YL-10固定化：
2a称取1.8重量份的海藻酸钠和2.2重量份的贝壳粉，将其加入到42重量份、温度条件为85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III。
2b向步骤(2a)得到的混合液III中加入8重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV。
2c将混合液IV滴加到重量分数为3.5％的CaCl2水溶液中，搅拌成球；在适宜的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为103.5mN的芽孢杆菌固定化小球。
(3)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将适量步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中；在30℃的温度条件下，通气24h，检测氨氮、亚硝酸盐和COD的浓度。
实施例6：处理养殖废水
与实施例3不同的是，
采用所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，包括以下步骤：
(1)硝化菌群固定化：
1a称取1.5重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉(40-60目)，将其加入到45重量份、温度条件为80℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I。
1b向步骤(1a)得到的混合液I中加入5重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II。
1c在搅拌条件下将混合液II滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为128.7mN的硝化菌群固定化小球。
(2)芽孢杆菌YL-10固定化：
2a称取1.5重量份的海藻酸钠和2.5重量份的贝壳粉，将其加入到45重量份、温度条件为80℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III。
2b向步骤(2a)得到的混合液III中加入5重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV。
2c将混合液IV滴加到重量分数为4％的CaCl2水溶液中，搅拌成球；在适宜的温度条件下静置，交联24小时，洗涤，得到粒径为3-5mm，机械强度为129.6mN的芽孢杆菌固定化小球。
(3)采集青岛胶南南美白对虾养殖塘的养殖废水，将适量步骤(1)得到的硝化菌群固定化小球和步骤(2)得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中；在28℃的温度条件下，通气48h，检测氨氮、亚硝酸盐和COD的浓度。
表1实施例3-6处理前后养殖废水中氨氮、亚硝酸盐和COD的含量
Figure RE-GDA0001735895300000091
由表1可知，在硝化菌群固定化小球和芽孢杆菌YL-10固定化小球的联合作用下，在 24-30℃条件下，本发明实施例3-6中对虾养殖废水的氨氮、亚硝酸盐和COD均同步显著降低。其中，氨氮浓度在24-48h内从初始的7.02±0.02mg/L-4.52±0.09mg/L降至 1.77±0.12mg/L-0.027±0.03mg/L，降解率为71.22％-99.57％。亚硝酸盐浓度从初始的6.23±0.11mg/L-4.51±0.07mg/L降至2.16±0.14mg/L-0.055±0.01mg/L，降解率为65.33％-99.03％。 COD浓度从初始的72.55±0.34mg/L-55.79±1.02mg/L，降至11.86±0.19mg/L-0mg/L，降解率分别为83.65％-100％。
这说明，本发明所述的采用所述的分别固定化的硝化菌群-芽孢杆菌联合处理对虾养殖废水的微生物方法，实现同步高效降解对虾养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐，48h内可达到《海水水质标准》和《海水养殖排放水要求》的相关要求。
注：
固定化小球的机械强度的测定方法：将载玻片放置于电子天平上，取同组等大的小球三枚，正三角形放置于载玻片上，将盖玻片从正上方水平盖住，天平调零，向盖玻片上垂直施加均匀递增的力直至小球破裂，读出微球所能承受的最大质量Mi(g)，然后换算成压力Fi(mN)，单个微球的机械强度表示为Fi＝G×Mi/3，G＝9.8g/mN。
氨氮的测定：根据国标GB17378.4-2007第36条第2节，使用次溴酸盐氧化法测定氨氮浓度。
亚硝酸盐的测定：根据国标GB17378.4-2007第37条，使用萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐浓度。
COD的测定：根据国标GB17378.4-2007第32条，使用碱性高锰酸钾法测定化学需氧量。

Claims (9)

