CN108472653A - 用于多重分子诊断的芯片结构 - Google Patents

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Abstract

本发明的一实施例的多重分子诊断芯片结构包括：反应垫，形成有试样通孔及多个反应图案，上述试样通孔能够使所注入的诊断对象试样通过，在上述多个反应图案中，存在包含与诊断对象的特定核酸有关的等温扩增反应引物、扩增反应酶及荧光随着扩增反应而发生变化的指示剂的反应溶液；通道垫，配置于上述反应垫的下部面，在与上述试样通孔相对应的位置形成有第一试样通道，并形成有与上述反应图案相对应的第二试样通道；以及移送垫，配置于上述通道垫的下部面，将从上述试样通孔注入并通过上述第一试样通道被移送的试样通过上述第二试样通道向上述反应图案移送。

Description

用于多重分子诊断的芯片结构
技术领域
本发明涉及用于多重分子诊断的芯片结构，更详细地，涉及可通过仅一次的试样注入来进行分子诊断的所有过程的用于多重分子诊断的芯片结构。
背景技术
分子诊断(Molecular Diagnosis)或分子诊断检查(Molecular Diagnostics)是指通过利用分子生物学技术来检测或分析生物标志物(尤其DNA或RNA)的诊断领域或技术，尤其以与核酸诊断类似的含义使用。尤其，自从1985年开发聚合酶链式反应以来，确立了诸如完成包括人在内的各种感染菌的遗传图谱等技术进步，并且分子诊断检查技术正在飞跃发展。
目前，用于检测病毒的最常用方法为分子诊断方法，上述分子诊断方法通过检测导致疾病的细菌、病毒等核酸(Nucleic acie：DNA和RNA或它们的变形体)来检测病因及感染与否。分子诊断方法包括四个步骤：从体液中采取样品、提取所采取的样品的基因、利用聚合酶链式反应的扩增及分析。分子诊断方法经过基因扩增过程，因此能够以非常高的敏感度及特异性进行精确的诊断，即使对于非常少量的病原体也是如此。然而，由于现有的诊断方法需要使用如聚合酶链式反应(PCR)及电泳等昂贵的分析设备及试剂，所以费用高且需要复杂和专业的技术，因此仅可由熟练的技术人员执行。并且，因分析设备庞大而各生物反应步骤难以整合，从而在分子诊断过程中始终存在样品被污染的可能性，由于分析时间长，在现场传递基因存在局限性。
因此，需要一种克服现有的基因诊断技术的缺点且可在现场进行基因诊断的高效率、高灵敏度的新型病原体基因分析系统，作为其的代替，芯片实验室(Lab-on-a-chip，LOC)技术备受瞩目。芯片实验室技术是指作为生物工程(NT)、信息科技(IT)、纳米技术(BT)的融合技术的代表性的例，利用如微电子机械系统(MEMS)或纳电子机械系统(NEMS)等技术在一个芯片上进行试样的稀释、混合、反应、分离、定量等试样的所有预处理及分析步骤的技术。像这样，由于可在手掌大小的芯片上进行自动化并快速进行所有反应的特征，多年来进行了许多样品预处理、聚合酶链式反应、分析系统小型化的研究，并且一直在进行整合其的有关基因分析系统的研究。
在基因分析中，通过聚合酶链式反应扩增DNA对于核酸分析来说是必不可少的，因为其通过从极少量的样品中扩增基因来具有高灵敏度及特异性。热循环(Thermalcycling)聚合酶链式反应方法为一系列精确匹配变形、接合、伸长的三个温度步骤的反应，因此为了精确的温度梯度，需要昂贵的设备。为了克服这个问题，开发了等温聚合酶链式反应方法，与热循环方法不同，等温聚合酶链式反应方法在规定的温度范围内可进行变性、接合、伸长，因此可缩短扩增时间，并且也可在廉价的设备中保持等温。因此，有利于设备的小型化且可应用于诸如研究室或检测现场等任何场所。
近年来，正在进行许多利用芯片实验室或微综合分析系统技术在微芯片上实现等温聚合酶链式反应的研究。这种等温聚合酶链式反应方法可被称为在现场检查(POC test)中可进行分子诊断的方法。正在开发利用等温聚合酶链式反应的现场诊断传感器，但是存在如小型化、成本降低以及实现简单结构等各种问题。用于现场诊断检查的诊断传感器应更加简单且携带性高，因此需要更加小型化且可进行简单的分子诊断的诊断传感器。
作为上述背景技术说明的事项仅用于增加有关本发明的背景的理解，不应被理解为相当于本技术领域普通技术人员公知的现有技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题
为了解决这些问题而提出本发明，本发明的目的在于，提供一种能够以更加简单的结构在现场利用等温聚合酶链式反应(PCR)方法直接进行诊断的用于多重分子诊断的纸芯片结构。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的一实施例的多重分子诊断芯片结构包括：反应垫，形成有试样通孔及多个反应图案，上述试样通孔可使所注入的诊断对象试样通过，在上述多个反应图案中，存在包含与诊断对象的特定核酸有关的等温扩增反应引物、扩增反应酶及荧光随着扩增反应而发生变化的指示剂的反应溶液；通道垫，配置于上述反应垫的下部面，在与上述试样通孔相对应的位置形成有第一试样通道，并形成有与上述反应图案相对应的第二试样通道；以及移送垫，配置于上述通道垫的下部面，将从上述试样通孔注入并通过上述第一试样通道被移送的试样通过上述第二试样通道向上述反应图案移送。
