CN108546263B - 含马来酸酐萘酰亚胺类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含马来酸酐萘酰亚胺类化合物及其制备方法和应用。本发明化合物公开了通式I化合物及其制备方法，以及所述化合物在诊断癌细胞或抑制癌细胞中的应用。

Description

含马来酸酐萘酰亚胺类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于小分子药物领域。具体涉及一种含马来酸萘酰亚胺类化合物及其制备方法和其作为荧光探针在肿瘤细胞检测与抑制中的应用。
背景技术
肿瘤目前是人类死亡的重要原因，并且死亡人数呈逐年递增的趋势，对于肿瘤的诊断和治疗任然是一个世界性难题。因此，对肿瘤细胞能够快速诊断和靶向治疗的诊疗试剂的研发具有重要意义。
荧光探针具有高灵敏性和非侵入性的优点，可以在疾病尚处于分子病变时达到快速检测。当用荧光探针标记药物时，探针将不仅能够产生可用于诊断的荧光信号，还可以将药物更加精确的携带到病变细胞，利用病变细胞的病理生理学特点释放药物，达到诊断和治疗的双重目的。开发具有高效肿瘤特异性的近红外载药荧光探针不仅能够利用肿瘤定位基团将药物携带并释放到癌变组织，同时结合了荧光成像的优点，达到对肿瘤的诊断和治疗双重作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可作为荧光探针的含马来酸酐萘酰亚胺类化合物。
本发明的目的还在于提供上述化合物的制备方法和其在肿瘤细胞的检测与抑制中的应用。
本发明第一方面提供了一种含马来酸萘酰亚胺类化合物，其中，其结构式为：
Figure BDA0001669950320000011
式I中：R为N，N-二烷基乙二胺，N-甲基哌嗪或N-(2-氨基乙基)吗啉。
本发明第二方面提供了第一方面所述化合物的制备方法，其中，包括步骤：
(1)将溶剂、4-溴-1,8-萘二甲酸酐、乙二胺混合后，加热回流，反应结束后，除去溶剂，得粗制的中间体a；
其中，所述溶剂为乙醇；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与乙二胺的摩尔比为1:(10-12)；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～200)；所述回流进行4-8小时；
(2)将步骤(1)得到的中间体a、4-二甲基吡啶(DMAP)和溶剂混合后，然后滴加BOC酸酐，室温下反应，形成中间体b；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；BOC酸酐与中间体a的摩尔比为(10-2):1；4-二甲基吡啶与BOC酸酐的摩尔比为1:1；BOC酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(15～50)；所述反应进行20-28h；
(3)将步骤(2)得到的中间体b、RH和溶剂混合后，在N2的保护下于120℃反应，形成中间体c；
其中，所述溶剂为乙二醇单甲醚；中间体b与RH的摩尔比为1:(2-2.2)；中间体b与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～300)；所述反应进行2～10h；
(4)将步骤(3)得到的中间体c和溶剂混合后，然后滴加HCl溶液，室温下反应，浓缩后得到中间体d；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；中间体c与溶剂的固液比(g：mL)为1：(50～100)；HCl溶液为HCl的二氧六环溶液；其中，HCl的二氧六环溶液的浓度为3～8mol/L；溶剂与二氧六环的体积比为(2～10)：1；所述反应进行10-14h；
(5-1)将步骤(4)得到的中间体d与马来酸酐、溶剂混合后，在回流下反应；
其中，所述溶剂为氯仿；所述反应进行2-6h；中间体d与溶剂的固液比(g：mL)为1：(150～250)；中间体d与马来酸酐的摩尔比为1：(1～2)；
(5-2)浓缩去除步骤(5-1)得到的反应混合物中的溶剂后，将残余物与乙酸酐、乙酸钠混合，回流下反应；
其中，所述回流进行1-3h；
(5-3)然后，向步骤(5-2)的反应混合物中加入饱和NaHCO3溶液调节pH到中性，除去乙酸酐，二氯甲烷萃取，萃取物过硅胶柱，得式I化合物；
Figure BDA0001669950320000031
其中，R为N，N-二烷基乙二胺，N-甲基哌嗪或N-(2-氨基乙基)吗啉。
本发明第三方面提供了第一方面所述的化合物在检测细胞中pH值中的应用。
优选地，所述细胞可以是癌细胞。
在另一优选例中，所述检测包括步骤：
(1)绘制氢离子浓度对所述化合物的荧光强度的滴定曲线；
(2)检测所述化合物在细胞中的荧光强度，根据步骤(1)的滴定曲线，确定所述细胞中的pH值。
