CN108472381B - 化合物及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有将免疫应答与确定的治疗靶点连接能力的新化合物，涉及所述化合物在治疗癌症和由感染物介导和/或引起的疾病或病症中的用途，涉及含有所述化合物的组合物、它们的制备方法以及在所述方法中使用的新中间体。

Description

化合物及其治疗用途
技术领域
本发明涉及具有将免疫应答与确定的治疗靶点连接能力的新化合物，涉及所述化合物在治疗癌症和由感染物(infective agent)介导和/或引起的疾病或病症中的用途，涉及含有所述化合物的组合物、它们的制备方法以及所述方法中使用的新中间体。
背景技术
有必要寻找召集个体免疫系统来对抗疾病的新方法。人体免疫系统不断检查身体以发现外来信号，从而识别潜在有害的病原体或突变的人体细胞(可能成为癌生长的原因)并将其作为消除的目标。存在天然抗体，可以召集它们到所述病原体或突变的人细胞以驱使免疫系统消除威胁。
癌症是一组涉及细胞异常生长的疾病，可能侵入或蔓延到身体的其它部位。2012年，约有1410万人患癌症。它造成约820万人死亡，为人类总死亡的14.6％。男性中最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结直肠癌和胃癌。在女性中，最常见的癌症类型是乳腺癌、结直肠癌、肺癌和宫颈癌。已经充分证明，免疫反应在识别和消除癌细胞中起着至关重要的作用。已经存在通过增强个体免疫系统来协助对抗癌症的药物。但是，仍然需要能够更好地靶向特定于癌细胞的免疫应答，产生更宽范围的患者自身肿瘤相关抗原。靶向患者自身肿瘤的已有天然抗体可以满足这种需求。迫切需要鉴别治疗细菌、病毒和真菌感染的新方法。抗微生物药物的耐药性问题正成为全球健康的主要威胁。例如，估计美国每年有超过200万人感染对一类抗生素耐药的细菌(Center for Disease Control and Prevention,2013)。
在WO 2005/079423中，公开了治疗感染性疾病或癌症的创新方法，其中描述了含有两个结合部分的免疫连接基团。第一结合部分能够结合个体的免疫应答成分。第二结合部分能够结合任何化合物或外来物质，例如抗原、病原体、化学物质或内源性物质，例如在癌症中发现的改变的细胞。所述免疫连接基团分子的最终作用是将个体的已有免疫应答转移到靶点，即癌细胞或特异性病原体。所述第一结合部分的实例包括被所述个体的免疫系统识别为异物并因此会引发免疫应答的化合物或药物。第一结合部分的一个实例是能够与人血清抗体抗-α-半乳糖基(即半乳糖基-α-1,3-半乳糖基-β-1,4-N-乙酰葡糖胺)结合的碳水化合物分子。所述第二结合部分的实例包括能够特异性与靶分子结合的抗体和核酸适体分子。WO2005/079423中公开的方法的原理是：连接基团分子的第二结合部分(例如核酸适体)可以与癌细胞结合，连接基团分子上的第一结合部分(即能够与人类抗α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物)的存在能够引起对癌细胞的免疫应答，导致癌细胞的有效破坏。类似的方法可以用于治疗由感染物介导和/或引起的疾病或病症，其中连接基团分子的第二结合部分(即核酸适体)与感染物结合。
因此，非常需要含有间隔基团的连接基团分子，所述间隔基团已被优化以控制第一结合部分(即，能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)的数量和相对于第二结合部分(即核酸适体)的位置。此类连接基团分子被设计为以这样的方式吸引天然抗体，从而能够使得免疫召集的效能最大化，同时使潜在的副作用最小化，因此在提供有效的抗癌疗法和抗感染疗法方面具有很大的实用性。
发明内容
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了式(I)化合物或其可药用的盐：
Figure BDA0001687660830000021
其中：
L代表选自核酸适体或生物素的结合部分；
S1代表选自–(CH2)a-或–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1－5个可以任选被一或多个选自下列的基团取代：-O-、–C(O)NH-、-NHC(O)-和苯基；
a代表选自1－35的整数；
b代表选自0－5的整数；
c代表选自1－20的整数；
d代表选自1－20的整数；
S2代表选自–(CH2)e-或–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1－3个可以任选被一或多个选自下列的基团取代：-N(H)-、–C(O)NH-和-NHC(O)-；
e代表选自1－15的整数；
f代表选自1－10的整数；
g代表选自1－20的整数；
h代表选自1－5的整数；
X1代表–O-或-NH-，从而使得当L代表核酸适体时，X1代表–O-，当L代表生物素时，X1代表–NH-；
Y1和Y2独立代表键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或–NHC(O)NH-基团；
F代表能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子；
m代表选自1－5的整数；并且
