CN108474801A - 冠状动脉疾病的诊断标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及冠状动脉疾病的诊断。具体地，本发明涉及使用磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为分子标记来诊断冠状动脉疾病。
Description
技术领域
本发明涉及冠状动脉疾病的诊断。详细地，本发明涉及使用磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为分子标记来诊断冠状动脉疾病。
现有技术
在日本人中，心脏疾病是仅次于癌症的第二死亡原因(日本总务省(MinistryofInternal Affairs and Communications)、统计局(Statistics Bureau)的统计数据)，并且其中大多数为冠状动脉疾病(缺血性心脏病)。冠状动脉疾病是由流入向心肌供血的冠状动脉的血流匮乏且心肌的供血不足造成的疾病。动脉硬化是冠状动脉疾病的主要原因。血管内部狭窄导致供血量的减少和流向心肌的血流中断。从血液供应的氧气量不满足心肌所需的氧气需求，并且产生缺氧的状态。这导致心绞痛和心肌梗死。
动脉硬化的主要原因是脂类代谢异常，包括低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的增加。因此，伴随动脉硬化改变的脂质是冠状动脉疾病生化标记的潜在候选物。特别是，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇是从动脉硬化到冠状动脉疾病的标记和致病因子。然而，通过施用他汀类药物而充分降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇不总是能够预防心血管事件(非专利文献2)。这并不能说明低密度脂蛋白(LDL)胆固醇是足够的冠状动脉疾病标记或治疗靶标。
关于冠状动脉疾病的标记，尽管专利申请(专利文献1)中存在使用血液中至少两种脂质分析物(如磷脂酰肌醇(36:1))的量作为指标来诊断冠状动脉疾病，但通过更方便的评估方法诊断出冠状动脉疾病的标记仍未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际早期披露号2011/063470
非专利文献
非专利文献1：American Journal ofCardiology[美国心脏病学杂志]，2008，第101卷，第8期，增刊，第S27-S35页
发明概述
有待由本发明解决的问题
本发明解决了开发用于诊断动脉硬化的便捷方法的问题。
用于解决问题的手段
鉴于上述问题，诸位发明人进行了深入研究，并且作为结果，基于如下发现成功地完善了本发明：可以通过使用外周血中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为标记来诊断冠状动脉疾病。
也就是说，本发明涉及如下内容：
(1)一种用于检测冠状动脉疾病的方法，该方法包括确定源自受试者的测试样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的步骤，其中该确定值被用作指示该样品源自患有冠状动脉疾病的人的指标。
(2)根据(1)所述的方法，其中该确定值小于参考值的事实被用作指示该测试样品是源自患有冠状动脉疾病的人的样品的指标。
(3)根据(2)所述的方法，其中该参考值是源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品中的量。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的方法，其中该测试样品是血液。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中使用质量分析或与磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)特异性结合的抗体或抗体片段进行该确定。
(6)一种用于检测冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包含磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)。
(7)一种用于检测冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包含与磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)特异性结合的抗体或抗体片段。
(8)一种用于检测冠状动脉疾病的标记，该标记由磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)组成。
(9)一种用于治疗冠状动脉疾病的方法，通过根据(1)至(5)中任一项所述的方法检测的冠状动脉疾病以及通过一种或多种选自由以下组成的组的治疗来治疗已检测出冠状动脉疾病的受试者：药物疗法、手术、运动疗法和饮食疗法。
发明效果
根据本发明，因为例如磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)可以单独作为标记使用，所以可以便利地诊断出冠状动脉疾病。本发明进一步表征为受试者压力的减小，因为可以使用血液或血清进行确定。
