CN108486245B - Wfs1作为一种新的分子标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了WFS1作为类风湿性关节炎和/或骨关节炎的诊治靶标。据此可将WFS1用于开发诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品、开发治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为结肠腺癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

WFS1作为一种新的分子标志物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及WFS1基因在类风湿性关节炎和骨关节炎的诊断、治疗中的用途。

背景技术

类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，以多关节受累为特征，可进展出现关节破坏和畸形，常累及外周关节。病因不清，关节外器官受累如肺间质病变和干燥综合征等也很常见。恰当的早期治疗可以改善关节症状和功能，降低死亡率，减少并发症。

一篇2010年的系统回顾研究发现，北美和北欧的类风湿关节炎发病率估计在0.5％～1.1％。发展中国家的发病率相对更低(0.1％～0.5％)。类风湿关节炎在女性更常见(男女发病率1：3)。任何年龄均可发病，一项回顾队列研究称中位发病年龄为55.6岁；英国每年新诊断类风湿关节炎病例数约为20，000。由此推算，每位全科医生每2年可接诊1例新发病患者。

来自英国、欧洲、美国的研究均发现全科医师存在类风湿关节炎诊断延迟。英国国家审计署2009年报告，确诊为类风湿关节炎之前，患者去其全科医师处就诊平均达4次之多，有18％的患者甚至需就诊8次才能确诊。在初级医疗中，早期类风湿关节炎的诊断与其他骨骼肌肉问题一样困难：临床特征表现不易辨识，炎症标志如血沉和C反应蛋白又没有特征性意义，而特异性标志阴性如类风湿因子(31％患者出现血清阴性)和抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP，33％患者血清阴性)又常见血清阴性表现。

类风湿关节炎导致的残疾可使28％的患者在一年内失去工作能力。从症状发生开始，在3个月内的「窗口期」开始治疗，可以延缓疾病进展。而延迟治疗则增加影像学关节破坏和致死的风险。而且，在3～6个月后再开始治疗更易出现单药治疗失败并导致耐药。

类风湿性关节炎就是关节疾病里面的一种类风湿性关节炎，会出现关节肿痛的一些症状。但是还有很多的疾病和类风湿性关节炎的症状是非常相似的，特别容易让人产生误导，如骨关节炎。

骨关节炎是冲为退行性关节炎或者是骨质增生，影响到了人体关节的一种疾病，主要的原因就是关节长时间的负重而导致的关节表面的软骨受到了损伤周围的骨性组织增生，当骨性关节炎出现在手指上的时候，就有可能会被误诊为类风湿性关节炎。

所以寻找一种可以在早期有效区别诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的方法是亟待解决的问题，以免因误诊误治延误病情，保证患者得到正确的治疗。

近年来，在分子层面研究用于诊断类风湿性关节炎或骨关节炎的标志物不断涌现，如以下所列申请号的专利：201310596649.X，201580058686.2，201380044584.6，201310483384.2，200610070393.9，201510725004.0，201510627048.X，201510724747.6，201510548635.X，201510548624.1，201510549564.5，201510725755.2。还未见有任何关于区别诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的分子标志物，申请人在这样的背景下开展了本研究。

发明内容

为了解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种可用于类风湿性关节炎和/或骨关节炎早期诊断的分子标志物。使用基因标志物来区分类风湿性关节炎和骨关节炎具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能确诊，提高治愈率。

根据本发明的一个方面，本发明提供了检测WFS1基因表达的产品在制备诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具中的应用。

进一步，所述检测WFS1基因表达的产品包括检测WFS1基因mRNA水平的产品、和/或检测WFS1蛋白水平的产品。

进一步，所述检测WFS1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测WFS1基因及其表达产物的表达水平以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增WFS1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增WFS1基因的引物；所述用免疫检测诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：与WFS1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：与WFS1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与WFS1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与WFS1基因的核酸序列杂交的探针。

