CN108473530A - 从血浆中提取蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

从血浆产生包括α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其它蛋白质的蛋白质产品的方法包括以下步骤：(1)向血液产品中加入盐产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11‑13％；(2)分离所述第一中间产物产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向所述第一中间产物中加入盐制备第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的21‑23％；(4)分离所述第二中间产物产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；和(6)通过离子交换色谱分离所述第三中间产物产生含有蛋白质产品的洗脱液。本发明的方法有利于简单并且以高产率生产α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其他蛋白质。

Description

从血浆中提取蛋白质的方法
技术领域
本发明的领域为用于提高α-1-蛋白酶抑制剂(也称为α-1抗胰蛋白酶)或其他蛋白质产品的纯度和产量的改进方法。
背景技术
以下背景技术讨论包括可能有助于理解本发明的信息，并非承认本申请提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示引用的出版物是现有技术。
Shanbrom的美国专利第7,297,716号公开了从冷沉淀中分离血液产品(例如，纤维蛋白胶)的方法。Shanbrom的方法使用盐来增加冷沉淀的收率。例如，将重量分数为2-10％的柠檬酸钠加入血液或血浆中。在此浓度下的柠檬酸钠可以灭活和/或抑制致病微生物，防止细胞和蛋白质变性，增加冷沉淀的收率(即使不冷冻)，并有助于去除变性组分。Shanbrom考虑从冷沉淀中分离各种凝血因子，包括纤维蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和血小板。然而，Shanbrom未能认识到盐可以被添加到预先冷冻的血液产品中，达到11％(重量)以上的浓度。此外，Shanbrom也不了解可以从任何上清液中提取蛋白质产品，其中就包括由具有11-13％(重量)和21-23％(重量)盐的中间产物形成的上清液。
一种蛋白质产品是α-1-蛋白酶抑制剂(“A1PI”)。A1PI是蛋白酶抑制剂的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的52kDa糖蛋白。通常，A1PI可以保护组织，如肺的弹性组织免受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的伤害，特别是在炎症部位。A1PI的遗传缺陷可导致肺气肿、慢性阻塞性肺病和肝硬化。如果对A1PI缺陷不进行治疗，可能会引起损伤，而施用A1PI则可以预防这些损伤。
Coan的美国专利4,697,003公开了一种从血浆蛋白质水溶液中分离A1PI的方法。Coan的方法建立在Cohn乙醇分馏技术上，该技术包括解冻新鲜冷冻血浆、去除沉淀物，并且将乙醇分五个阶段添加至浓度约40％。Coan方法的第一步是对Cohn液II+III、液I或冷上清液进行脱盐处理。接着，将脱盐溶液与阴离子交换树脂接触，并且A1PI选择性地结合到树脂上。用淋洗液将A1PI置换至洗脱液。最后，从洗脱液中回收A1PI。然而，乙醇和其他醇可能会产生问题，因为它们容易使期望的蛋白质变性，如A1PI。
Kumpalume等人的美国专利第8,580,931号还公开了分离A1PI的方法，其包括将A+1上清液经历两个金属螯合层析步骤。借用Kistler Nitschmann工艺的术语，A+1上清液为沉淀物A和组分1的组合。然而，A+1上清液的制备还包括加入17-21％(v/v)的乙醇，其可以使如上所述的蛋白质变性。也可参见Thierry的专利DE3874376。
在美国专利第7,879,331号、第7,879,332号和第8,293,242号中，发明人构想了一种盐析工艺，可在从血液产品中提取蛋白质产品时不使用乙醇。
在本发明的主题中，发明人发现了简化的方法：在盐沉淀步骤之前不需要将冷沉淀与去冷沉淀血浆分离。另外，在第一糊沉淀和第二糊沉淀中保留很少蛋白质产品的情况下，可以不用重新溶解糊沉淀并进行进一步的纯化而保持较高的蛋白质产品收率。至于A1PI，发明人发现在22％(重量)的盐浓度下有非常少的A1PI沉淀。鉴于文献教导了A1PI在较高的盐浓度下沉淀，这个结果令人惊讶。由于糊沉淀中很少有A1PI损失，所以可以从第二上清液中获得高收率。因此，工艺可通过除去糊沉淀处理步骤进行改进。