Cy代表苯基、联苯基、三苯基或双环杂芳族环系，从而使得当Cy代表联苯基或三苯基时，所述–Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
附图说明
图1：流式细胞术试验结果，其采用实施例22(图1A)、实施例23(图1B)和实施例24(图1C)证实了将抗α-半乳糖基IgG抗体捕获到细胞表面。
图2：在流式细胞术试验中进行的实施例22－24的剂量滴定，其证明了通过实施例22－24向人癌细胞系A431募集抗半乳糖基抗体的差异。
图3：采用实施例40(图3A)、实施例41(图3B)、实施例42(图3C)和实施例43(图3D)证实了将抗α半乳糖基抗体捕获到细胞表面。
图4：采用所述流式细胞术试验对实施例40－43进行的剂量滴定。
图5：(左图)采用所述的流式细胞术试验进行实施例44－47的剂量滴定，证明了向浓度为1.25－20μM的实施例44(图5A)、实施例45(图5B)、实施例46(图5C)和实施例47(图5D)的金黄色葡萄球菌(S.aureus)募集抗半乳糖基抗体。图5的右图证实了使用20μM实施例44(图5A)、实施例45(图5B)、实施例46(图5C)和实施例47(图5D)将抗α半乳糖基抗体捕获到细菌表面。
图6：流式细胞术测定结果，证明了使用实施例22(图6A)、实施例23(图6B)和实施例24(图6C)将抗半乳糖基IgM抗体捕获到细胞表面。
发明详述
根据可以提及的本发明的一个具体方面，提供了式(I)化合物或其可药用的盐：
Figure BDA0001687660830000041
其中：
L代表选自核酸适体或生物素的结合部分；
S1代表选自–(CH2)a-或–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1或2个可以任选被–C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代；
a代表选自1－15的整数；
b代表选自1－5的整数；
c代表选自1－20的整数；
d代表选自1－5的整数；
S2代表选自–(CH2)e-或–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团的间隔基团,其中所述–CH2-基团中的1或2个可以任选被–C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代；
e代表选自1－15的整数；
f代表选自1－10的整数；
g代表选自1－10的整数；
h代表选自1－5的整数；
X1代表–O-或-NH-，从而使得当L代表核酸适体时，X1代表–O-，当L代表生物素时，X1代表–NH-；
Y1和Y2独立代表键、-O-、-S-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NHSO2-、-SO2NH-或–NHC(O)NH-基团；
F代表能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子；
m代表选自1－5的整数；并且
Cy代表苯基、联苯基或双环杂芳族环系，从而使得当Cy代表联苯基时，所述–Y1-S1-X1-L基团可以存在于所述苯环中的任一个上，所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于所述苯环中的任一个上或两者上。
本发明化合物包含链接分子(即-S2-Y2-Cy-Y1-S1-X1-)，其已经经过优化以控制F基团(即，能够与人抗体α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)的数目和相对于结合部分L(即核酸适体)的位置的位置。例如，刚性环状基团具有能够提供用于相对于L的一或多个F基团的最佳定位的支架的优点。可以理解的是，F基团相对于L的确切数量和方向取决于L基团的性质。此外，含有单个苯基环、联苯环、三苯基环或双环杂芳基环的环状基团的存在提供了呈现多个F基团(即能够与人抗-α-半乳糖基抗体人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)的显著优势以增强由宿主产生的免疫应答。多个结合基团的化学呈现在本领域中是先前已知的，然而，与本发明不同，这是通过使用一个或多个氨基酸基团(例如参见WO2014/178878)或分支连接基团(例如参见US 2014/0112975)来实现，本发明是使用单个6元环系(即苯基)、稠合的两个6元环系(即喹啉基)或通过键链接的两个6元环系(联苯基)或者通过2个键连接的三元环系(三苯基)。这种区别所带来的技术效果是本发明的化合物可以较本领域以前已知的链接分子更易于制备，所述链接分子通常需要“点击化学(clickchemistry)”(参见Kolb等(2001)Angewandte Chemie International Edition 40(11)；2004至2021年)。此外，本发明的化合物有利地避免了手性中心的存在。本发明化合物的合成也不使用树脂，因此能够提供适用于大规模药物生产的规模化(scaling)的优点。因此，本发明的化合物不仅在治疗上有优势，而且还提供了增强宿主免疫应答的优点，同时还具有可扩展性(scalability)的高产率合成的容易性和效率的优点。另外，本发明的连接基团是稳定的，因此，通常不包含本领域先前已知的许多化合物所需要的“可裂解的连接基团”组分(例如参见US8,828,956)。此外，本发明的连接基团使得本领域技术人员可以以简易且有效的合成方式选择基团的特定左手侧和右手侧的组合。
