CN1085214C

CN1085214C - 核酸纯化旋转离心柱及用该柱提取核酸的方法

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Publication number: CN1085214C
Application number: CN99108139A
Authority: CN
Inventors: 王欣波
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2002-05-22
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: CN1277204A

Abstract

本发明涉及核酸(DNA和RNA)纯化的分子生物产品及方法，适用于各种分子生物学研究及临床检测。它包括柱体、上垫片、固态膜、下垫片、柱体中空，上垫片、固态膜、下垫片从上而下依次设在柱内，三者所形成的三夹结构使柱体分隔为上空柱体和下空柱体。本发明在核酸纯化操作过程中不需加蛋白酶消化，省略了繁琐的苯酚一氯仿萃取和酒精沉淀步骤，使DNA提取时间大幅度缩短，并且纯度更高，达到OD_260/280＞1.70，提取量也明显提高。

Description

核酸纯化旋转离心柱及用该柱提取核酸的方法

本发明涉及核酸(DNA和RNA)纯化的分子生物产品及方法，适用于各种分子生物学实验、生物学实验、临床医学研究、法医学鉴定、教学科研和临床检测。

现代分子生物学研究表明，除了少数特殊病毒外，核酸几乎是所有生物体遗传信息的载体。作为基因克隆、基因分析及基因诊断等分子生物学领域的基础，核酸的分离和纯化是现代基因实验必不可少的、极关键的一步。获得优质的核酸是分子生物学实验成功的必要条件之一。

在基因实验中，经典核酸纯化方法如DNA纯化方法首先采用物理方法(如超声波、加热、研磨等)或化学方法(如去污剂、高盐离子、强酸强碱等)破碎细胞和细胞核，使包围在细胞或细胞核中的DNA暴露出来，然后运用蛋白酶如蛋白酶K对细胞中和粘附在DNA上的蛋白质进行消化降解；当DNA从细胞、细胞核和蛋白质中游离出后，利用DNA在不同有机溶液中有不同溶解度的特性，通过苯酚和氯仿萃取，使DNA溶解在氯仿中，然后加入无水乙醇，在沉淀中得到纯DNA结晶。结晶DNA经洗涤、烘干后，在低盐缓冲液中重新溶解成水相DNA用于各种基因实验。由于经典核酸纯化方法不很适用于微量核酸纯化；一次操作需三至七小时；操作复杂、繁琐，对实验人员的技术要求很高；需用到较多挥发性有毒化学试剂；沉淀烘干、溶解等操作步骤不易掌握；因此常导致核酸纯化质量不高。

随着基因应用的不断推广发展，人们对快速简便的核酸纯化方法的需求越来越强烈，为此，从九十年开始，国际上许多公司陆续开发了多种快速核酸纯化产品，在这些产品中核酸纯化原理如DNA主要采用高盐或强去污剂破碎细胞，利用蛋白酶暴露DNA，然后避开经典DNA纯化中的萃取步骤，使DNA一步沉淀出来或先被吸附于硅藻胶等DNA亲和物上再洗脱下来。这些产品与经典核酸纯化操作相比具有一次操作25分钟至60分钟、无需用到挥发性有毒试剂和实验操作相对易于掌握的特点，但这些产品普遍存在对微量核酸纯化功能不强、需经蛋白酶处理尤其在DNA纯化方面、操作稳定性不高、核酸纯度不够高等缺陷。

针对现存核酸快速纯化产品的不足和基因实验的细分需求，本发明的目的在于提供一种无需蛋白酶、操作更加简便、迅速、提纯度更高的核酸纯化产品——核酸纯化旋转离心柱。

本发明的另一个目的在于提供一种用上述核酸纯化旋转柱提取核酸的方法。

本发明的目的通过如下方案实现：该核酸纯化旋转离心柱，包括使用时插放在相应大小的接液管或试管中的柱体、上垫片、固态膜、下垫片、柱体中空，上垫片、固态膜、下垫片从上而下依次设在柱内，上垫片、固态膜和下垫片所形成的三夹结构的上下方为上空柱体和下空柱体。