将第二上清液施加到亲和柱上可以进行最低限度的预处理(例如生物负载过滤、溶剂/洗涤剂处理、渗滤)，进一步简化蛋白质产品的分离。另一方面，考虑在亲和柱的上游或下游加入内毒素去除步骤。考虑的内毒素去除步骤包括用多粘菌素B或其它亲和介质(例如树脂或膜)处理。
本文讨论的这些和所有其他外部资料通过引用并入本文。在并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文所提供的该术语的定义不一致或相悖的情况下，在本文中提供的该术语的定义适用，而参考文献中该术语的定义不适用。
除非上下文指出相反的情况，否则本文阐述的所有范围应被解释为包括它们的端点，并且开放式范围应被解释为包括商业上可行的值。同样，除非上下文指出相反的情况，否则所有值列表均应视为包含中间值。
发明内容
本发明主题提供了可以从包含血浆的血液产品生产蛋白质产品的方法。优选的方法包括以下步骤：(1)向血液产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占该第一中间产物重量的11-20％，(2)分离该第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向该第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占该第二中间产物重量的15-30％；(4)分离该第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过亲和层析从该第二上清液分离第三中间产物；以及(6)通过离子交换色谱分离该第三中间产物以产生含有蛋白质产品的洗脱液。
关于包含血浆的血液产品，本发明人考虑原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆或回输血浆中的任何一种可用于符合本发明主题的方法中。应当理解，尽管本文所述的方法不一定需要将冷冻的含有血浆的产品作为起始材料，但常规的含血浆产品通常是冷冻的，并且在进一步加工或纯化之前通常需要进行解冻。
关于添加到血液产品中的盐，可以使用的盐范围很广，包括例如(但不限于)柠檬酸盐、乙酸盐和/或葡萄糖酸盐。合适的盐是水溶性的。尽管优选使用水溶性盐，但不排除使用非水溶性盐(例如柠檬酸钙或其它在水中溶解度低的盐)与改善不溶性盐的溶解度的螯合剂(例如EDTA)。通常，盐含量为10.1-25％(重量)的第一中间产物形成第一沉淀物和第一上清液；更通常地，盐含量为10.1-11％、11-13％、13-15％和15-20％(重量)。有时，可以通过将pH调节至3-10范围内的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃范围内的特定值来改善蛋白质分离。
应当理解，可通过离心或过滤来分离第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀。当使用离心时，第一沉淀物形成沉淀球(即第一糊沉淀)，第一上清液可以从中倾出、移除或除去。在更大规模的工艺下，过滤优于离心。当使用过滤时，第一上清液为滤液并且第一沉淀物形成滤饼(即第一糊沉淀)。
关于第二上清液，通常考虑盐含量为15-30％(重量)，更通常为15-21％、21-23％、23-25％、25-27％和27-30％(重量)。由于盐被加入到第一上清液中，第二中间产物的盐含量将大于第一中间产物的盐含量。通过将pH调节至3-10的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃的特定值可以改善蛋白质分离。在分离第一上清液和第一沉淀物时的考虑因素同样适用于第二上清液与第二沉淀物的分离。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，在将第二上清液进行亲和层析之前，可以对第二上清液进行过滤以去除生物负载，用溶剂和洗涤剂处理以灭活第二上清液中的包膜病毒，和/或进行脱盐处理(例如通过渗滤和/或超滤)。如本文所用，渗滤意指用于交换含蛋白质产品的溶液/缓冲液的过滤。如本文所用，超滤是浓缩蛋白质产品溶液的过滤过程。对于渗滤和超滤，垂直和切向流型均可考虑。渗滤和/或超滤可较好地除去盐和低分子量物质。
在另一个示例性实施方案中，在通过亲和层析从第二上清液分离第三中间产物的步骤中使用合适的亲和树脂。亲和树脂可以从诸如Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GEHealthcare Life Sciences、Thermo Fisher Scientific、Merck Millipore、GenScript和ProMetic Life Sciences等供应商处购买。
在制备A1PI时，例如，使用A1PI特异性亲和树脂来制备含有A1PI的第三中间产物。类似地，可以使用白蛋白特异性亲和树脂从第二上清液中分离白蛋白。因此，显而易见的是，可以将第二上清液连续用于多种亲和层析柱以提取不同的蛋白质。例如，A1PI制备中的亲和层析步骤产生流穿液和洗涤液。流穿液和/或洗涤液可以用于白蛋白特异性亲和柱。然后可以将来自白蛋白特异性亲和柱的流穿液和/或洗涤液用于特异于相同或不同蛋白质的第三亲和柱。