优选地，所述细胞可以是癌细胞或正常细胞。
在另一优选例中，所述步骤(1)的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(1-1)制备如权利要求1所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(2-1)准确移取60微升储备液1至60mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，测定pH 7.40时所述化合物的紫外吸收与荧光光谱；
调节上述缓冲溶液的pH，在不同pH下，测定所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(3-1)根据步骤(2-1)中不同pH值下测得的紫外吸收和荧光光谱，绘制化合物的荧光强度或紫外吸收和pH值的曲线，即为氢离子浓度或pH值对所述化合物的荧光强度或紫外吸收的滴定曲线。
本发明还提供了第一方面所述的化合物在检测细胞中硫醇类化合物浓度中的应用。
在另一优选例中，所述检测包括步骤：
(a)绘制硫醇类化合物浓度对所述化合物荧光强度的滴定曲线；其中，所述硫醇类化合物选择下组：半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、二硫苏糖醇、L-谷氨酸、L-精氨酸、色氨酸、酪氨酸、DL-苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、硫化钠；
(b)检测所述化合物在细胞中的荧光强度，根据步骤(a)的滴定曲线，确定所述细胞中所述硫醇类化合物的浓度。
优选地，所述步骤(a)的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(a-1)制备如权利要求1所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(b-1)制备所述硫醇类化合物的水溶液，为储备液2；
(c-1)准确移取60μL储备液1至60mL pH 7.40、6.04、6.55或9.09的PBS缓冲溶液中，再滴定储备液2至上述溶液，使得所述硫醇类化合物的最终浓度为0.5～100μM，在硫醇类化合物不同浓度下，测定权利要求1所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(d-1)根据步骤(c-1)，绘制所述硫醇类化合物的浓度对如权利要求1所述化合物紫外吸收或荧光强度的滴定曲线。
本发明还提供了第一方面所述的化合物在体外诊断细胞是否为癌细胞中的应用。
在另一优选例中，所述诊断包括步骤：将第一方面所述的化合物添加到待检测的细胞中，测定该化合物在该细胞中的荧光强度，从而确定该细胞中的pH值或硫醇类化合物的浓度，从而确定所述细胞是否为癌细胞。
优选地，根据氢离子浓度对第一方面所述化合物的荧光强度的滴定曲线，基于测定的该化合物在该细胞中的荧光强度来确定该细胞中pH值；且所述的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(1-1)制备第一方面所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(2-1)准确移取60微升储备液1至60mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，测定pH 7.40时所述化合物的紫外吸收与荧光光谱；
调节上述缓冲溶液的pH，在不同pH下，测定所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(3-1)根据步骤(2-1)中不同pH值下测得的紫外吸收和荧光光谱，绘制化合物的荧光强度或紫外吸收和pH值的曲线，即为氢离子浓度或pH值对所述化合物的荧光强度或紫外吸收的滴定曲线。
优选地，根据硫醇类化合物浓度对第一方面所述化合物的荧光强度的滴定曲线，基于测定的该化合物在该细胞中的荧光强度来确定该细胞中硫醇类化合物浓度；且其中，所述的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(a-1)制备第一方面所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(b-1)制备所述硫醇类化合物的水溶液，为储备液2；
(c-1)准确移取60μL储备液1至60mL pH 7.40、6.04、6.55或9.09的PBS缓冲溶液中，再滴定储备液2至上述溶液，使得所述硫醇类化合物的最终浓度为0.5～100μM，在硫醇类化合物不同浓度下，测定权利要求1所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(d-1)根据步骤(c-1)，绘制所述硫醇类化合物的浓度对如权利要求1所述化合物紫外吸收或荧光强度的滴定曲线。