在一个实施方案中，S1代表间隔基团，选自：
–(CH2)a-，其中所述–CH2-基团中的1－4个任选被一或多个选自下列的基团取代：–C(O)NH-和-NHC(O)-(例如-(CH2)2-、-CH2-CONH-(CH2)2-、-CH2-NHCO-(CH2)4-CONH-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-或-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-)；或
–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述–CH2-基团中的1－5个任选被一或多个选自下列的基团取代：-O-、–C(O)NH-、-NHC(O)-和苯基(例如-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-、-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-O-苯基-CONH-(CH2)6-、-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-O-苯基-CONH-(CH2)6-或-(CH2CH2O)4-(CH2)2-CONH-(CH2)2-)。
在另一个实施方案中，S1代表间隔基团，其选自–(CH2)a-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)2-、-CH2-CONH-(CH2)2-、-CH2-NHCO-(CH2)4-CONH-(CH2)2-或-(CH2)6-)或–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团(例如-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-)取代)。
在另一个实施方案中，S1代表间隔基团，其选自：
–(CH2)a-，其中所述–CH2-基团中的2或4个任选被–C(O)NH-取代(例如-(CH2)6-、-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-或-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-)；或
–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-，其中所述–CH2-基团中的5个任选被一或多个选自下列的基团取代：-O-、–C(O)NH-、-NHC(O)-和苯基(例如-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-O-苯基-CONH-(CH2)6-或-(CH2)2-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-O-苯基-CONH-(CH2)6-)。
应该理解，a、b、c、d、e、f、g和h的选择应当使得在F和L基团之间保持适当的连接基团长度。F和L之间适当的连接基团长度的范围为约
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至约/>
Figure BDA0001687660830000072
或更长，约/>
Figure BDA0001687660830000073
至约/>
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至约/>
Figure BDA0001687660830000076
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至约/>
Figure BDA00016876608300000716
因此，在一个实施方案中，a、b、c、d、e、f、g和h表示不超过45的全部整数，例如5至45，例如7至42；例如不超过30，例如5至30，例如7至29。
在一个实施方案中，a表示选自1－30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2－30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2、4、6、9、18或30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自6、18或30的整数。在另一个实施方案中，a表示选自1－10的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2－9的整数。在另一个实施方案中，a表示选自2、4、6或9的整数。
在一个实施方案中，b表示选自0－3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自0或3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自1－3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自2或3的整数。在另一个实施方案中，b表示选自3的整数。