根据实际需要，在上垫片的上方可加一垫圈。上、下垫片的材料以疏水多孔材料为主，孔直径在1-200微米之间，特殊情况下，如遇凝胶状蛋白胶体，可以适当增大孔直径。固态膜的材料以对核酸纤维有亲和或吸附能力的材料为佳，固态膜的孔直径应小于垫片的孔直径，亦在1-200微米的范围内。上、下垫片和固态膜可采用多层，一般由1-3层组成。

用上述离心柱提取核酸的方法包括以下几个步骤：第一步：样品预处理，使核酸DNA或RNA处于沉淀结晶的临界状态附近，核酸以纤维形式混合在溶液中；第二步：将混合液加入离心柱内，经过离心、抽气，向上空柱体加压，向下空柱体抽气减压等方法使混合液从下空柱体排出，而DNA或RNA则被留在离心柱中；第三步：洗涤旋转离心柱内的DNA或RNA纤维；第四步：用低盐中性缓冲液将柱中高纯度的DNA或RNA纤维溶解后收集在干净的试管中，得到纯化的DNA或RNA。

本发明在核酸纯化操作过程中不需要加蛋白酶消化，省略了繁琐的苯酚一氯仿萃取和酒精沉淀步骤，这就使得提取DNA的时间大幅度缩短，提到纯基因组DNA只需8～10分钟；提取过程大大简化，略懂基因方向知识的人员只需按指定步骤便能操作。本发明用旋转离心柱提取核酸。提取的DNA纯度更高，达到OD_260/280＞1.70，提取量也明显提高。

附图说明：

图1为旋转离心柱的结构示意图。

图2为DNA的操作过程示意图。

下面将结合附图对本发明之实施例作进一步说明：

如图1所示，本核酸纯化旋转离心柱包括柱体1、上垫片2、固态膜3、下垫片4、柱体1中空，底部呈漏斗状，使用时可以插放在相应大小的接管或试管中。上垫片2、固态膜3和下垫片4从上而下依次设在柱内，上垫片2、固态膜3和下垫片4所形成的三夹结构使柱体分隔为上空柱体7和下空柱体5，根据实际需要，在上垫片2的上方还可加一垫圈6。根据不同要求，柱体1中可装有多层上垫片，多层固态膜和多层下垫片，通常可采用1-3层。上、下垫片2、4的材料可以有所不同，也可以相同，一般垫片的材料以疏水多孔材料为主，孔直径在1-200微米之间，如遇凝胶状蛋白胶体，可以适当增大孔直径。固态膜3的材料以对核酸有亲和或吸附能力的材料为佳，固态膜3的孔直径应小于垫片的孔直径，亦在1-200微米的范围内。通过上垫片2、固态膜3和下垫片4的三夹结构可以使核酸的DNA或RNA纤维粘附、挂附在离心柱中，与样品溶液分离，便于进一步提纯。柱体、垫片可以采用较结实有支撑能力的材料如塑料材料制作。

当样品经过处理(无蛋白酶消化步骤)后，核酸DNA或RNA处于沉淀结晶的临界状态附近，核酸以纤维形式混合在溶液中，蛋白质、糖类、脂肪、盐类等杂质则溶在溶液中，混合液被加入离心柱的上空柱体7内后，通过离心、抽气，向上空柱体7加压、向下空柱体5抽气等方法使混合液从下空柱体5中排出，DNA或RNA纤维会粘附、挂附在上垫片2、固态膜3和下垫片4的三夹结构中。如果固态膜3具有特导性地亲和吸附DNA或RNA的能力，则纯化效果更佳。大多数杂质如蛋白质、糖类、脂肪、盐类等则可通过上垫片2、固态膜3和下垫片4的三夹结构被离心出离心柱至接液管中。再经两次冲洗离心，将残留在DNA或RNA纤维和柱中的微量杂质(二价阳离子和一些杂质蛋白质等物)除去。最后用低盐中性缓冲将柱中高纯度的DNA或RNA纤维溶解后离心收集在干净的试管中，便得到纯化的DNA或RNA。现以DNA纯化为例(如图2所示)：