进一步地，所述诊断还包括步骤：在确定该细胞中的pH值或硫醇类化合物的浓度后，将在该细胞中确定的pH值或硫醇类化合物的浓度与对照参考值进行比较，从而确定所述细胞是否为癌细胞。
其中，对照参考值为在同类正常细胞中的pH值或硫醇类化合物的浓度。
当在该细胞中确定的pH值小于对照参考值，则表示该待检测的细胞为癌细胞。
当在该细胞中确定的硫醇类化合物的浓度大于对照参考值，则表示该待检测的细胞为癌细胞。
本发明还提供了第一方面所述的化合物在抑制癌细胞中的应用。
在另一优选例中，所述癌细胞选择下组：H1975人肺腺癌细胞、A549人肺腺癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了含马来酸酐萘酰亚胺类化合物1的结构式。
图2显示了化合物1在530nm处的荧光强度随pH变化的曲线。
图3显示了在pH＝6.55的缓冲溶液中，半胱氨酸对化合物1的滴定曲线。
图4显示了化合物1在530nm处的荧光强度随半胱氨酸浓度变化的曲线。
图5显示了化合物1对硫醇检测的选择性与竞争性；I为探针与分析物共存体系在530nm处的荧光强度；I0为探针本身在530nm处的荧光强度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一类对硫醇和pH至异常敏感的含马来酸酐萘酰亚胺类新型化合物。这类化合物可用于诊断和抑制肿瘤细胞。在此基础上，发明人完成了本发明。
本发明化合物可作为荧光探针利用硫醇与马来酸酐特异性反应的性质，其在弱酸性介质中对硫醇有快速、灵敏的光谱响应。根据肿瘤细胞与正常细胞在pH和硫醇浓度方面的差异，利用该探针可实现对肿瘤细胞的检测；细胞药效实验结果表明该化合物对肿瘤细胞具有较高的抑制作用。
制备方法
本发明提供了式I化合物的制备方法，其具体步骤为：
(1)将溶剂、4-溴-1,8-萘二甲酸酐、乙二胺混合后，加热回流，反应结束后，除去溶剂，得粗制的中间体a；
其中，所述溶剂为乙醇；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与乙二胺的摩尔比为1:(10-12)；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～200)(优选为1：(150-170))；所述回流进行4-8小时；
(2)将步骤(1)得到的中间体a、4-二甲基吡啶(DMAP)和溶剂混合后，然后滴加BOC酸酐，室温下反应，形成中间体b；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；BOC酸酐与中间体a的摩尔比为(10-2):1；4-二甲基吡啶与BOC酸酐的摩尔比为1:1；BOC酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(15～50)；所述反应进行20-28h；
(3)将步骤(2)得到的中间体b、RH和溶剂混合后，在N2的保护下于120℃反应，形成中间体c；
其中，所述溶剂为乙二醇单甲醚；中间体b与RH的摩尔比为1:(2-2.2)；中间体b与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～300)(优选为1：250)；所述反应进行2～10h；
(4)将步骤(3)得到的中间体c和溶剂混合后，然后滴加HCl溶液，室温下反应，浓缩后得到中间体d；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；中间体c与溶剂的固液比(g：mL)为1：(50～100)(优选为1：50)；HCl溶液为HCl的二氧六环溶液；其中，HCl的二氧六环溶液的浓度为3～8mol/L；溶剂与二氧六环的体积比为(2～10)：1(优选为5：1)；所述反应进行10-14h；
(5-1)将步骤(4)得到的中间体d与马来酸酐、溶剂混合后，在回流下反应；
其中，所述溶剂为氯仿；所述反应进行2-6h；中间体d与溶剂的固液比(g：mL)为1：(150～250)(优选为1：200)；中间体d与马来酸酐的摩尔比为1：(1～2)；
(5-2)浓缩去除步骤(5-1)得到的反应混合物中的溶剂后，将残余物与乙酸酐、乙酸钠混合，回流下反应；
其中，所述回流进行1-3h；
(5-3)然后，向步骤(5-2)的反应混合物中加入饱和NaHCO3溶液调节pH到中性，除去乙酸酐，二氯甲烷萃取，萃取物过硅胶柱，得式I化合物；
Figure BDA0001669950320000071
其中，R为N，N-二烷基乙二胺，N-甲基哌嗪或N-(2-氨基乙基)吗啉。
应用
本发明化合物可用于体外诊断或抑制癌细胞。
本发明提供了一种体外诊断癌细胞的方法。
本发明提供了一种抑制癌细胞的方法。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。