为了从蛋白质产品中除去其他病毒，可以将洗脱液无菌过滤。根据本发明主题的方法特别适用于制备蛋白质产品，包括A1PI、γ-球蛋白、白蛋白和/或其他蛋白质。
在其他方面，本发明的方法可以进一步包括从第一糊沉淀或第二糊沉淀中分离第二蛋白质产品。另外，第二蛋白质产品可以从在亲和层析过程中产生的流穿液和/或洗涤液中分离。因此，显而易见的是，第二蛋白质产品可以不同于第一蛋白质产品，并且可以包含A1PI、γ-球蛋白、白蛋白和/或其他蛋白质。
在本发明主题的又一方面，产生γ-球蛋白的方法可以进一步包括从第二糊沉淀中分离γ-球蛋白。
本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将从以下对优选实施例的详细描述以及附图中变得更加明显，附图中相同的附图标记表示相同的部件。
附图说明
图1是由血液产品生产蛋白质产品的方法的示意图。
图2是由血液产品生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
具体实施方式
本发明主题提供了从含血浆产品中高产量生产蛋白质产品的改进方法。血浆含有许多可作为有用的治疗剂的蛋白质和凝血因子。例如，A1PI缺陷可能会导致肺组织破裂，而A1PI则可用于治疗A1PI缺陷。另一类血浆蛋白是γ-球蛋白，可用于治疗免疫缺陷和疾病。白蛋白和其他蛋白质(例如纤维蛋白原、凝血酶原、α-1-酸性糖蛋白、α-1-甲胎蛋白、α-2-巨球蛋白、β-2-微球蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体成分3、补体成分4、C-反应蛋白、转铁蛋白、甘露糖结合凝集素等)也可以通过根据本发明主题的方法从血浆中分离。
在优选的实施方案中，含血浆的产品包含回收血浆或回输血浆，更优选新鲜冷冻血浆，甚至更优选原料血浆。应当理解，含血浆的产品通常以冷冻状态储存和运输，并在进一步加工或纯化之前解冻。在解冻过程中，血浆可能会分离成冷沉淀和去冷沉淀血浆(“去冷”血浆)。如本文所用，“去冷”血浆是指由融化冷冻血浆产生的、并且不包含冷沉淀的液体上清液。优选地，全血浆即去冷沉淀血浆和冷沉淀都经过进一步的处理步骤，尽管在随后的处理步骤中不排除仅使用去冷沉淀血浆。任选地，在蛋白质产品生产之前，可以将冷沉淀重新掺入(例如通过混合)去冷沉淀血浆中，或将其作为蛋白质产品生产的一部分。
实施例1.制备用于分离的人血浆
通过使冷冻的人血浆(7L；28个0.25L袋)在2-8℃在冰箱中解冻24-48小时来制备示例性的含血浆的产品。袋子用无菌酒精进行喷雾，然后切割每个袋子的顶部，并将内容物倒入干净的配衡容器中。记录容器的总重量。将顶置式搅拌器安装在容器上，在20℃以312rpm搅拌血浆60分钟。采集血浆样品以测定其重量和密度。将所得含血浆产品用于制备第一中间产物，如下面实施例3中所述。
在图1中，示出了本发明主题的一个实施例的流程图。将新鲜或解冻的含血浆的产品和盐混合，形成第一中间产物，其通常加入的盐为10-25％(重量)，更通常为10-11％、11-13％、13-15％和15-2％(重量)，优选11-13％(重量)，更优选12％(重量)。用于本发明方法的合适的盐包括但不限于柠檬酸盐、乙酸盐和葡萄糖酸盐。尽管可以将固体盐加入血浆产品中，但在优选的方法中将盐溶液加入血浆产品中。根据所需的蛋白质产品，盐溶液的pH可以从约pH 3调节至pH 8以优化蛋白质分离。
实施例2.制备50％柠檬酸盐储备溶液
通过将500g柠檬酸溶于600mL纯化水(例如注射用水，WFI)中，搅拌30-60分钟直至溶解以制备50％柠檬酸溶液。加入纯化水将溶液体积调节至1000mL。将500g柠檬酸钠加入到600mL搅动的纯化水中并搅拌30-60分钟直至溶解以制备50％柠檬酸钠溶液。在测量柠檬酸钠溶液的pH值时，将柠檬酸溶液缓慢加入到搅动的柠檬酸钠溶液中直至获得pH 7.0±0.02。在搅拌下将纯化水加入已调节pH的柠檬酸钠溶液中以稀释溶液至1000mL。该溶液以下称为FS。
血浆、中间产物和上清液可以在溶液的冰点和环境温度之间的温度下处理，通常为0-25℃。在一个实施方案中，将血浆产品维持在20℃，并将室温下的柠檬酸/柠檬酸盐溶液(例如FS)加入血浆直至柠檬酸/柠檬酸盐占由此获得的第一中间产物重量的11-13％，优选12％。加入盐将使第一中间产物分离成第一沉淀物和第一上清液。在另一个实施方案中，将第一中间产物搅拌并冷却至2-8℃，产生沉淀。第一沉淀物含有高分子量蛋白质和大部分脂质。优选地，对第一中间产物搅拌直至沉淀完全(通常60分钟或更长时间)。
实施例3.生成第一中间产物：含人血浆产品的柠檬酸盐沉淀(12％)
将容器和来自实施例1的含血浆产品冷却至4±3℃。使用下式计算来自实施例2的FS要加入的量：FS的体积(mL)＝315.8×w/d，其中w＝总血浆重量(对实施例1中去除的样品校正)，d是来自实施例1的样品密度。在5-10分钟内，将所需体积的FS分配并缓慢加入到冷却的、温和搅动的混合血浆中，产生第一中间产物。除去搅拌器，并记录容器及其内容物的重量。将容器内容物搅拌60分钟，保持容器内容物的温度为2-8℃。如上所述，可以通过离心或过滤将第一上清液和第一沉淀物分离成第一上清液和第一糊沉淀。