所述实时定量PCR诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增WFS1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述检测WFS1基因表达的产品可以是检测WFS1基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知WFS1基因的异常与类风湿性关节炎和/或骨关节炎相关也属于WFS1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具，所述工具包括检测WFS1基因表达的试剂；所述试剂包括检测WFS1基因mRNA的引物和/或探针、检测WFS1蛋白的抗体。

所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测WFS1基因转录水平的针对WFS1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的WFS1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括WFS1基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎和/或类风湿性关节炎相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括WFS1蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨关节炎或类风湿性关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与区分类风湿性关节炎和骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高不同类型关节炎的诊断准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测WFS1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括WFS1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测WFS1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对WFS1基因的引物和/或探针。根据WFS1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测WFS1基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测WFS1基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测WFS1基因表达的试剂。

与WFS1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述WFS1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述WFS1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与WFS1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测WFS1基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明还提供了WFS1基因和/或其表达产物在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。

进一步，所述药物包括WFS1基因或其表达产物的促进剂。所述促进剂包括促进WFS1基因表达的成分、促进WFS1基因表达产物稳定性的成分、促进WFS1基因表达产物活性的成分。

进一步，所述促进WFS1基因表达的成分包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进WFS1蛋白含量的试剂。

具体地，所述促进WFS1基因表达的成分包括：含有WFS1基因的试剂、携带WFS1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有WFS1蛋白质的试剂。

本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的WFS1蛋白的缺失或不足，通过提高WFS1蛋白的表达，从而治疗因WFS1蛋白缺乏导致的类风湿性关节炎和/或骨关节炎。另一方面可以用于促进WFS1蛋白的活性或者功能，从而治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物，所述药物包括上面所述的WFS1基因和/或其表达产物的促进剂。

进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有WFS1基因的药物或者含有WFS1蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有WFS1基因的药物或者含有WFS1蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗类风湿性关节炎或骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

在本发明的上下文中，“WFS1基因”包括WFS1基因以及WFS1基因的任何功能等同物的多核苷酸。WFS1基因(Chromosome 4，NC_000004.12(6260368..6303265))可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到相关序列。

在本发明的上下文中，WFS1基因表达产物包括WFS1的mRNA，WFS1蛋白。WFS1蛋白包括WFS1全蛋白或其部分肽。所述部分肽含有与类风湿性关节炎或骨关节炎相关的功能域。

“WFS1蛋白”包括WFS1蛋白以及WFS1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括WFS1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与WFS1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是WFS1蛋白的融合蛋白。对于与WFS1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留WFS1蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有类风湿性关节炎或骨关节炎、也包括判断受试者是否存在患有类风湿性关节炎或骨关节炎的风险。

在本发明的上下文中，“治疗”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈、另外，还包括疾病的预防。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了WFS1基因表达与类风湿性关节炎或骨关节炎相关，通过检测受试者滑膜组织中WFS1的表达，可以判断受试者是否患有类风湿性关节炎或骨关节炎、或者判断受试者是否存在患有类风湿性关节炎或骨关节炎的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种既可以诊断类风湿关节炎又可以诊断骨关节炎的分子标志物，该分子标志物不仅可以区分正常人和关节炎患者，还可以有效区分类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者。

本发明发现了一种既可以治疗类风湿关节炎又可以治疗骨关节炎的药物。一药多用，扩大药物适应症，减少经济负担。

附图说明

图1显示利用QPCR在转录水平上检测WFS1基因差异表达情况的统计图；

图2显示利用Western blot在蛋白水平上检测WFS1基因差异表达情况的统计图；

图3显示利用QPCR在转录水平上检测WFS1基因的过表达情况的统计图；其中，A：骨关节炎成纤维样滑膜细胞；B：类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞；