A.准备工作：准备好样品、1.5ml离心管、旋转离心柱及接液管。

B.样品预处理。

C.加样：取200ml样品加入1.5ml离心管内。

D.加入B1试剂裂解细胞：在振荡同时加入200ulB1试剂，并继续振荡5S以上，充分混合。

E.加B2试剂形成DNA纤维：在振荡同时加入200ulB2试剂，并继续振荡3S以上，充分混匀。

F.柱体离心使DNA纤维被固定在柱的三夹结构中：将混合液转移到套有干净接液管的旋转离心柱内，离心(14,000rpm或16,000×g，60s)。

G.B3洗涤柱中残留杂质：将旋转离心柱转移到干净接液管中，加入400ulB3试剂，离心(14,000rpm或16,000×g，60s)

H.重复步骤G。

I.空管离心，除去柱中残留的液体：将旋转离心柱转移到干净接液管中，离心(14,000rpm或16,000×g，2min)

J.B4溶解洗脱柱中DNA纤维：将旋转离心柱转移到干净的1.5ml离心管中，加入100ulB4试剂，离心(14,000rpm或16,000×g，60s)，离心管中便为提取好的核酸。

本发明能从血液、尿液、组织液、粪便、组织、植物组织等多种生物样品和临床样品中快速、简便、高效地提取高纯度DNA或RNA，是现代基因实验的理想用品。通过本发明纯化的DNA或RNA可以去除PCR和其它分子生物学实验的抑制物，纯化的核酸可直接用于医学研究：如癌症研究；HLA分型分析；临床检测：如微生物检测、病毒检测、遗传病检测；法医学鉴定：如亲子鉴定、物种鉴定；生物科研：如人类(动、植)基因分析、转基因克隆筛选、动植物育种、动植物病原体检测等；教学研究：如分子生物实验教学。

Claims

1.一种核酸纯化旋转离心柱，包括使用时插放在相应大小的接液管或试管中的柱体(1)、上垫片(2)、固态膜(3)、下垫片(4)、柱体(1)中空，上垫片(2)、固态膜(3)、下垫片(4)从上而下依次设在柱内，上垫片(2)、固态膜(3)和下垫片(3)所形成的三夹结构的上下方为上空柱体(7)和下空柱体(5)。

2.如权利要求1所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述上垫片(2)的上方有一垫圈(6)。

3.如权利要求1所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述柱体(1)底部呈漏斗状。

4.如权利要求1所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述上、下垫片(2、4)使用的是以孔直径为1-200微米之间的疏水多孔材料为主。

5.如权利要求4所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述的上、下垫片(2、4)分别由1-3层组成。

6.如权利要求1所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述固态膜(3)使用的是对核酸有亲和或吸附能力的材料，孔直径小于垫片的孔直径，亦在1-200微米之间。

7.如权利要求6所述的核酸纯化旋转离心柱，其特征在于：所述的固态膜(3)由1-3层组成。

8.一种用上述离心柱提取核酸的方法，它包括以下几个步骤：

a：样品预处理，使核酸DNA或RNA处于沉淀结晶的临界状态附近，以纤维形式混合在溶液中；

b：将混合液加入离心柱内，经过离心、加压或抽气，使混合液从下空柱体排出，而DNA或RNA则被留在离心柱中；

c：洗涤旋转离心柱内的DNA或RNA纤维；

d：用低盐中性缓冲液将柱中高纯度的DNA或RNA纤维溶解后收集在干净的试管中，得到纯化的DNA或RNA。