实施例1：
Figure BDA0001669950320000072
(1)中间体a的合成：称取300mg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1.08mmol)于三口烧瓶中，加入50mL乙醇搅拌，然后滴加0.8mL乙二胺(12.0mmol)，回流6h，真空旋蒸去除溶剂，得到粗制的中间体a；
(2)中间体b的合成：将250mg中间体a(0.78mmol)、885mg 4-二甲基吡啶(7.24mmol)加入到单口烧瓶中，加入30mL二氯甲烷溶解，然后在0℃条件下缓慢加入1.58gBOC酸酐(7.24mmol)，室温下反应24h，加入30mL水分离，再经CH2Cl2(30mL)萃取两次，饱和食盐水(20mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，真空条件下过滤、浓缩，得到棕色滤渣，滤渣经过硅胶柱(乙酸乙酯：己烷＝1：4)，得到白色固体b。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(dd,J＝7.2,0.9Hz,1H),8.52(dd,J＝8.7,1.2Hz,1H),8.38(d,J＝7.8Hz,1H),8.00(d,J＝8.1Hz,1H),7.80(t,J＝7.5Hz,1H),5.00(br,m,1H),4.32(t,J＝5.7Hz,2H),3.52–3.53(m,2H),1.27(s,9H).
(3)中间体c的合成：称取200mg中间体b(0.48mmol)于三口烧瓶中，加入50mL乙二醇单甲醚溶解，滴加0.1mL甲基哌嗪(0.96mmol)，N2保护下回流6h，真空旋蒸去除溶剂后，反应产物过硅胶柱，得中间体c；
(4)中间体d的合成：将100mg中间体c(0.23mmol)加入到单口烧瓶中，加入5mL二氯甲烷溶解，然后在0℃条件下将溶解于二氧六环(1mL)的HCl缓慢滴加到单口烧瓶中，在室温下反应12h，浓缩后即得黄色固体d。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.41(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),7.69(t,J＝8.0Hz,1H),7.23(t,J＝8.0Hz,1H),4.27(t,J＝8.0Hz,2H),3.31(s,4H),3.07(t,J＝8.0Hz,2H),2.75(s,4H),2.44(s,3H).
(5)化合物1的合成：称取100mg中间体d(0.24mmol)，47mg马来酸酐(0.48mmol)于三口烧瓶中，加入20mL氯仿，N2保护下回流4h，TLC跟踪反应完全，真空旋蒸去除溶剂后，加入5mL乙酸酐，250mg乙酸钠，N2保护下回流2h，然后加入大量饱和NaHCO3溶液，调节溶液的pH到中性，除去乙酸酐，CH2Cl2萃取，真空旋蒸去除溶剂，反应产物过硅胶柱，得黄色固体。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.47(d,J＝8.1Hz,1H),8.42–8.35(m,1H),7.67(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.20(d,J＝8.1Hz,1H),6.61(s,2H),4.48–4.36(m,2H),4.05–3.92(m,2H),3.31(s,4H),2.76(s,4H),2.45(s,3H).MS(ESI)：419.45(M+1)。
实施例2：氢离子对实施例1制备的化合物1的滴定曲线：
称取2.8mg化合物1，加入1.5mL DMSO溶液溶解，配制成母液1。准确移取60微升母液1至60mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，测定pH＝7.40下化合物1的荧光光谱；用NaOH或HCl调节溶液的pH，重复上述操作，得到不同pH下化合物1的紫外吸收和荧光光谱的变化情况。
不同pH值下化合物1的荧光光谱变化情况如图2所示。结果表明：化合物的荧光强度随着pH值的增大而减弱。
实施例3不同pH下半胱氨酸对实施例1制备的化合物1的滴定曲线：
称取3.8mg半胱氨酸(Cys)，溶于3mL PBS中，得到母液2。准确移取60微升母液1至60mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，以适当梯度向其中加入不同体积的母液2，测定在pH＝7.40下，化合物1在不同半胱氨酸浓度溶液中紫外吸收与荧光光谱的变化情况。化合物1在不同半胱氨酸浓度溶液中荧光光谱的变化情况如图3所示。结果表明：化合物的荧光强度随着半胱氨酸的浓度增高而增强。