图4显示利用Western blot在蛋白水平上检测WFS1蛋白的过表达情况的统计图；A：骨关节炎成纤维样滑膜细胞；B：类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选骨关节炎滑膜组织、类风湿性关节炎滑膜组织和正常滑膜组织中的差异表达基因

5例类风湿关节炎患者的滑膜组织来自于医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的类风湿关节炎患者，所有病例的诊断符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎分类标准，其中女性3例，男性2例，平均年龄(55±8)岁，平均病程(12±7)年。5例骨关节炎患者滑膜组织来自于医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的骨关节炎患者，所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准，其中女性2例，男性3例，平均年龄(63±5)岁，平均病程(12±8)年。6例正常滑膜组织来自于外伤手术病人关节滑膜组织。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。

1、组织RNA的提取(利用Norgen RNA提取试剂盒)

1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体滑膜组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；

3)加入300μLLysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；

4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；

5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；

6)加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；

7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；

8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；

RNA吸附：

9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；

10)弃下层，重置收集管于柱上；

11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；

12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；

13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；

DNase处理：

14)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；

15)将收集管中的溶液重新移入柱中；

16)室温放置15min；

RNA洗涤：

17)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；

18)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管；

RNA洗脱：

19)把柱子放入1.7mL Elution管中；

20)加入30μl Elution Buffer；

21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min。

2、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、片段化RNA

Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

4、反转合成cDNA

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

5、连接adaptor

双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

6、UNG酶消化cDNA二链

在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

7、Illumina x-ten上机测序

Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。

8、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；

(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。

9、结果

用以上标准筛选得到在正常人和骨关节炎患者之间、正常人和类风湿性关节炎患者之间、类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者之间均存在表达差异的基因共367个。

实施例2差异表达基因的大样本验证

基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择WFS1基因进行验证，其在类风湿性关节炎和骨关节炎患者中表达均下调，且与骨关节患者相比，在类风湿性关节炎患者中下调幅度更大。

一、在转录水平上检测WFS1基因的差异表达

1、按照实施例1的方式收集类风湿性关节炎滑膜组织100名，骨关节炎滑膜组织100例，正常滑膜组织100例。

2、按照实施例的方式进行RNA的提取和质量检测

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR扩增检验

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增WFS1基因的正向序列5’-ACTTCTTCGCCTTCTTCAT-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-GTCCTGGAACACCTTGAG-3’(SEQID NO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*42个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中WFS1基因mRNA水平显著下调；与骨关节炎滑膜组织相比，类风湿性关节炎滑膜组织中WFS1基因mRNA水平显著下调，差异均具有统计学意义(*P<0.05)。将正常滑膜组织均值的95％可信区间的上界作为诊断实验的cut-off值，在此条件下，用WFS1诊断正常与骨关节炎的灵敏度为92％，特异度为85％，结果如表1所示；用WFS1诊断正常人与类风湿性关节炎患者的灵敏度为94％，特异度为83％，结果如表2所示。将骨关节炎滑膜组织均值的95％可信区间的上界作为诊断实验的cut-off值，在此条件下，用WFS1诊断骨关节炎与类风湿性关节炎的灵敏度为90％，特异度为87％，结果如表3所示。

表1正常人与骨关节炎患者区分

表2正常人与类风湿性关节炎患者区分

表3骨关节炎患者与类风湿性关节炎患者区分

二、在蛋白水平上检测WFS1基因的差异表达

1、组织蛋白提取

(1)先称取50mg组织，用液氮充分研磨；

(2)每份样品中加入500μl混合工作液(RIPA裂解液：PMSF＝100:1)充分震荡；

(3)离心机13000rpm/min离心10分钟，后取上清液分装于-80℃保存。

2、Western blot检测

将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。

3、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将WFS1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图2所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中WFS1蛋白含量显著下降；与骨关节炎滑膜组织相比，类风湿性关节炎滑膜组织中WFS1蛋白显著下降，差异均具有统计学意义(*P<0.05)。