实施例4.分离第一中间产物
将预先冷冻的离心瓶配衡，并用容器内容物填充，直到转移所有容器内容物。每个冷冻离心瓶以4200rpm离心60分钟。将第一上清液从每个离心瓶中轻轻倒入干净的配衡10L瓶中。重复这一过程，直到处理完所有离心瓶。测定每个离心瓶的重量，以便计算残余材料(一种或多种)的总重量(第一糊沉淀，Paste1)。将第一糊沉淀从每个瓶转移到5L瓶。每个离心瓶用50mM Tris·HCl pH 7.40缓冲液冲洗，总共使用1L缓冲液。保留第一糊沉淀，可进行进一步处理。取少量上清液以确定其密度。通过称量10L瓶并计算第一上清液(“Super1”)的重量来确定第一上清液的重量。
在一个示例性实施方案中，将第一上清液冷却至2-8℃，向第一上清液中另外加入柠檬酸/柠檬酸盐溶液，产生第二中间产物，其包含15-21％、21-23％、23-25％、25-27％和27-30％(重量)的柠檬酸/柠檬酸盐，优选21-23％(重量)，并且更优选22％(重量)。除了柠檬酸/柠檬酸盐，也考虑使用盐/缓冲液组合。本领域普通技术人员应了解，第二中间产物中盐的浓度大于第一中间产物中盐的浓度。优选地，对第二中间产物搅拌直至第二沉淀物沉淀完全，例如搅拌过夜。免疫球蛋白可在第二沉淀物中发现。
实施例5.生成第二中间产物：第一上清液的柠檬酸盐沉淀(22％)
将来自实施例4的含有第一上清液的10L瓶冷却，使内容物处于2-8℃的温度范围内。使用公式计算FS(来自实施例2)的量：FS的体积(mL)＝410×w/d，其中w＝上清液的重量且d是其密度，两者均来自实施例4。将计得的FS量加入到温和搅拌的冷冻第一上清液中，产生第二中间产物。将所得的第二中间产物培养至少1小时，保持容器内容物的温度为2-8℃。
同第一中间产物，可以通过离心和/或过滤将第二中间产物分离成第二上清液和第二糊沉淀。当使用离心时，第二糊沉淀是由第二沉淀物形成的沉淀球，第二上清液可以从中倾出、移除或除去。当使用过滤时，第二糊沉淀是由第二沉淀物形成的滤饼，第二上清液是滤液。
实施例6.分离第二中间产物
将预先冷冻的离心瓶配衡，并且每个都用第二中间产物填充，直到转移所有的第二中间产物。每个冷冻离心瓶以4200rpm离心60分钟。将第二上清液从每个离心瓶中轻轻倒入干净的配衡10L瓶中。重复这一过程，直到处理完所有离心瓶。测定每个离心瓶的重量以确定残余物质(一种或多种)的总重量(第二糊沉淀，Paste2)。将第二糊沉淀从每个瓶转移到5L瓶。每个离心瓶用50mM Tris·HCl0.15M NaCl pH 7.40缓冲液冲洗，总共使用2L缓冲液。保留第二糊沉淀，可进行进一步处理。取少量第二上清液样品以确定其密度。通过称量10L瓶并计算第二上清液(“Super2”)的重量来确定第二上清液的重量。
任选地，如图2所示，可使用减少生物负载过滤器过滤第二上清液以去除细菌、真菌孢子、菌丝和其他“生物负载”。示例性的减少生物负载过滤器包括Sartorius、Pall和EMDMillipore品牌生产的过滤器(例如，Sartopore 2XLG 0.8/0.2、Supra EK1P/EAV1.5/0.2、LifegardTM、 等)。
实施例7.减少生物负载
通过过滤器Sartopore 2XLG过滤来自实施例6的第二上清液，其中过滤表面积0.021m、孔径0.2μm。采用泵确保过滤器的压力不超过15psi。将滤液收集在配衡的20LHyclone袋中。记录滤液的重量。
另一个可选步骤是通过渗滤/超滤(UF/DF)降低柠檬酸盐浓度。可以选择过滤器的尺寸以使流速最大化(例如，3-6L/h)，同时防止目标蛋白质随滤液一起流过过滤器。例如，30kD膜保留A1PI，但允许液体相对快速地流过膜。柠檬酸盐浓度的降低可以与电导率降低相关，电导率从约55-60mS/cm降低至约10mS/cm，并且最优选降低至5mS/cm或更低。
实施例8.第一UF/DF处理
对来自实施例7的滤液采用UF/DF处理来减少体积并除去低分子量溶质。使用Sartorius盒(PESU-30kDa，膜表面积0.1m2)。组装UF/DF系统并记录系统的滞留体积。采用约为32的进料体积/膜面积比和24mL/min的流速。使用WFI进行渗滤(电导率低于10mS/cm)，保持入口压力为15-20psi，滞留物压力为0-5psi。继续渗滤直至达到滞留物的目标电导率，然后将滞留物浓缩至1个滞留体积。UF/DF系统用1个体积的WFI冲洗。将滞留物和洗液合并(“渗余物1”)。测定渗滤池的重量，并去除样品通过比浊法确定A1PI的浓度。
可以通过使病毒包膜脂质变性来实现对包膜病毒的灭活。例如，可以使用溶剂/洗涤剂(例如磷酸三正丁酯和聚山梨酯80、磷酸三正丁酯和TritonTMX-100或磷酸三正丁酯和洗涤剂)来处理第二上清液。采用溶剂/洗涤剂处理也可以较好地杀死细菌和真菌污染物并洗去内毒素。在本发明主题的优选实施方案中，将13.2g的23.09:76.91的磷酸三正丁酯和聚山梨酯80的混合物加入到每千克的第二上清液中。
实施例9.溶剂洗涤剂处理