上述反应溶液可包含聚乙烯醇(PVA)。
本发明还可包括盖，上述盖配置于上述反应垫的上部面，在与上述试样通孔相对应的位置形成有试样注入口。
在上述反应图案包括可确认是否投入试样的比较图案和两种以上可检测诊断对象试样中所包含的特定DNA的检测图案，在上述检测图案中，可分别存在与单独的特定DNA有关的等温扩增反应引物及扩增反应酶。
本发明还可包括上部壳体及下部壳体，上述上部壳体形成于上述反应垫的上部，并形成有与上述试样通孔相对应的式样投入部及形成于与上述反应图案相对应的位置的图案确认部，上述下部壳体形成于上述移送垫的下部并与上述上部壳体相结合。
上述反应垫可以为多孔性的玻璃膜(glass membrane)。
上述通道垫可以为硝化纤维素膜或聚醚砜膜。
上述移送垫可以为具有气孔大小沿着下部方向减小的不对称结构的膜。
上述指示剂可包含羟基萘酚蓝(HNB，Hydroxynaphthol Blue)。
有益效果
根据本发明的用于多重分子诊断的纸芯片结构，能够以更简单的结构进行分子诊断，因此可在现场更容易地进行分子诊断，并且可通过仅一次的试样注入来进行分子诊断的所有过程，从而携带性增强，且可利用一次试样同时进行多种分子诊断。
附图说明
图1为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的立体图。
图2为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的分解立体图。
图3为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的剖视图。
图4为示出本发明中所使用的羟基萘酚蓝的反应的图。
图5为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的试样移动的图。
图6为示出利用本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的实验结果的图。
图7为示出利用本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的实验结果的照片。
图8为示出利用本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的实验结果的曲线图。
具体实施方式
这里所使用的术语仅用于说明特定实施例，而并非限定本发明。只要这些语句未具有与此明确相反的含义，这里所使用的单数形态包括复数形态。在说明书中所使用的“包括”的含义使特定特性、区域、整数、步骤、操作、要素和/或成分具体化，而并非排除其他特定特性、区域、整数、步骤、操作、要素、成分和/或组的存在或添加。
虽然未作出不同的定义，但这里所使用的包括技术术语及科学术语的所有术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义具有相同的含义。通常使用的预先定义的术语被进一步解释为具有与相关技术文献和所公开的内容相一致的含义，除非另有定义，不应被解释为理想的或非常正式的含义。
下面，参照附图对根据本发明的优选实施例的多重分子诊断芯片结构进行说明。
本发明涉及可通过等温扩增方法(LAMP)对作为诊断对象的试样中所包含的DNA或RNA等核酸进行病原菌、病毒检测等的诊断设备中所使用的分子诊断芯片结构。图1为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的立体图。图2为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的分解立体图。图3为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的剖视图。参照图1至图3对本发明进行说明，本发明的一实施例的多重分子诊断芯片结构100大致可包括上部壳体111、下部壳体112、盖120、反应垫130、通道垫140、移送垫150。
本发明的核心结构为层叠反应垫130、通道垫140、移送垫150的结构。反应垫120起到对作为诊断对象的试样进行等温扩增反应的作用，通道垫130起到将在反应垫上引起等温扩增反应的诊断对象试样分离并向反应垫120移送的作用，移送垫140起到将诊断对象试样稳定地传递到反应垫的作用。
下面，对每个结构进行更详细的说明。
在本发明中，上部壳体111和下部壳体112起到保持具有层叠盖120、反应垫130、通道垫140、移送垫150的结构的芯片的形态并从外部保护其的作用。盖120及各垫130、140、150使用膜材料，因此需要上部壳体111及下部壳体112来保持形态。这种上部壳体111及下部壳体112用于保持芯片的结构，即使省略，也可执行芯片的诊断功能。在上部壳体111的中央可形成有能够注入试样的试样投入部114。并且，在上部壳体111可形成有在反应垫130能够确认等温扩增反应的结果的图案确认部113。图案确认部113可以为能够使反应垫130的反应图案132、133、134、135暴露的开口形态，在图案确认部113还可以形成有能够确认内部的颜色变化的透明窗口。试样投入部114可形成于与层叠于下部的盖120的试样投入口131相对应的位置。上部壳体111和下部壳体112可使用多种材料，但优选为轻便的塑料材料。