在一个实施方案中，c代表选自1－15的整数。在另一个实施方案中，c表示选自1－12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自4－12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自4或12的整数。在另一个实施方案中，c表示选自12的整数。
在一个实施方案中，d表示选自1－15的整数。在另一个实施方案中，d表示选自2－13的整数。在另一个实施方案中，d表示选自2、5或13的整数。在另一个实施方案中，d表示选自13的整数。在另一个实施方案中，d表示选自1－3的整数。在另一个实施方案中，d表示选自1或2的整数。在另一个实施方案中，d表示选自2的整数。
在一个实施方案中，Y1代表键、-C(O)NH-或-O-。在另一个实施方案中，Y1代表-C(O)NH-。
在一个实施方案中，S2代表间隔基团，其选自：
–(CH2)e-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被选自下列的1或2个基团取代：-N(H)-、-C(O)NH-和-NHC(O)-(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-、-(CH2)3-NH-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其所述–CH2-基团中的1－3个任选被1－3个-NHC(O)-基团(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)取代。
在另一个实施方案中，S2代表间隔基团，其选自–(CH2)e-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-、-(CH2)3-、-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-或-(CH2)3-NH-CH2-)或–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被-C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-或-(CH2)4-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-))。
在另一个实施方案中，S2代表间隔基团，其选自：
–(CH2)e-，其中所述–CH2-基团中的1或2个任选被1或2个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-CH2-)；或
–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-，其中所述–CH2-基团中的1－3个任选被1－3个-NHC(O)-基团取代(例如-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-、-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)12-(CH2)2-NHCO-CH2-或-(CH2)3-NHCO-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-)。
在一个实施方案中，e代表选自1－10的整数。在另一个实施方案中，e代表选自3－10的整数。在另一个实施方案中，e代表选自3、5、9或10的整数。在另一个实施方案中，e代表选自5或9的整数。在另一个实施方案中，e代表选自4－10的整数。在另一个实施方案中，e代表选自4、5或10的整数。
在一个实施方案中，f代表选自1－8的整数。在另一个实施方案中，f代表选自2－8的整数。在另一个实施方案中，f代表选自2－6的整数。在另一个实施方案中，f代表选自4－8的整数。在另一个实施方案中，f代表选自4或8的整数。
在一个实施方案中，g代表选自1－15的整数。在另一个实施方案中，g代表选自4－12的整数。在另一个实施方案中，g代表选自4或12的整数。在另一个实施方案中，g代表选自1－5的整数、在另一个实施方案中，g代表选自1－4的整数。在另一个实施方案中，g代表选自4的整数。
在一个实施方案中，h代表选自1－4的整数。在另一个实施方案中，h代表选自4的整数。
在一个实施方案中，Y2代表键、–O-或-NHC(O)-。在另一个实施方案中，Y2代表键或–O-。在另一个实施方案中，Y2代表–O-。
在一个实施方案中，m代表选自1－4的整数。在另一个实施方案中，m代表选自3或4的整数。在另一个实施方案中，m代表选自1－3的整数。在另一个实施方案中，m代表选自2或3的整数。在另一个实施方案中，m代表选自1或2的整数。在另一个实施方案中，m代表选自1的整数。
本文中提及的术语“双环杂芳环体系”是指含有两个稠合的六元环并且包含至少一个选自N的杂原子的双环环系。含有两个稠合的六元环的双环杂芳基的具体实例包括但不限于喹啉、异喹啉、吡啶并吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、萘啶和蝶啶基团。在一个实施方案中，所述双环杂芳族环系为喹啉基。
在一个实施方案中，Cy代表苯基、联苯基、三苯基或喹啉基。在另一个实施方案中，Cy代表苯基、联苯基或三苯基。在另一个实施方案中，Cy代表苯基、联苯基或喹啉基。在另一个实施方案中，Cy代表苯基或联苯基。在另一个实施方案中，Cy代表联苯基。