采用溶剂洗涤剂处理来自实施例8的减少生物负载的渗余物1进行病毒灭活。使用WFI制备10％和3％磷酸三正丁酯的溶剂洗涤剂储备溶液。将渗余物1(kg)的重量乘以13.2来计算溶剂洗涤剂储备溶液的用量(g)。将溶剂洗涤剂储备溶液按计算量逐渐加入渗余物1中。将溶液在22-29℃下培养6-10小时。
发明人预期可以使用亲和树脂来分离蛋白质产品的各个组分。例如，ProMeticBioSciences Ltd.和ProMetic BioTherapeutics生产的亲和树脂可特异性结合凝血因子、血纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白、A1PI。GE Healthcare生产的交联琼脂糖树脂含有结合A1PI的单结构域抗体。所需树脂的用量取决于第二上清液中蛋白质的量和树脂的负载量。通常在施加第二上清液之后，用盐溶液(例如100mM NaCl)洗涤亲和树脂，所述盐溶液通过非特异性静电作用去除吸附到树脂上的蛋白质。然后使用树脂制造商推荐的洗脱液从亲和柱上洗脱所需的蛋白质，但不排除使用其他洗脱方案。至于A1PI和GEHealthcare树脂，可以使用氯化镁缓冲溶液(例如2M MgCl2在50mM Tris·HCl中，pH7.40)将蛋白质产品从亲和层析柱洗脱。亲和层析步骤后，通常蛋白质产品收率介于70％至98％之间。
实施例10.A1PI亲和层析
对来自实施例9的经溶剂洗涤剂处理的渗余物1进行A1PI亲和层析。根据制造商的说明使用和制备GEα-1抗胰蛋白酶选择树脂。将树脂填充到～30cm床高(～590mL柱体积)的GE HiScale 50/40柱中。将来自实施例9的全部体积的渗余物1装载到柱子上，并且以167cm3/h的操作流速进行纯化。使用pH7.4的50mMTris·HCl缓冲液以该流速平衡柱子，直到洗脱液的电导率稳定和A280达基线(约三柱体积)。使用样品泵以42cm/h的流速装载来自实施例9的渗余物1。在装载操作期间收集流穿液。装载完成后，继续用pH 7.4的50mMTris·HCl缓冲液以167cm/h的流速洗脱，直至洗脱液在基线显示A280。然后开始对pH7.4的15％1M NaCl/Tris·HCl缓冲液和pH7.4的85％50mM Tris·HCl缓冲液进行台阶梯度变化。通过该梯度步骤，收集盐洗脱峰馏分，直至A280回到基线。将流动相逐步回到pH7.4的100％Tris·HCl缓冲液中，并继续用Tris·HCl缓冲液洗涤柱子直到A280峰返回到基线、电导率回到基线。一旦电导率回到基线，将流量转换为由2M MgCl2，50mM Tris·HCl缓冲液(pH 7.4)组成的洗脱缓冲液。从A280峰开始收集洗脱液即第三中间产物，直到A280峰返回基线。记录第三中间产物的体积，并将流动相转换为50mM Tris·HCl缓冲液，pH7.4。随后通过用3个柱体积的100mM硫代甘油溶液洗脱，进行柱子原位清洗(CIP)。
取每次洗涤样品和第三中间产物，并通过比浊法测定其中A1PI的浓度。
实施例11.使用二硫苏糖醇进行巯基还原
用二硫苏糖醇(DTT)处理第三中间产物以将A1PI二聚体还原成单体。称取超过在MgCl2柱洗脱液中A1PI的计算值5摩尔的足够的DTT。在20-25℃将固体DTT加入搅动的洗脱液(温和涡旋)中，并继续搅拌1小时。在进一步处理之前，溶液在2-8℃保持过夜。
通常将第三中间产物进行渗滤/超滤以降低盐浓度。渗滤/超滤后，电导率从约120mS/cm降至低于10mS/cm，并且优选5mS/cm或更低。
实施例12.第二UF/DF处理
对来自实施例11的第三中间产物进行UF/DF处理以减少体积并除去低分子量溶质。使用的过滤器是膜表面积为0.1m2的Sartorius盒(PESU-30kDa)。操作流速为900mL/分钟。使用两种渗滤缓冲液，50mM Tris·HCl缓冲液(pH7.4)和半胱氨酸溶于Tris·HCl中的缓冲液(pH 7.4)。后者通过将50g半胱氨酸溶解在10μL50mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.4中来制备。组装UF/DF系统之后，记录来自实施例9的溶液的初始电导率。使用两个渗滤体积的Tris·HCl缓冲液，然后用含半胱氨酸的Tris·HCl缓冲液以恒定体积开始透滤，直到观察到电导率小于10mS/cm。收集滞留物，并用含半胱氨酸的Tris·HCl缓冲液冲洗UF/DF系统。将滞留物和洗液合并(“渗余物2”)。
本发明人期望在离子交换层析步骤之后，从树脂析出至第三中间产物的亲和配体可以与蛋白质产品分离。合适的树脂由Bio-Rad、Sigma-Aldrich和Asahi Chemical&Industrial Co.Ltd.提供(例如，Asahi Q500阴离子交换树脂显示每毫升树脂具有26.5mgA1PI的动态结合能力)。在预期的方法中，将500mL Q500树脂柱与50mM Tris·HCl(pH7.40)平衡。将第三中间产物装载到柱子上并进行梯度洗脱：NaCl在50mM Tris·HCl(pH7.40)缓冲液中从0mM至350mM。含血浆的血液产品起始体积约为10升时，可以产生洗脱液的体积约1升。
