CN108531521B - 一种产不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产不饱和脂肪酸的方法，包括如下步骤：S1.将长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)菌株UM‑28接种于种子培养基中，发酵得到种子液；S2.将S1中种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；S3.将S2中经过发酵培养的物质于布氏漏斗内进行真空抽滤，收集湿菌体，干燥后得到干菌体；S4.将S3中干菌体加入盐酸浸泡，水浴后，冷却，加入三氯甲烷，震荡，离心去除上层杂质，有机层加入氯化钠溶液，再次离心，收集不饱和脂肪酸。其代谢产物中不饱和脂肪酸含量高达75.69％，其中主要的成分是油酸和亚油酸。其开发和利用价值高，应用前景可观。

Description

一种产不饱和脂肪酸的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一株产不饱和脂肪酸的长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28的应用。
背景技术
不饱和脂肪酸是碳链未完全被氢原子所饱和的含有一个或多个双键的一类物质，是生物膜的重要组成成分，其不饱和度与细胞膜的流动性密切相关。而细胞膜的流动性是生化物质膜转运的基础，不饱和脂肪酸含量越高，生化物质转运越容易。脂肪酸也是许多重要代谢产物(前列腺素、血栓烷、白细胞三烯、脂氧素和环氧二十碳三烯等)的前体物质，对于人体血液流变、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。此外，不饱和脂肪酸对人体一些营养素缺乏症和某些慢性病有积极防治作用，在促进婴幼儿视力与脑部发育，预防与改善糖尿病、肥胖、心脑血管疾病等健康方面起着重要的作用，膳食中不饱和脂肪酸的种类及比例对维持机体健康非常重要，摄入的脂肪酸不足或比例失衡均会对健康造成影响甚至诱发某些疾病的产生。微生物来源的油脂具有传统的动植物油脂不可比拟的优势，其发酵生产不占用耕地，产量受自然环境的影响较小，可利用多种碳源氮源发酵生产。被认为是动植物油脂的替代资源。
伞形霉属(Umbelopsis)隶属于真菌界(Fungi)毛霉门(Mucoromycota)毛霉亚门(Mucoromycotina)伞形霉目(Umbelopsidales)的伞形霉科(Umbelopsidaceae)，是该科的唯一属。该属真菌细胞含多种脂肪酸，多为长链(大于12碳)偶数碳不饱和脂肪酸，主要集中于16～18碳(约占90％)。伞形霉属真菌是重要的油脂生产菌。比如，本属的深黄伞形霉(Umbelopsis isabellina)油脂积累可达干重的86％，已用于基因工程来提高油脂产量。该种油脂中含多种不饱和脂肪酸，例如，γ-亚麻酸(GLA)，它是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体。无论是将微生物油脂作为生物柴油应用于工业，还是将其作为功能性油脂应用于食品保健，都将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一株产不饱和脂肪酸的长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28在产不饱和脂肪酸中的应用。
本发明对高产菌株进行鉴定及油脂组成气相色谱法分析(GC)检测，为该菌株产油脂的开发与利用提供一定的参考依据。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
一株产不饱和脂肪酸的长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28，所述长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28于2013年1月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3.16317。
所述长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28的ITS基因序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明同时提供一种产不饱和脂肪酸的方法，包括如下步骤：
S1.将长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)菌株UM-28接种于种子培养基中，发酵得到种子液；
S2.将S1中种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
S3.将S2中经过发酵培养的物质于布氏漏斗内进行真空抽滤，收集湿菌体，干燥后得到干菌体；
S4.将S3中干菌体加入盐酸浸泡，水浴后，冷却，加入三氯甲烷，震荡，离心去除上层杂质，有机层加入氯化钠溶液，再次离心，收集不饱和脂肪酸；
所述长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28于2013年1月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3.16317。
优选地，所述S1中发酵为在180r/min摇床震荡，25℃连续培养24h.