附图简要说明
[图1]图1是显示磷脂酰肌醇(36:5)的实例的图。
[图2]图2是显示溶血磷脂酰肌醇(20:5)的实例的图。
[图3]图3示出了对照组和冠状动脉疾病组的外周血中磷脂酰肌醇(36:5)浓度的相对值。
[图4]图4示出了磷脂酰肌醇(36:5)的ROC曲线。
[图5]图5示出了对照组和冠状动脉疾病组的外周血中溶血磷脂酰肌醇(20:5)浓度的相对值。
[图6]图6示出了溶血磷脂酰肌醇(20:5)的ROC曲线。
发明实施例
在本说明书中使用的术语是根据通常在本领域中使用的定义，除非另外说明。以下给出了本发明的具体实施例，但本发明不限于这些实施例。
本发明提供一种用于判定受试者是否患有冠状动脉疾病(为患有冠状动脉疾病的人)的方法。
该方法涉及
用于检测冠状动脉疾病的方法，该方法包括确定源自受试者的测试样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的步骤，其中该确定值被用作指示该样品源自患有冠状动脉疾病的人的指标。
另外，本发明
包括用于检测冠状动脉疾病的方法，该方法包括确定源自受试者的测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的步骤，其中测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量小于参考值的事实被用作指示该测试样品是源自患有冠状动脉疾病的人的样品的指标。
此外，本发明
包括用于检测冠状动脉疾病的方法，该方法包括确定源自受试者的测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的步骤，其中测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量小于源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品的量的事实被用作指示该测试样品是源自患有冠状动脉疾病的人的样品的指标。
也就是说，通过使用上述方法来确定样品是源自患有冠状动脉疾病的人可以筛选(诊断)患有冠状动脉疾病的人。
本发明的突出特征是使用源自受试者的测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量作为分子标记。“测试样品”采集来自受试者的包括源自尿液、全血、血浆、血清或血液的样品，并且为方便起见，优选可以由外周血制备的样品。外周血可以从任何部位采集，但通常从受试者的静脉采集。通过采集来自手臂静脉的外周血，可以在减轻受试者的压力的情况下方便地执行本发明。优选从采集的外周血中分离血浆，并确定血浆中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量。磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)可以作为冠状动脉疾病标记单独使用或可以与已知的能够检测冠状动脉疾病的其他标记组合使用。
本发明中待确定的磷脂酰肌醇是在极性基团具有肌醇的酸性磷脂并且也被简称为缩写PI。存在在位置1和2处具有不同脂肪酸组合的各种分子种类。例如，注释磷脂酰肌醇(38:4)用于如下情况：其中酯型键合脂肪酸基于从通过质量分析的磷脂酰肌醇分子种类的分析的结果中假定的分子量估计在位置1和2处具有总计38个碳原子和总计4个双键。
如基于从通过质量分析的分析结果中假定的分子量所估计的，本发明中待确定的磷脂酰肌醇在位置1和2处具有酯型键合脂肪酸(其中碳原子数目总计为36个并且双键数目总计为5个)，并且因此其为磷脂酰肌醇(36:5)(磷脂酰肌醇在位置sn-1、2处具有脂肪酸残基，其中碳原子数目总计为36个并且双键数目总计为5个)。
图1示出了本发明中待确定的磷脂酰肌醇(36:5)的实例。
本发明中待确定的溶血磷脂酰肌醇是在极性基团具有肌醇的酸性磷脂并且也被简称为缩写LPI。存在具有不同脂肪酸含量的各种分子种类。例如，注释溶血磷脂酰肌醇(18:1)用于如下情况：其中酯型键合脂肪酸基于从通过质量分析的溶血磷脂酰肌醇分子种类的分析的结果中假定的分子量估计具有总计18个碳原子和总计1个双键。
如基于从通过质量分析的分析结果中假定的分子量所估计的，本发明中待确定的溶血磷脂酰肌醇具有酯型键合脂肪酸(其中碳原子数目总计为20个并且双键数目总计为5个)，并且因此其为溶血磷脂酰肌醇(20:5)(溶血磷脂酰肌醇具有脂肪酸残基，其中碳原子数目总计为20个并且双键数目总计为5个)。
图2示出了本发明中待确定的溶血磷脂酰肌醇(20:5)的实例。
用于确定磷脂酰肌醇和溶血磷脂酰肌醇的量的方法的实例是质量分析和免疫测定。
例如，可以参阅如下实例以及Journal ofSeparation Science[分离科学杂志]，2012，第35卷，第1845-1853页或Analytical Biochemistry[分析生物化学]，2008，第375卷，第124-131页进行质量分析。
免疫测定可以是常规的免疫测定。常规免疫测定的实例是ELISA、RIA和蛋白质印迹。
免疫测定使用的抗体的类型、衍生物和种类没有特别限制，只要所述抗体具有与磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)特异性结合的能力。可以使用单克隆抗体和多克隆抗体，但优选单克隆抗体。