根据本发明的另一方面，提供了式(I)a化合物或其可药用的盐：
Figure BDA0001687660830000101
其中：
L代表选自核酸适体或生物素的结合部分；
S1代表选自–(CH2)a-或–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团的间隔基团,其中所述–CH2-基团中的1或2个可以任选被–C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代；
a代表选自2－9的整数；
b代表选自1－3的整数；
c代表选自1－15的整数；
d代表选自1－3的整数；
S2代表选自–(CH2)e-或–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1或2个可以任选被–C(O)NH-或-NHC(O)-基团取代；
e代表选自1－10的整数；
f代表选自1－8的整数；
g代表选自1－5的整数；
h代表选自1－3的整数；
X1代表–O-或-NH-，从而使得当L代表核酸适体时，X1代表–O-，当L代表生物素时，X1代表–NH-；
Y1和Y2独立代表键、-O-或-C(O)NH-基团；
F代表能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子；
m代表选自1－4的整数；并且
Cy代表苯基、联苯基或喹啉基，从而使得当Cy代表联苯基时，所述–Y1-S1-X1-L基团可以存在于所述苯环中的任一个上，所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于所述苯环中的任一个上或两个上。
根据本发明的另一方面，提供了式(I)b化合物或其可药用的盐：
Figure BDA0001687660830000111
其中：
L代表选自核酸适体或生物素的结合部分；
S1代表选自–(CH2)a-或–(CH2)b-(CH2-CH2-O)c-(CH2)d-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1－5个可以任选被一或多个选自下列的基团取代：-O-、–C(O)NH-、-NHC(O)-和苯基；
a代表选自2－30的整数；
b代表选自0－3的整数；
c代表选自4－12的整数；
d代表选自2－13的整数；
S2代表选自–(CH2)e-或–(CH2)f-(CH2-CH2-O)g-(CH2)h-基团的间隔基团，其中所述–CH2-基团中的1－3个可以任选被一或多个选自下列的基团取代：-N(H)-、–C(O)NH-和-NHC(O)-；
e代表选自3－10的整数；
f代表选自4－8的整数；
g代表选自4－12的整数；
h代表选自1－4的整数；
X1代表–O-或-NH-，从而使得当L代表核酸适体时，X1代表–O-，当L代表生物素时，X1代表–NH-；
Y1和Y2独立代表键、-O-、-C(O)NH-或-NHC(O)-基团；
F代表能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子；
m代表选自1－4的整数；并且
Cy代表苯基、联苯基、三苯基或喹啉基，从而使得当Cy代表联苯基或三苯基时，所述–Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
本文中提及的术语“能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子”包括能够与结合所述人的免疫应答组分(即抗α-半乳糖基抗体)结合并从而引发人体免疫应答的糖(即碳水化合物)部分。在一个实施方案中，所述抗α-半乳糖基抗体是抗-α-半乳糖基IgG抗体或抗α-半乳糖基IgM抗体。数据在本文的图1和6中示出，其分别显示了抗α半乳糖基IgG和IgM抗体的捕获。此类碳水化合物分子的实例包括α-半乳糖基化合物及其修饰的衍生物。适当的碳水化合物分子的其它实例包括US 2012/0003251中列出的α-gal表位，其适合用于选择性靶向和杀死肿瘤细胞，该表位引入本文作为参考。在一个实施方案中，F选自半乳糖基-α-1,3-半乳糖基-β-1,4-N-乙酰葡糖胺、α1-3半乳二糖、α1-3-β1-4-半乳三糖或Galili五糖(galilipentasaccharide)。
在一个具体的实施方案中，F具有如下式之一中所示的结构：
Figure BDA0001687660830000121
其中S2是指与S2基团的连接点。
在一个具体的实施方案中，F具有如下式中所示的结构：
Figure BDA0001687660830000122
其中S2是指与S2基团的连接点。
本文中提及的术语“结合部分”是指能够与其它组分结合的任何适当的部分。在本发明中，该结合部分是核酸适体或生物素。
在一个实施方案中，L代表选自核酸适体的治疗靶点结合部分。
本文中提及的“核酸适体”是指能够与特定靶分子如治疗靶分子结合的寡核苷酸分子。通常通过从大的随机序列库中选择核酸适体进行该核酸适体的鉴定。在一个实施方案中，核酸适体为DNA适体、RNA适体或核酸类似物适体。在另一个实施方案中，核酸适体为RNA适体。在一个实施方案中，核酸适体为包含多于5个但少于100个核酸分子的寡核苷酸。应当理解，所述核酸适体可含有天然和非天然核苷酸，例如在2'位可具有氟或甲氧基取代基的修饰核苷酸。适当的非天然核苷酸的实例描述于Stovall等(2014).In VitroSelection Using Modified or Unnatural Nucleotides(使用修饰或非天然核苷酸的体外选择).Doi:10.1002/471142700.nc0906s56,表9.6.1，其非天然核苷酸在此引入作为参考。