优选地，所述的种子液按5％的接种量接种到发酵培养基中。
优选地，所述得种子培养基为：将马铃薯200g，葡萄糖20g加入蒸馏水1000mL中。
优选地，所述的发酵培养基为：将葡萄糖120g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸铵2g和蒸馏水1000mL混合，pH值为5.9～6.0。
优选地，所述的发酵培养为在180r/min摇床震荡，25℃连续发酵5天。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提供了一株UM-28菌株在代谢产物中不饱和脂肪酸含量高达75.69％，其中主要的成分是油酸和亚油酸。其开发和利用价值高，应用前景可观。
附图说明
图1为菌株UM-28的菌落的形态。
图2为菌株UM-28的显微形态。
图3为菌株UM-28的系统进化树。
图4为标准样品GC谱图。
图5为菌株UM-28代谢产物油脂气相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：
1、菌株来源与培养基
土壤采集于中国吉林省长白山地区(北纬42°10′548″—44°02′274″，东经126°35′399″—128°55′815″)。选取合适采样点去除表层有机质，用小铁铲取土壤20—30g于无菌塑料袋中，记录采集日期、地点，坐标位置，生态环境等信息，送至实验室进一步处理。
所用的主要试剂和仪器为：麦芽提取物培养基(Malt Extract Agar.MEA)购于OXOID公司，主要用于形态观察；马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：将马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，加入蒸馏水1000mL，用于菌株分离、纯化；种子培养基(g/L)：将马铃薯200g，葡萄糖20g加入蒸馏水1000mL中；发酵培养基(g/L)：将葡萄糖120g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸铵2g，蒸馏水1000mL，pH值为5.9～6.0。ITS PCR扩增采用通用引物ITS4(5′-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3′)和ITS5(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′)，由上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司合成。
2、真菌的分离
采用稀释分离平板法，从选取的样品中称取5g，倒入装有500ml的无菌蒸馏水稀释，在室温条件下磁力搅拌机上用200rpm剧烈搅动10min，用移液器吸取200μL悬浮液滴在表面干燥的PDA培养基上，用玻璃珠涂布并标记与记录，放在预先设置为25℃的培养箱中进行培养。
3、菌株的纯化
对形态初步鉴定为接合菌的菌株，采用单孢法进行纯化。挑取孢子囊，放入1mL无菌水的试管中，剧烈震荡使孢囊壁消解或破裂释放出孢囊孢子，震荡混匀制成孢子悬浮液。用移液枪吸取1μL孢子悬浮液，打入新的1mL无菌水的试管中稀释。每稀释1次，其浓度达到原始浓度的10-3倍。吸取100μL合适稀释倍数(10-3–10-6)的孢子悬浮液，滴入含有抗生素(50μg/mL氨苯青霉素，50μg/mL硫酸链霉素)的PDA培养皿中，3mm玻璃珠涂布均匀，室温倒置培养。培养12小时后，每隔3小时在体视显微镜下观察培养皿中孢子萌发情况，寻找萌发的单个孢子并标记位置。切取单孢菌落的培养块，转至PDA冷冻管中继续培养成熟，加10％甘油于4℃下保藏。
4、菌株UM-28鉴定
4.1形态学鉴定：参考《常见与常用真菌》方法，对目标菌株进行菌落、显微形态等进行观察鉴定。
在MEA培养基、20℃下生长，菌落扩展速度，5d后直径可达29-31mm红褐色，被绒毛状，低矮，约1mm高，平坦中央不突起，具有生长环纹，随着培养时间的延长在产孢菌丝上方产生一层放射状白色菌丝的角变(图1)。
对生长7d的孢子进行镜检，结果表明，孢囊梗从基内菌丝上发生，分枝处具有膨大的泡囊(图2)，近球形到壶形，伞状分枝，有1—2个隔膜，总有1个分隔位于分枝基部；孢子囊多孢，球形或近球形，直径(9—)11—16μm，红褐色；囊壁缓慢消解，囊领无或小；囊轴小而明显，扁球形，高1.5—4.0μm，宽3.0—5.5μm，无色；孢囊孢子棱角，等轴，单个时近透明，成堆时淡红褐色，无附属物。
4.2序列测定及系统发育树建立：采用真菌ITS扩增通用引物ITS4、ITS5扩增ITS1—5.8S—ITS2区域。PCR反应体系(25μL)：2×Master，5μmol/L引物各0.75—0.1Μl，DNA模板3—7Μl，其余用灭菌的双蒸水补足。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火50sec，72℃延伸1min，72℃终延伸10min，33个循环；4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将确认的目标产物送至上海美吉生物医药科技有限公司北京分公司进行测序。
根据测得的ITS基因序列，从NCBI的GenBank数据库进行同源性搜索，下载相关序列，用贝叶斯(Bayesian)法构建系统发育树，并用bootstrap的方法统计所构建系统发育树的可靠性。
菌株UM-28的ITS基因序列与亲缘关系较近的已知菌序列进行比对并构建系统发育树(如图3所示)，发现菌株UM-28和葡酒色伞形霉位于同一分支，其中长白伞形霉形成一个单独分枝，结合形态与分子鉴定结果，确定UM-28为新种。
长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28于2013年1月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 3.16317，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。其ITS基因序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2
菌株产油脂GC分析
将目标菌长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28接种到发酵培养基中，25℃、180r/min摇瓶发酵5d后，将发酵液于布氏漏斗内进行真空抽滤，收集湿菌体，称取菌丝体的质量，于70℃恒温烘箱烘干至恒重，得到干菌体。
准确称取0.5g干菌体，按每克菌加入6ml 4mol/L盐酸的比例混合均匀浸泡30min，再用沸水处理5min，-20℃快速冷却20min，加入等体积的三氯甲烷—甲醇溶液(体积比1:1)，放入摇床震荡20min，3000r/min离心15min，吸取三氯甲烷层，加入等体积0.1％氯化钠溶液，混匀，3000r/min离心15min，再收集三氯甲烷层并水浴挥发三氯甲烷层。
油脂甲酯化处理：将上述0.5g干菌体提取的油脂，加入0.6mol/L氢氧化钠-甲醇溶液2mL和正己烷2mL后，剧烈震荡2min，在30℃放置15min，加入蒸馏水5mL，静置分层，取正己烷层分析脂肪酸组成与含量。