将pH更改为4.07、6.04、6.50、9.09，重复上述操作。测定在不同pH下化合物1在不同半胱氨酸浓度溶液中荧光光谱的变化情况。结果如图4所示。结果表明：化合物的荧光强度随着pH值的减弱而增强，随着半胱氨酸的浓度增大而增强。
实施例4实施例1制备的化合物1对硫醇类化合物的选择性与竞争性：
制备30mmol/L谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)、二硫苏糖醇(DTT)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-精氨酸(L-Arg)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、DL-苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、蛋氨酸(Met)和硫化钠等的PBS母液，分别为母液3、母液4、母液5、母液6、母液7、母液8、母液9、母液10、母液11、母液12和母液13。
准确移取3微升母液1于3mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，加入3微升母液2，测定其紫外吸收与荧光光谱；以母液3、母液4、母液5、母液6、母液7、母液8、母液9、母液10、母液11、母液12和母液13代替母液2，重复上述操作，可得化合物1对硫醇类化合物的选择性。
准确移取3微升母液1于3mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，加入3微升母液3，测定其紫外吸收与荧光光谱；再加入3微升母液2，测定其紫外吸收与荧光光谱。以母液4、母液5、母液6、母液7、母液8、母液9、母液10、母液11、母液12和母液13代替母液3，重复上述操作，可得化合物1对硫醇类化合物的竞争性。
结果如图5所示。由图5可知，化合物1对各种硫醇均后较高的光谱响应，其他不含巯基的氨基酸对化合物1的光谱影响较小；除硫化钠外，其他氨基酸的共存几乎不影响化合物对硫醇的响应，表明化合物1对硫醇具有较高的选择性和竞争性。
实施例5实施例1制备的化合物1体外抑制肿瘤细胞生长活性测定：
按不同肿瘤生长速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90微升/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后加入药液10微升/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。另设无细胞凋零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞凋零孔)和阳性对照孔(Amonafide)。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/mL用生理盐水配制20L/孔，于CO2培养箱中过夜。然后用酶标仪测OD570值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。
筛选方法：四氮唑盐(microculture tetrozolium,MTT)还原法
细胞株：H1975人肺腺癌细胞
A549人肺腺癌细胞
Hela人宫颈癌细胞
MDA-MB-231人乳腺癌细胞
作用时间：48～72h
结果如下：
细胞株 IC50(μM) Amonafide对照
H1975 6.87 11.88
A549 17.69 14.78
Hela 21.43 37.48
MDA-MB-231 7.82 7.39
如上述数据显示，探针对肿瘤细胞的抑制作用，与对照药物Amonafide相似，在个别细胞中甚至已知效果更佳。
Amonafide的结构式为：
Figure BDA0001669950320000101
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种含马来酸萘酰亚胺类化合物，其中，其结构式为：
Figure FDA0002684922110000011
式I中：R为N-甲基哌嗪。
2.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其中，包括步骤：
(1)将溶剂、4-溴-1,8-萘二甲酸酐、乙二胺混合后，加热回流，反应结束后，除去溶剂，得粗制的中间体a；
其中，所述溶剂为乙醇；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与乙二胺的摩尔比为1:(10-12)；4-溴-1,8-萘二甲酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～200)；所述回流进行4-8小时；