当L代表选自核酸适体的治疗靶点结合部分时，L代表下列结构：
Figure BDA0001687660830000131
其中B表示天然碱基(即腺嘌呤、胸腺嘧啶/尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶)或非天然碱基，箭头表示适体序列中的下一个核苷酸，Rx表示氢、羟基或2'修饰(例如氟或甲氧基)，X1是指当L代表核酸适体时，在本发明中，与X1基团的连接点应当为-O-。
对本领域技术人员显而易见的是，可以根据已知方法容易地制备针对特定治疗靶点的核酸适体，例如通过指数富集(SELEX)的配体的选择性系统进化。
应该理解的是，本发明的核酸适体将被配置为与治疗靶点结合，所述治疗靶点是癌细胞或特定病原体。在一个实施方案中，核酸适体被配置为与癌细胞结合。在另一个实施方案中，核酸适体与肿瘤相关特异性抗原结合，所述抗原在肿瘤细胞上的细胞表面表达不同于其在健康细胞上的表达。在另一个实施方案中，核酸适体为表皮生长因子受体(EGFR)结合核酸适体。众所周知，EGFR在多种人类癌症类型中均过度表达。
在一个实施方案中，EGFR结合核酸适体为与选自下列的任一种EGFR亚家族结合的适体：EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。
适当的EGFR结合核酸适体的实例包括Li等(2011)PLoS One 6(6),1－9中描述的那些，其描述了一系列抗EGFR适体，包括E07。Viswatej Avutu在2011年发表了一篇论文：
(https://repositories.lib.utexas.edu/bitstream/h和le/2152/13407/Avutu-Bioch_10.pdf？sequence＝2)
其描述了被称为MinE07的E07的最小化变体，其具有以下序列：
5’-rGrGrA fCrGrG rAfUfU fUrArA fUfCrG fCfCrG fUrArG rArArA rArGfCrAfUrG fUfCrA rArArG fCfCrG rGrArA fCfCrG fUfCfC-3’(SEQ ID NO:4)，其中“r”代表天然2'-OH(RNA)核苷酸，“f”代表修饰的2'-氟代核苷酸。因此，在一个实施方案中，所述EGFR结合核酸适体包含具有SEQ ID NO:4序列的适体或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列的适体。在另一个实施方案中，EGFR结合核酸适体包含具有SEQ ID NO:4序列的适体。
其它适当的EGFR结合核酸适体的实例包括国际专利申请号PCT/GB2015/051812中所述的SEQ ID NOS:1至84的核酸适体。在一个实施方案中，核酸适体选自国际专利申请号PCT/GB2015/051812中描述的SEQ ID NO:79，其具有以下序列：
5’-mGmGmG mAfUfU fUAA fUfCmG fCfCmG fUmAmG AmAmA AmGfC mAfUmG fUfCmAAAmG fCfCmG mGmAA fCfCfC-3’(SEQ ID NO:5)；
其中m为2'-OMe，f为2'-F。因此，在一个实施方案中，EGFR结合核酸适体包含具有SEQ ID NO:5序列的适体或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列的适体。在另一个实施方案中，EGFR结合性核酸适体包含具有SEQID NO:5的序列的适体。
在另一个实施方案中，核酸适体包含SEQ ID NO:5的5’和3’修饰的衍生物，其具有以下序列：
H2N-(CH2)6-5’-(SEQ ID NO:5)-3’-idT(在下文中称为SEQ ID NO:1)或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列。
在另一个实施方案中，EGFR结合核酸适体包含具有SEQ ID NO:1序列的适体。
在一个实施方案中，核酸适体不为表皮生长因子受体(EGFR)结合核酸适体。
在另一个实施方案中，核酸适体被配置为与特定病原体结合。在另一个实施方案中，核酸适体被配置为与链球菌细菌结合，例如A组链球菌(GAS)细菌。配置成与A组链球菌细菌结合的适当的核酸适体的实例包括Kristian等(2015)J.Mol.Med.(2015)93,619－631所述核酸适体，其核酸适体(特别是Kristian等的在表1中所述的那些，同上)引入本文作为参考。在一个实施方案中，核酸适体选自Kristian等(2015)J.Mol.Med.(2015)93,619－631中描述的GAS适体，其具有以下序列：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGGGGGAAGACACAGAGAAAGGCCGGGGTGAAGTGTAGAGGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’(SEQ ID NO:6)。因此，在一个实施方案中，核酸适体包含具有SEQ IDNO:6序列的适体或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列的适体。在另一个实施方案中，所述核酸适体包含具有SEQ ID NO:6的序列的适体。