实施例3WFS1基因表达质粒构建

1、WFS1基因表达载体的构建

根据WFS1基因的编码序列(如SEQ ID NO.5所示)设计扩增引物。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的WFS1基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-WFS1用于后续实验。

2、滑膜组织细胞体外培养

将无菌获取的类风湿性关节炎和骨关节炎的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm x 1mm x 1mm的组织块，加入胶原酶II(0.5mg/ml)37℃、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE标记的小鼠抗人CD11b进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性的细胞为成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocytes，FLS)用于本研究。

3、转染

将制备的成纤维样滑膜细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和WFS1过表达组(转染pcDNA3.1-WFS1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-WFS1的工作浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测

4.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

4.2逆转录和QPCR步骤同实施例2。

4.3结果

如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-WFS1的细胞中WFS1的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)

5、Western检测

5.1细胞总蛋白的提取

取对数期生长良好的成纤维样滑膜细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

5.2Western blot检测

步骤同实施例2。

5.3结果

如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-WFS1的细胞中WFS1的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4WFS1基因过表达对成纤维样滑膜细胞增殖的影响

1、步骤

以2×10⁵/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育，转染48h之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，WFS1基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如表4和表5显示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-WFS1细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4骨关节炎成纤维样滑膜细胞测定OD值

实验组	OD值(光密度)
		pcDNA3.1	0.1621±0.003
pcDNA3.1-WFS1	0.0792±0.002

表5类风湿性关节炎滑膜细胞测定OD值

实验组	OD值(光密度)
		pcDNA3.1	0.1602±0.004
pcDNA3.1-WFS1	0.0824±0.002

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> WFS1作为一种新的分子标志物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acttcttcgc cttcttcat 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcctggaac accttgag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttccaat atgattcca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttccatt gatgacaag 19