(2)将步骤(1)得到的中间体a、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和溶剂混合后，然后滴加BOC酸酐，室温下反应，形成中间体b；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；BOC酸酐与中间体a的摩尔比为(10-2):1；4-二甲基氨基吡啶与BOC酸酐的摩尔比为1:1；BOC酸酐与溶剂的固液比(g：mL)为1:(15～50)；所述反应进行20-28h；
(3)将步骤(2)得到的中间体b、RH和溶剂混合后，在N2的保护下于120℃反应，形成中间体c；
其中，所述溶剂为乙二醇单甲醚；中间体b与RH的摩尔比为1:(2-2.2)；中间体b与溶剂的固液比(g：mL)为1:(100～300)；所述反应进行2～10h；
(4)将步骤(3)得到的中间体c和溶剂混合后，然后滴加HCl溶液，室温下反应，浓缩后得到中间体d；
其中，所述溶剂为二氯甲烷；中间体c与溶剂的固液比(g：mL)为1：(50～100)；HCl溶液为HCl的二氧六环溶液；其中，HCl的二氧六环溶液的浓度为3～8mol/L；溶剂与二氧六环的体积比为(2～10)：1；所述反应进行10-14h；
(5-1)将步骤(4)得到的中间体d与马来酸酐、溶剂混合后，在回流下反应；
其中，所述溶剂为氯仿；所述反应进行2-6h；中间体d与溶剂的固液比(g：mL)为1：(150～250)；中间体d与马来酸酐的摩尔比为1：(1～2)；
(5-2)浓缩去除步骤(5-1)得到的反应混合物中的溶剂后，将残余物与乙酸酐、乙酸钠混合，回流下反应；
其中，所述回流进行1-3h；
(5-3)然后，向步骤(5-2)的反应混合物中加入饱和NaHCO3溶液调节pH到中性，除去乙酸酐，二氯甲烷萃取，萃取物过硅胶柱，得式I化合物；
Figure FDA0002684922110000021
其中，R为N-甲基哌嗪。
3.一种如权利要求1所述的化合物在检测细胞中pH值中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述检测包括步骤：
(1)绘制氢离子浓度对所述化合物的荧光强度的滴定曲线；
(2)检测所述化合物在细胞中的荧光强度，根据步骤(1)的滴定曲线，确定所述细胞中的pH值。
5.如权利要求4所述的应用，其中，所述步骤(1)的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(1-1)制备如权利要求1所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(2-1)准确移取60微升储备液1至60mL pH＝7.40的PBS缓冲溶液中，测定pH 7.40时所述化合物的紫外吸收与荧光光谱；
调节上述缓冲溶液的pH，在不同pH下，测定所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(3-1)根据步骤(2-1)中不同pH值下测得的紫外吸收和荧光光谱，绘制化合物的荧光强度或紫外吸收和pH值的曲线，即为氢离子浓度或pH值对所述化合物的荧光强度或紫外吸收的滴定曲线。
6.一种如权利要求1所述的化合物在检测细胞中硫醇类化合物浓度中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述检测包括步骤：
(a)绘制硫醇类化合物浓度对所述化合物荧光强度的滴定曲线；其中，所述硫醇类化合物选择下组：半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸；
(b)检测所述化合物在细胞中的荧光强度，根据步骤(a)的滴定曲线，确定所述细胞中所述硫醇类化合物的浓度。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述步骤(a)的滴定曲线的绘制方法包括如下步骤：
(a-1)制备如权利要求1所述的化合物的DMSO溶液，为储备液1；
(b-1)制备所述硫醇类化合物的水溶液，为储备液2；
(c-1)准确移取60μL储备液1至60mL pH 7.40、6.04、6.55或9.09的PBS缓冲溶液中，再滴定储备液2至上述溶液，使得所述硫醇类化合物的最终浓度为0.5～100μM，在硫醇类化合物不同浓度下，测定权利要求1所述化合物的紫外吸收和荧光光谱；
(d-1)根据步骤(c-1)，绘制所述硫醇类化合物的浓度对如权利要求1所述化合物紫外吸收或荧光强度的滴定曲线。
9.一种如权利要求1所述的化合物在体外抑制癌细胞中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中，所述癌细胞选择下组：H1975人肺腺癌细胞、A549人肺腺癌细胞、Hela人宫颈癌细胞、MDA-MB-231人乳腺癌细胞。
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