在上部壳体111的下部可形成有盖120。通过设置盖120来防止在所投入的诊断试样和反应垫130的反应图案132、133、134、135中存在的反应溶液蒸发。并且，优选地，使用透明材料以便能够确认在反应图案132、133、134、135中是否发生扩增反应。在盖120的中央形成有位于与上部壳体111的试样投入部114及反应垫130的试样通孔131相对应的位置的试样投入口121。在本实施例中，可将作为实验用销售的ELISA带(tape)切成合适的大小来使用。
优选地，作为反应垫130使用可进行等温扩增反应且形成有可很好地显示荧光染料的荧光的多个气孔的薄膜。例如，可使用玻璃材质的玻璃膜。在反应垫130的中央可形成有试样通孔131及多个反应图案132、133、134、135，上述试样通孔131可使诊断对象试样通过，在上述多个反应图案132、133、134、135中，存在包含与诊断对象的特定核酸有关的等温扩增反应引物、扩增反应酶及荧光随着扩增反应而发生变化的指示剂的反应溶液。在本实施例中，形成有共四种反应图案。比较图案132可仅包括指示剂以便可以确认是否传递试样。在第一检测图案133、第二检测图案134、第三检测图案135中，可分别存在包含与单独的核酸序列反应的等温扩增反应引物、扩增反应酶及荧光随着扩增反应而发生变化的指示剂的反应溶液。并且，为了扩增反应酶和指示剂的稳定，还可包括非反应性添加物。作为这种非反应性添加物，优选为聚乙烯醇。
因此，如本发明的实施例所述，当存在四种反应图案时，可通过对三种特定核酸的扩增反应来同时进行三种分子诊断。可通过调节反应图案的数量来调节可同时进行诊断的种类。
反应溶液中所使用的指示剂可以为羟基萘酚蓝。图4为示出本发明中所使用的羟基萘酚蓝的反应的图。如图4所示，羟基萘酚蓝为当存在扩增反应时荧光减少的指示剂。因此，当存在作为诊断对象的试样时，发生扩增反应，并且羟基萘酚蓝的荧光减少，从而可确定诊断对象试样的存在。
在反应垫130的下部形成有通道垫140。通道垫140起到可将所投入的试样通过移送垫150传递到反应垫130的反应图案132、133、134、135的作用。在通道垫140的与上部壳体111的试样投入部114、盖120的试样投入口121、反应垫130的试样通孔131相对应的位置形成有可使式样通过的第一试样通道141，在通道垫140的与与反应垫130的反应图案132、133、134、135相对应的位置形成有使试样可从移送垫150通过的第二试样通道142。优选地，利用蜡对图案简单且不阻碍反应的薄膜进行图案化来使用，以便于形成各个试样通过通道。在本实施例中，可使用硝化纤维素膜或聚醚砜膜等。
在通道垫140的下部设置移送垫150，上述移送垫150可均匀地扩散所注入的诊断对象试样并向反应垫130的反应图案132、133、134、135供给试样。作为移送垫150可使用气孔大小沿着下部方向减小的不对称膜，使得所投入的试样可整体上很好地扩散。所投入的试样沿着气孔减小的方向扩散，从而可整体上均匀地扩散到移送垫150。
图5为示出本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的试样移动的图。当通过最初上部壳体111的试样投入部114投入试样时，上述试样通过盖120的试样投入口121、反应垫130的试样通孔131、通道垫140的第一试样通道141向移送垫150移送。此时，当充分浸湿移送垫150时，试样通过移送垫150并通过通道垫140的第二试样通道142传递到反应垫130的反应图案132、133、134、135。通过通道垫140以使试样独立地传递到各个反应图案132、133、134、135，从而可通过一次的试样投入来进行多重诊断。
下面，通过实验例来进一步详细说明本发明。
1.制造多重分子诊断芯片
以与图1至图3相同的形态制造多重分子诊断芯片。首先，利用默克密理博(MerckMillipore)的G028玻璃结合垫(Glass conjugated pad)制造反应垫。在中间形成孔，在四个位置形成反应图案。分别准备需要诊断的目标1、2、3各自的环介导等温扩增(LAMP，Loop-Mediated Isothermal Amplification)引物。目标1为无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，目标2为肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，目标3为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。例如，在下列表1中示出相当于目标1、2、3的DNA引物的例示。将相当于肺炎链球菌的引物按照F3/B3/FIP/BIP/LF/LB顺序以1：1：8：8：4：4混合。