1.一种解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens ） 菌株，其特征在于：所述菌株为解淀粉芽孢杆菌YL-10，于2018年4月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15556。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：将其应用于养殖废水中COD的降解。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于：所述养殖废水中解淀粉芽孢杆菌的浓度为1×107-1×108CFU/ml；所述降解时间为24-48h。
4.采用如权利要求1所述的芽孢杆菌处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）硝化菌群固定化：1a 称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份的40-60目贝壳粉，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液I；1b 向步骤1a得到的混合液I中加入5-10重量份硝化菌群，混合均匀，得到混合液II；1c 在搅拌条件下将混合液II滴加到重量分数为3.5-5%的 CaCl2水溶液中；在适宜的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到硝化菌群固定化小球；
（2）芽孢杆菌YL-10固定化：2a 称取1.3-1.8重量份的海藻酸钠和2.2-2.7重量份的贝壳粉，将其加入到40-45重量份、温度条件为65-85℃的生理盐水中，溶解，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合液III；2b 向步骤2a得到的混合液III中加入5-10重量份芽孢杆菌YL-10，混合均匀，得到混合液IV；2c 将混合液IV滴加到重量分数为3.5-5%的 CaCl2水溶液中，搅拌成球；在适宜的温度条件下静置，交联20-24小时，洗涤，得到芽孢杆菌固定化小球；
（3）将适量步骤（1）得到的硝化菌群固定化小球和步骤（2）得到的芽孢杆菌固定化小球分别投入对虾养殖废水中，24-30℃的温度条件下，通气24-48h，直至COD的浓度降至低于3mg/L, 氨氮浓度和亚硝酸盐的浓度降至均低于0.1mg/L。
5.根据权利要求4所述的处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：步骤（1）得到的硝化菌群固定化小球和步骤（2）得到的芽孢杆菌固定化小球的粒径均为3-5mm，机械强度均为100-130mN。
6.根据权利要求4所述的处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：步骤（1）中所述混合液II中硝化菌群的浓度为1×109-1×1010个/ml；步骤（2）中所述混合液IV中所述芽孢杆菌的浓度为1×109-1×1010个/ml。
7.根据权利要求4所述的处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：步骤（3）中所述硝化菌群的浓度为1×107-1×108个/ml；所述芽孢杆菌的浓度为1×107-1×108个/ml。
8.根据权利要求4所述的处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：步骤（1）所述的硝化菌群通过如下步骤得到：
（I）富集：无菌条件下采集适量养殖虾塘底泥置于无菌密封培养瓶中，加入初始氨氮浓度为20-30mg/L、初始亚硝酸盐浓度为10-20 mg/L的无菌富集培养液，调节pH值至8.3通入无菌空气进行定向富集培养；当pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回至8.3；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养；当体系中的氨氮和亚硝酸浓度数次低于0.1mg/L时，取上层培养液，待用；所述灭菌硝化细菌生长培养液为：(NH4)2SO4 3.3g; KH2PO4 0.41g；1mol/L MgSO4 0.75ml；1mol/LCaCl2 0.2ml; 30mmol/L FeSO4-50mmol/L EDTA 0.33ml；50mmol/L CuSO4 0.02ml；
（II）连续培养：取适量步骤（I）得到的上层培养液，按照1:1的体积比接种于无菌海水中，加入无菌硝化细菌生长培养液，至氨氮终浓度为10-15mg/L，调节pH值至8.3，通入无菌空气进行定向连续培养；pH下降至7.0时，补加NaHCO3调回8.3；当氨氮浓度和亚硝酸浓度低于0.1mg/L时，加入灭菌硝化细菌生长培养液，调至氨氮终浓度为10-15mg/L；继续充气培养，反复多次；当镜检活菌数达到1×1010个/ml，即得到所述的硝化菌群。
9.根据权利要求8所述的处理对虾养殖废水的微生物方法，其特征在于：所述步骤（II）制得的硝化菌群经离心浓缩，至浓度为1×109-1×1010个/ml后，用于制备硝化菌群固定化小球。
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