实施例13.阴离子交换层析
对来自实施例12的渗余物2使用阴离子交换层析进行A1PI的最终纯化。使用Cellufine Q500树脂，在GE HiScale 50/40柱(标称500mL床体积)中使用25cm的床高度。以240cm/h通过3个柱体积的2M NaCl溶液，然后以240cm/h通过3个柱体积WFI对柱子进行调节。然后使用至少3个柱体积的50mM Tris·HCl，pH7.4缓冲液平衡柱子，直到获得稳定的A280和电导率基线。此时，将来自实施例12的渗余物2装载到柱子上。渗余物进料瓶用100mL50mM Tris·HCl缓冲液(pH7.4)冲洗，冲洗液也上载到柱子上。在装载操作期间收集流穿液。将流动相转换为pH 7.4的50mM Tris·HCl缓冲液，继续对柱子进行洗涤，直至获得稳定的A280基线。然后，进行梯度洗脱：35％1M NaCl，50mM Tris·HCl缓冲液(pH7.4)/65％50mMTris·HCl缓冲液(pH7.4)。当A280开始增加时开始收集盐峰，当A280峰恢复到稳定基线时停止收集。随后，进行梯度洗脱并收集样品：100％1M NaCl，50mM Tris·HCl缓冲液(pH7.4)。由35％1M NaCl/65％Tris·HCl缓冲液梯度洗脱得到的洗脱液含有全部A1PI。梯度100％1MNaCl去除了其他杂质。
本发明的方法可以进一步包括使用20nm孔隙过滤器的无菌过滤步骤去除小的无包膜病毒(例如腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、人乳头瘤病毒)。然后根据所需的制剂可以进一步处理经无菌过滤的蛋白质产品。其他处理步骤包括超滤/渗滤、制剂、无菌过滤、充填和冻干中的一种或多种。
实施例14病毒后过滤
用30mL 50mM Tris·HCl缓冲液(pH 7.4洗涤)Planova 75NZ预过滤器和Planova20N过滤器。将来自实施例13的含有A1PI的洗脱液依次通过预滤器，然后通过20N滤器。
实施例15第三UF/DF处理
对来自实施例14的滤液进行UF/DF处理以减少体积并除去低分子量溶质。使用的过滤器是具有0.018m2膜表面积的Hydrosart盒(Sartocon slice 20)。操作流速为54mL/分钟。渗滤缓冲液是20mM Tris·HCl缓冲液，150mM NaCl(pH 7.4)。组装UF/DF系统后，系统用1M NaOH以54mL/分钟的流速清洗20-30分钟。用20mM Tris·HCl缓冲液，150mM NaCl(pH7.4)缓冲液进行渗滤，直到获得15mS/cm的电导率。计算好达到55mg/mL的A1PI浓度所需的体积后，通过比浊法将滞留物池超滤浓缩直至A1PI浓度为55±3mg/mL。然后将滞留物池浓缩至1个滞留体积，移除滞留物并收集。用1个滞留体积的20mM Tris·HCl缓冲液，150mMNaCl(pH7.4)冲洗UF/DF系统。将滞留物和洗液合并(“渗余物3”)。
实施例16无菌过滤
使用无菌管和收集瓶，将渗余物3通过0.22μmMillex GE PES无菌注射器过滤器在层流罩中过滤。无菌过滤产物于-80℃储存。
应当理解，本文中性质、成分(如浓度、反应条件等)的数字表示量在一些情况下被术语“约”修饰，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式。因此在说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是可根据本发明的实施方案中试图获得的期望性质而改变的近似值。数字参数应根据报告的有效位数并应用普通的四舍五入法来解释。尽管阐述本发明的宽范围的数值范围及参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地被报道。然而，任何数值固有地包含由其各自测量中存在的误差而必然导致的某些误差。
如本文中和附加权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”、“该”包括复数个指代物。此外，如本文描述中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
本文对数值范围的描述为速记方法，仅用于指代落入该范围内的每个单独数值。除非本文中另有指示，否则每个单独的值都并入说明书中，如同单独列举一样。本文中描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非在本文中另有指示或者与上下文明显矛盾。关于本文的某些实施例提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，而不是对本发明要求保护的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的任何非要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代元件组或实施例不应被解释为对本发明的限制。每个组件可以单独地或与组中的其他元件或本文中发现的其他元件进行参考和要求保护。出于便利性和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个组员可以被包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书在本文中应当被认为包含由此修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