表1
以这种方式准备各目标所需的环介导等温扩增引物并制备在下列表2中示出的反应溶液。
表2
如表2所示，将约3.5μL的反应溶液投入到反应垫的反应图案后，在约37℃的温度的烤箱中干燥约20分钟。
使用斯特里技术(Sterlitech)的8.0μm的PES802005膜过滤器，利用蜡印刷机在表面形成图案以便形成试样通过通道，从而制造通道垫。利用盖将依科赛科学(ExcelScientific)的密封板(SealPlate)与反应垫和通道垫重叠以便分别形成试样投入口、试样通孔、第一试样通道。
在移送通道中，使用清晰的(Vivid)玻璃纤维(GF)不对称膜进行层叠后，通过层叠上部壳体和下部壳体来制造多重分子诊断芯片。
2.进行多重分子诊断反应
准备包含所要诊断的目标1、2、3菌的DNA的样品。将其与下列表3中所示的缓冲溶液和样品混合。
表3
在混合样品和缓冲溶液后，通过上部壳体的试样注入部注入约70～100μL，将壳体以约63℃的温度保持约1小时后，确认分子诊断结果。(Non为仅投入缓冲溶液的情况，目标1为仅投入目标1的情况，目标1、2为投入目标1、2的情况，目标1、2、3为分别投入目标1、2、3的情况。参照图6)
图7为示出利用本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的实验结果的照片。图8为示出利用本发明的一实施例的用于多重分子诊断的芯片结构的实验结果的曲线图。如图6及图7所示，在不存在任何样品的情况下(Non)，不进行等温扩增反应，从而可确认各区域均存在荧光物质。在目标1的情况下，可确认存在目标1的样品，并且T1的荧光减少。在目标2的情况下，可知存在目标1、2的样品，并且T1、T2的荧光减少。在目标3的情况下，可知存在目标1、2、3的样品，并且T1、T2、T3的荧光减少。
由此可见，本发明可通过简单的装置同时进行三种分子诊断。
以上，参照附图说明了本发明的实施例，但应理解的是，本发明所属技术领域的普通技术人员能够以其他具体形式来实施而不改变本发明的技术思想或必需的特征。
因此应该理解的是，上述实施例在所有方面仅为说明性的而非限制性的。本发明的范围由所附发明要求保护范围表示，而不是由上述详细说明表示，并且从发明要求保护范围的含义、范围及其等同概念导出的所有变更或所变更的形式应被解释为包含在本发明的范围内。
附图标记的说明
111：上部壳体 12：下部壳体 120：盖
130：反应垫 140：通道垫 150：移送垫

Claims (9)

1.一种多重分子诊断芯片结构，其特征在于，包括：
反应垫，形成有试样通孔及多个反应图案，上述试样通孔能够使所注入的诊断对象试样通过，在上述多个反应图案中，存在包含与诊断对象的特定核酸有关的等温扩增反应引物、扩增反应酶及荧光随着扩增反应而发生变化的指示剂的反应溶液；
通道垫，配置于上述反应垫的下部面，在与上述试样通孔相对应的位置形成有第一试样通道，并形成有与上述反应图案相对应的第二试样通道；以及
移送垫，配置于上述通道垫的下部面，将从上述试样通孔注入并通过上述第一试样通道被移送的试样通过上述第二试样通道向上述反应图案移送。
2.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，上述反应溶液还包含聚乙烯醇。
3.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，还包括盖，上述盖配置于上述反应垫的上部面，在与上述试样通孔相对应的位置形成有试样注入口。
4.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，
在上述反应图案形成有能够确认是否投入试样的比较图案和两种以上能够检测诊断对象试样中所包含的特定DNA的检测图案，
在上述检测图案中，分别存在与单独的特定DNA有关的等温扩增反应引物及扩增反应酶。
5.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，还包括上部壳体及下部壳体，上述上部壳体形成于上述反应垫的上部，并形成有与上述试样通孔相对应的式样投入部及形成于与上述反应图案相对应的位置的图案确认部，上述下部壳体形成于上述移送垫的下部并与上述上部壳体相结合。
6.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，上述反应垫为多孔性的玻璃膜。
7.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，上述通道垫为硝化纤维素膜或聚醚砜膜。
8.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，上述移送垫为具有气孔大小沿着下部方向减小的不对称结构的膜。
9.根据权利要求1所述的多重分子诊断芯片结构，其特征在于，上述指示剂包含羟基萘酚蓝。
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