<210> 5

<211> 2673

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 5

atggactcca acactgctcc gctgggcccc tcctgcccac agcccccgcc agcaccgcag 60

ccccaggcgc gttcccgact caatgccaca gcctcgttgg agcaggagag gagcgaaagg 120

ccccgagcac ccggacccca ggctggccct ggccctggtg ttagagacgc agcggccccc 180

gctgaacccc aggcccagca taccaggagc cgggaaagag cagacggcac cgggcctaca 240

aagggagaca tggaaatccc ctttgaagaa gtcctggaga gggccaaggc cggggacccc 300

aaggcacaga ctgaggtggg gaagcactac ctgcagttgg ccggcgacac ggatgaagaa 360

ctcaacagct gcaccgctgt ggactggctg gtcctcgccg cgaagcaggg ccgtcgcgag 420

gctgtgaagc tgcttcgccg gtgcttggcg gacagaagag gcatcacgtc cgagaacgaa 480

cgggaggtga ggcagctctc ctccgagacc gacctggaga gggccgtgcg caaggcagcc 540

ctggtcatgt actggaagct caaccccaag aagaagaagc aggtggccgt ggcggagctg 600

ctggagaatg tcggccaggt caacgagcac gatggagggg cgcagccagg ccccgtgccc 660

aagtccctgc agaagcagag gcgcatgctg gagcgcctgg tcagcagcga gtccaagaac 720

tacatcgcgc tggatgactt tgtggagatc actaagaagt acgccaaggg cgtcatcccc 780

agcagcctgt tcctgcagga cgacgaagat gatgacgagc tggcggggaa gagccctgag 840

gacctgccac tgcgtctgaa ggtggtcaag taccccctgc acgccatcat ggagatcaag 900

gagtacctga ttgacatggc ctccagggca ggcatgcact ggctgtccac catcatcccc 960

acgcaccaca tcaacgcgct catcttcttc ttcatcgtca gcaacctcac catcgacttc 1020

ttcgccttct tcatcccgct ggtcatcttc tacctgtcct tcatctccat ggtgatctgc 1080

accctcaagg tgttccagga cagcaaggcc tgggagaact tccgcaccct caccgacctg 1140

ctgctgcgct tcgagcccaa cctggatgtg gagcaggccg aggtcaactt cggctggaac 1200

cacctggagc cctatgccca tttcctgctc tctgtcttct tcgtcatctt ctccttcccc 1260

atcgccagca aggactgcat cccctgctcg gagctggctg tcatcaccgg cttctttacc 1320

gtgaccagct acctgagcct gagcacccat gcagagccct acacgcgcag ggccctggcc 1380

accgaggtca ccgccggcct gctatcgctg ctgccctcca tgcccttgaa ttggccctac 1440

ctgaaggtcc ttggccagac cttcatcacc gtgcctgtcg gccacctggt cgtcctcaac 1500

gtcagcgtcc cgtgcctgct ctatgtctac ctgctctatc tcttcttccg catggcacag 1560

ctgaggaatt tcaagggcac ctactgctac cttgtgccct acctggtgtg cttcatgtgg 1620

tgtgagctct ccgtggtcat cctgctggag tccaccggcc tggggctgct ccgcgcctcc 1680

atcggctact tcctcttcct ctttgccctc cccatcctgg tggccggcct ggccctggtg 1740

ggcgtgctgc agttcgcccg gtggttcacg tctctggagc tcaccaagat cgcagtcacc 1800

gtggcggtct gtagtgtgcc cctgctgttg cgctggtgga ccaaggccag cttctctgtg 1860

gtggggatgg tgaagtccct gacgcggagc tccatggtca agctcatcct ggtgtggctc 1920

acggccatcg tgctgttctg ctggttctat gtgtaccgct cagagggcat gaaggtctac 1980

aactccacac tgacctggca gcagtatggt gcgctgtgcg ggccacgcgc ctggaaggag 2040

accaacatgg cgcgcaccca gatcctctgc agccacctgg agggccacag ggtcacgtgg 2100

accggccgct tcaagtacgt ccgcgtgact gacatcgaca acagcgccga gtctgccatc 2160

aacatgctcc cgttcttcat cggcgactgg atgcgctgcc tctacggcga ggcctaccct 2220

gcctgcagcc ctggcaacac ctccacggcc gaggaggagc tctgtcgcct taagctgctg 2280

gccaagcacc cctgccacat caagaagttc gaccgctaca agtttgagat taccgtgggc 2340

atgccattca gcagcggcgc tgacggctcg cgcagccgcg aggaggacga cgtcaccaag 2400

gacatcgtgc tgcgggccag cagcgagttc aagagcgtgc tgctcagcct gcgccagggc 2460

agcctcatcg agttcagcac catcctggag ggccgcctgg gcagcaagtg gcctgtcttc 2520

gagctcaagg ccatcagctg cctcaactgc atggcccagc tctcacccac caggcggcac 2580

gtgaagatcg agcacgactg gcgcagcacc gtgcatggcg ccgtgaagtt cgccttcgac 2640

ttctttttct tcccattcct gtcggcggcc tga 2673

Claims (7)

1.检测WFS1基因表达的产品在制备诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过反转录PCR检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增WFS1基因的引物；所述通过实时定量PCR检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增WFS1基因的引物；所述通过免疫检测检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：与WFS1蛋白特异性结合的抗体；所述通过原位杂交检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：与WFS1基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中，蛋白芯片包括与WFS1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与WFS1基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述通过实时定量PCR检测WFS1基因表达以诊断类风湿性关节炎和/或骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增WFS1基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.WFS1基因和/或其表达产物在制备治疗类风湿性关节炎和/或骨关节炎的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包括促进WFS1基因表达的成分、促进WFS1基因表达产物稳定性的成分或促进WFS1基因表达产物活性的成分。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，促进WFS1基因表达的成分包括含有WFS1基因的试剂、携带WFS1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂或含有WFS1蛋白质的试剂。

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