GC条件：气相色谱仪Agilent 7890型；气相色谱柱为HP-ULTRA(安捷伦25m×0.2mm×0.33μm)；二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃·min-1升至260℃，而后40℃·min-1升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃，检测器温度300℃；载气为氢气(2mL min-1)、尾吹气为氮气(30mL·min-1)；柱前压l0.00psi(1psi＝6.895kPa)；进样量lμL，进样分流比100﹕l。
菌株UM-28代谢产物提取的油脂经甲酯化后的GC分析(图5)，共出现22个有效峰，根据与混标出峰时间作比较(图4)，检测到10种不饱和脂肪酸，含量占总油脂的75.69％，其中以C18不饱和脂肪酸的18:1cis 9(w 9)(油酸)、18:2cis 9,12(亚油酸)和18:3cis 6,12,14(十八碳三烯酸)为主，分别占总油脂的47.03％、12.93％和11.49％。同时，检测到含量占总油脂24.17％的12种饱和脂肪酸，其中16:0(棕榈酸)与18:0(硬脂酸)占22.61％。
表1：长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28代谢产物油脂中各脂肪酸的含量
Figure BDA0001590474500000061
Figure BDA0001590474500000071
实施例3
不饱和脂肪酸液体发酵
1.种子液制备
挑取斜面长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)UM-28于种子培养基中，种子培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20。180r/min摇床震荡，25℃连续培养24h。
2.不饱和脂肪酸液体发酵
按接种量5％的比例将种子液接种到发酵培养基中，发酵培养基(g/L)：葡萄糖120，酵母膏0.5，磷酸二氢钾2，硫酸铵2，蒸馏水1000mL，pH值为5.9～6.0。180r/min摇床震荡，25℃连续培养5d。
3.菌体收集
将上述发酵好的培养物于布氏漏斗内进行真空抽滤，收集湿菌体，于70℃恒温烘箱烘干至恒重，计算生物量(g/L)，按公式(1)。
Figure BDA0001590474500000072
本实验结果从发酵液中移取300mL菌液，烘干后得到干菌质量1.86g。
Figure BDA0001590474500000073
2.油脂的提取
参照实施例2中菌株产油脂的方法，将再收集三氯甲烷层并水浴挥发三氯甲烷层后得到的油脂进行含量计算。计算公式如式(2)。
Figure BDA0001590474500000074
本实验中称取1.86g干菌提出油脂0.453g。
Figure BDA0001590474500000081
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
中国科学院大学
<120> 一种产不饱和脂肪酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> 长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccaaaagata atctttcaac atctgaaaga 60
tcttaccttt gtgctggctt tgacagtttt gtacttttgg ggctttaaaa tggttcagtt 120
agtaaaagra ggggagtaat ccctttttca ttgctrctgg atcggcccca aaaaatcata 180
tcatccttat aattttttct gattaattaa cacatgattt taataatctg tttaaaacaa 240
ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg 300
taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcactccttg 360
gtattccgag gagtatgcct gtttcagtat catgagcact ctcacaacta acctttgggt 420
gaaattgtgg aattggaatg cgctgattkt aataaccagc ccttctaaaa tctatttcat 480
gactgtcacc taacacagca gtttggccta atagttttga cattgatttg tcaaatcttt 540
ggcttacatt tgcttcaggt tgtcagtttt gataatacag aaaactcatt caaattttga 600
tctgaaatca ggtagggcta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 654

Claims (6)

1.一种产不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将长白伞形霉(Umbelopsis changbaiensis)菌株UM-28接种于种子培养基中，发酵得到种子液，所述菌株的保藏编号为CGMCC 3.16317；
S2.将S1中种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；
S3.将S2中经过发酵培养的物质于布氏漏斗内进行真空抽滤，收集湿菌体，干燥后得到干菌体；
S4.将S3中干菌体加入盐酸浸泡，水浴后，冷却，加入等体积的三氯甲烷-甲醇溶液，震荡，离心，吸取三氯甲烷层，有机层加入氯化钠溶液，再次离心，收集三氯甲烷层的不饱和脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵为在180 r/min摇床震荡，25℃连续培养24h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子液为按5%的接种量接种到发酵培养基中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为：将马铃薯200 g，葡萄糖20 g加入蒸馏水1000 mL中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：将葡萄糖120 g，酵母膏0.5 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸铵2 g和蒸馏水1000 mL混合，pH值为5.9~6.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养为在180 r/min摇床震荡，25℃连续培养5天。
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