抗体可以通过常规方法使用磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为免疫原制备。磷脂酰肌醇(36:5)和溶血磷脂酰肌醇(20:5)是低分子量化合物，并且当作为免疫原单独使用时，抗体的产生可能是困难的。因此，优选制备具有载体蛋白的化合物。通常，接种免疫原的哺乳动物是兔、山羊、绵羊、大鼠等。免疫可以通过常规方法进行，例如通过静脉、皮内、皮下或腹腔内向哺乳动物施用免疫原。免疫后，从哺乳动物收集抗血清并制备多克隆抗体，或收集浆细胞(免疫细胞)，并通过例如“Molecular and Cellular Biology BasicExperimental Methods[分子和细胞生物学基本实验方法]”(Nanedo出版社，TakekazuHorie等人，1994)中描述方法制备单克隆抗体。
抗体可以通过可被检测和定量确定的标签进行标记。放射性和荧光是已知的标记，并且可以适当选择。例如，生物素化的抗体可以容易地检测出。
根据本发明的检测冠状动脉疾病的方法，从受试者获得的测试样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量与参考值比较，并且当该量小于参考值时，该测试样品被筛查为源自患有冠状动脉疾病的人的样品。
术语“参考值”被定义例如源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量。对照样品中的量优选是多个样品的平均值。对照样品中的量可以与测试样品同时测定，或者可以通过预先测定来设定截止值。
源自患有冠状动脉疾病的人的样品中的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)比源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品中的磷脂酰肌醇或溶血磷脂酰肌醇要少得多。因此，在本发明的用于检测冠状动脉疾病的方法中，当测试样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量或基于磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的计算值显著小于上文提及的“对照样品”的量，或小于预设的截止值，就可以说该测试样品是源自患有冠状动脉疾病的人的样品的可能性很大。
注意，在本发明中的“截止值”被定义为区别患有冠状动脉疾病的人和未患有冠状动脉疾病的人，通过比较通过上述提及的方法获得的用于检测冠状动脉疾病的磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的值，或基于磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的计算值。尽管用于设定截止值的方法没有特别的限制，但是截止值可以使用如以下实例中的ROC曲线来设定。
当使用截止值检测冠状动脉疾病时，截止值根据确定标记的方法的改变而变化。因此，优选在确定未患冠状动脉疾病和患有冠状动脉疾病的确定值之前预先设定靶标记、截止值并且根据截止值进行测定。根据本发明的实例，当使用受试者的血清确定标记时，可以通过参阅本发明的实例中获得的数字检测冠状动脉疾病。
注意当2或多个确定值，例如比较测试样品的值和对照样品的值，该比较可以使用一个或多个统计分析(如t-检验、Welch t-检验、Wilcoxon秩和检验、方差分析(ANOVA)、递归分解或随机森林)。
本发明提供了用于检测冠状动脉疾病的试剂盒，其包含磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)。本发明进一步提供一种试剂盒，其特征在于含有特异性识别磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的抗体。这些试剂盒可以用于本发明的用于检测冠状动脉疾病的方法中。
此外，这些试剂盒通常进一步包含一种或多种测定必需的结构元件。所述结构元件可以是参考标准、试剂(稀释剂、缓冲液等)、容器和/或装置。
此外，本发明使得治疗通过上述提及的方法用磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)诊断确诊患有冠状动脉疾病的人成为可能。具体而言，本发明是治疗冠状动脉疾病的方法，该方法包括
检测冠状动脉疾病的步骤，其中在上述提及的用于检测冠状动脉疾病的方法中，测试样品中的量小于源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品的量的事实被用作指示该测试样品源自患有冠状动脉疾病的人的指标，以及
通过一种或多种选自由以下组成的组的治疗来治疗已检测出冠状动脉疾病的受试者的步骤：药物疗法、手术、运动疗法和饮食疗法。
即，本发明包括通过以下方式用于治疗患有冠状动脉疾病的人的方法：
(a)确定源自受试者的测试样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)浓度，
(b)使用该确定值作为指标来检测冠状动脉疾病，该指标指示该样品源自患有冠状动脉疾病的人，以及