显而易见的是，对于本领域技术人员而言，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些以外，还可以进行更多的修改。因此，本发明的主题不限于所附权利要求的范围。而且，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应该以与上下文一致的最宽泛可能的方式来解释。具体而言，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他性方式引用元件、组件或步骤，指示所提及的元件、组件或步骤可以存在，或被利用，或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。在说明书权利要求涉及选自A、B、C...和N中的至少一项的情况下，文本应该被解释为只需要来自该组的一个元素，而不是A+N或B+N等等。
本文的讨论提供了本发明主题的许多示例实施例。尽管每个实施例表示发明元件的单个组合，但是本发明主题包括所公开元件的所有可能的组合。因此，如果一个实施例包括元件A、B和C，并且第二实施例包括元件B和D，则本发明主题也包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使没有明确披露。

Claims (23)

1.一种从含血浆产品生产蛋白质产品的方法，所述方法包括：
向含血浆产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11-20％；
分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；
向所述第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的15-30％；
分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；
通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；以及
通过离子交换色谱分离所述第三中间产物以产生含蛋白质产品的洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在将盐加入所述含血浆产品中以产生第一中间产物之前，将所述含血浆产品解冻并搅拌。
3.如权利要求1所述的方法，其中将盐加入所述含血浆产品的步骤包括：加入一定量的第一盐，所述第一盐选自柠檬酸盐、乙酸盐和葡萄糖酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀的步骤包括：离心所述第一中间产物。
5.如权利要求1所述的方法，其中分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀的步骤包括：过滤所述第一中间产物。
6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在分离步骤之前使所述第二上清液脱盐。
7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在通过亲和层析纯化所述第二上清液的步骤之前，灭活所述第二上清液中的任何包膜病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其中使第二上清液中的任何包膜病毒失活的步骤包括：用足以使所述包膜病毒失活的量的溶剂和洗涤剂处理第二上清液。
9.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在通过亲和层析纯化所述第二上清液的步骤之前使所述第二上清液脱盐。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述第二上清液的脱盐步骤包括使用超滤膜过滤所述第二上清液。
11.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：无菌过滤所述洗脱液。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质产品包含α-1-蛋白酶抑制剂、γ-球蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、因子VIII、因子IX、因子XIII、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原和C1酯酶抑制剂中的至少一种。