(c)通过一种或多种选自由以下组成的组治疗来治疗已检测出冠状动脉疾病的受试者：药物疗法、手术、运动疗法和饮食疗法。
药物疗法的实例为硝酸药物、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、抗血小板药物(阿司匹林等)和降胆固醇药物。
手术的实例为冠状动脉旁路移植术(CABG)、气囊血管成形术和支架植入。
本发明现在将进一步详细地并且更具体地使用实例来描述，但本发明并不限于这些实例。
实例1
使用外周血中磷脂酰肌醇(36:5)作为分子标记来诊断冠状动脉疾病
为了研究磷脂酰肌醇(36:5)作为冠状动脉疾病的新颖标记的性能，比较了对照组中的20个人和冠状动脉疾病组中的20个人的血浆中的磷脂酰肌醇(36:5)浓度。
受试者为冠状动脉疾病患者，并且使用源自Proteogenex提供的患者的血浆样品。对照组为未患有冠状动脉疾病的成年人。在获得伦理研究审查委员会批准之后使用Shionogi&Company(Shionogi公司)的人体组织和基因进行实验。取得书面同意后收集血液,并且在-80℃等分冻存。
通过液相色谱串联质谱分析(在下文中为LC/MS/MS)来定量确定受试者外周血中磷脂酰肌醇(36:5)浓度。
诸位发明人用于测定外周血中磷脂酰肌醇(36:5)浓度的特定LC/MS/MS系统描述如下。
添加内标准溶液至来源于每个受试者的血浆中之后，添加有机溶剂，并进行脱蛋白处理，将产物搅拌并离心，并回收上清液。上清液用氮气干燥，然后用有机溶剂复溶。通过LC/MS/MS，使用复溶溶液作为测定溶液定量确定血液中的磷脂酰肌醇(36:5)。使用Nexera(Shimadzu Corporation[日本岛津制作所])-AP15000(AB SCIEX)作为LC/MS/MS系统。在逆相条件下分离和洗脱血液成分，然后通过在负离子模式和MRM(多反应监测)电喷射离子化进行检测。通过分析师(AB SCIEX)分析磷脂酰肌醇(36:5)的峰面积和内标准，并计算面积比。使用通过将每个受试者的峰面积比除以对照组的峰面积比的平均值获得的值作为相对值定量确定血浆中的磷脂酰肌醇(36:5)。
图3总结了对照组和冠状动脉疾病组的血浆中磷脂酰肌醇(36:5)的量的相对值。对照组的血浆中的磷脂酰肌醇(36:5)的相对值为100。
冠状动脉疾病组的磷脂酰肌醇(36:5)浓度比对照组的磷脂酰肌醇浓度低约79％，并且观察到显著差异(P<0.0001)。
实例2
图4总结了实例1中获得的结果的ROC分析结果。曲线下面积(AUC)是0.963。
根据图4的结果，当使用磷脂酰肌醇(36:5)浓度的相对值诊断出冠状动脉疾病时截止值为43％，并且浓度为截止值或低于截止值可被诊断为可能的冠状动脉疾病。
实例3
使用外周血中溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为分子标记来诊断冠状动脉疾病
为了研究溶血磷脂酰肌醇(20:5)作为冠状动脉疾病的新颖标记的性能，通过如实例1的相同方法比较了对照组中的20个人和冠状动脉疾病组中的20个人的血浆中的溶血磷脂酰肌醇(20:5)浓度。
图5总结了对照组和冠状动脉疾病组的血浆中溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的相对值。对照组的血浆中的溶血磷脂酰肌醇(20:5)的相对值为100。
冠状动脉疾病组的溶血磷脂酰肌醇(20:5)浓度比对照组的溶血磷脂酰肌醇浓度低约69％，并且观察到显著差异(P<0.0001)。
实例4
图6总结了实例3中获得的结果的ROC分析结果。曲线下面积(AUC)是0.897。
根据图6的结果，当使用溶血磷脂酰肌醇(20:5)浓度的相对值诊断出冠状动脉疾病时截止值为44％，并且浓度为截止值或低于截止值可被诊断为可能的冠状动脉疾病。
如上所述确认了磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)能在外周血中定量确定，并且可以被用作用于冠状动脉病的分子标记。
工业实用性
本发明可用于制药领域，特别是冠状动脉疾病的体外诊断的制药领域。
Claims (6)
1.一种用于检测冠状动脉疾病的方法，该方法包括确定源自受试者的测试样品中磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)的量的步骤，其中该确定值被用作指示该样品源自患有冠状动脉疾病的人的指标。
2.如权利要求1所述的方法，其中该确定值小于参考值的事实被用作指示该测试样品是源自患有冠状动脉疾病的人的样品的指标。
3.如权利要求2所述的方法，其中该参考值是源自未患冠状动脉疾病的人的对照样品中的量。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该测试样品是血液。
5.一种用于检测冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包含磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)。
6.一种用于检测冠状动脉疾病的标记，该标记由磷脂酰肌醇(36:5)或溶血磷脂酰肌醇(20:5)组成。
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