13.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：从所述第一糊沉淀和所述第二糊沉淀中的至少一种分离第二蛋白质产品。
14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：从根据亲和层析从第二上清液分离第三中间产物的步骤产生的流穿液和洗涤液中的至少一种中分离第二蛋白质产品。
15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述第二蛋白质产品不同于所述第一蛋白质产品并且包含α-1-蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、因子VIII、因子IX、因子XIII、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原和C1酯酶抑制剂中的至少一种。
16.一种从血液中提取α-1-蛋白酶抑制剂的方法，包括：
取未盐析的、未沉淀的血浆，所述血浆包含原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆和回输血浆中的至少一种；
向血液产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11-13％；
分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；
向所述第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的21-23％；
分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；
溶解所述第二糊沉淀以产生溶解的第二糊沉淀；
使用α-1-蛋白酶抑制剂特异性亲和树脂通过亲和层析从溶解的第二糊中分离第三中间产物；和
通过离子交换色谱分离所述第三中间产物以产生含有α-1-蛋白酶抑制剂的洗脱液。
17.如权利要求16所述的方法，其中原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆和回输血浆中的至少一种包括原料血浆。
18.如权利要求16所述的方法，其中原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆和回输血浆中的至少一种包括新鲜冷冻血浆。
19.如权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括：从根据亲和层析从第二上清液分离第三中间产物的步骤产生的流穿液和洗涤液中的至少一种中分离出γ球蛋白和白蛋白中的至少一种。
20.一种从血液中分离γ球蛋白的方法，包括：
取未盐析的、未沉淀的、预先冷冻的血液产品；
向所述血液产品中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11-13％；
分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；
向所述第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的21-23％；
分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；
使用γ球蛋白特异性亲和树脂通过亲和层析从所述第二上清液分离第三中间产物；和
通过离子交换色谱分离所述第三中间产物以产生含有γ球蛋白的洗脱液。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述未盐析的、未沉淀的、预先冷冻的血液产品是原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆或回输血浆中的至少一种。
22.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括：从所述第二糊沉淀分离γ球蛋白。
23.一种从血浆产生第二上清液的方法，所述方法包括：
向血浆中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占所述第一中间产物重量的11-20％；
分离所述第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；
向所述第一中间产物中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占所述第二中间产物重量的15-30％；和
分离所述第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀。
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