在另一个实施方案中，所述核酸适体包含SEQ ID NO:6的5’修饰的衍生物，其具有以下序列：
H2N-(CH2)6-5’-(SEQ ID NO:6)-3’(在下文中称为SEQ ID NO:2)或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列。在另一个实施方案中，所述核酸适体包含具有SEQ ID NO:2的序列的适体。
在一个替代实施方案中，核酸适体被配置为与葡萄球菌结合，例如金黄色葡萄球菌，特别是蛋白A(SpA)。配置成与金黄色葡萄球菌细菌特别是蛋白质A(SpA)结合的适当的核酸适体的实例包括Friedman等(2015)Biomaterials 36,110－123中描述的核酸适体，其核酸适体引入本文作为参考。在一个实施方案中，所述核酸适体选自Friedman等(2015)Biomaterials 36,110－123中描述的金黄色葡萄球菌适体SEQ ID fmA12Δ9，其具有以下序列：
5’-mUfGmUfGmUmAmAmUmUmCmUfGmCmCmAmUmUmCmUmUmUmUmUfGfGfGfGmCfGfGmAmAmUmAmCmAfGfGmAmUfGmUfGmAfGmUfGmCmAmUmUfGmCmAmUmCmAmCfGmUmC-3’(SEQ ID NO:7)；其中m为2’-OMe，f为2’-F。因此，在一个实施方案中，核酸适体包含具有SEQ ID NO:7序列的适体或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列的适体。在另一个实施方案中，所述核酸适体包含具有SEQ ID NO:7的序列的适体。
在另一个实施方案中，所述核酸适体包含SEQ ID NO:7的5’和3’修饰的衍生物，其具有以下序列：
H2N-(CH2)6-5’-(SEQ ID NO:7)-3’-idT(在下文中称为SEQ ID NO:3)或与所述序列具有至少90％序列同源性(例如至少95、96、97、98或99％序列同源性)的序列。在另一个实施方案中，所述核酸适体包含具有SEQ ID NO:3的序列的适体。
在一个替代实施方案中，L代表选自生物素的结合部分。
当所述结合部分代表生物素时，L代表下列结构：
Figure BDA0001687660830000161
其中X1是指当L代表核酸适体生物素时，本发明所需要的与X1基团的连接点为–NH-。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包含实施例1－62的化合物或其可药用的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物，其包含实施例1－25的化合物或其可药用的盐。应该理解，实施例1－21和48－62的化合物包含其中L代表生物素的化合物。实施例1-21和48－62的化合物可以特别用作工具化合物、参比化合物或测试化合物。具有代表生物素的L的实施例1－21和48－62的化合物有助于证实结合概念的证据，然而，应理解的是，每种生物素分子可以替代对癌细胞或传染源具有特异性的核酸适体用于治疗用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包含实施例22－47的化合物或其可药用的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物，其包含实施例22－25的化合物或其可药用的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包含实施例22－24和26－43的化合物或其可药用的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物，其包含实施例22－24的化合物或其可药用的盐。应该理解的是，实施例22－24和26－43的化合物包含其中L表示EGFR核酸适体的化合物，因此在癌症治疗方面具有特定的治疗用途，这可以从Kristian等(2015)(同上)中描述的证明靶向A组链球菌(GAS)细菌的核酸适体的方法中推断。
在一个实施方案中，式(I)化合物不为实施例22－24和26－43的化合物或其可药用的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包含实施例25的化合物或其可药用的盐。应当理解的是，实施例25的化合物包含其中L代表靶向A组链球菌(GAS)细菌的核酸适体，因此如Kristian等(2015)(同上)所述，在感染治疗中具有特定治疗用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其包含实施例44－47的化合物或其可药用的盐。应当理解的是，实施例44－47的化合物包含其中L代表靶向金黄色葡萄球菌的核酸适体，因此如Friedman等(2015)(同上)所述，在感染治疗中具有特定用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其为实施例1－62(特别是实施例22－47)的化合物的游离碱。
在另一个实施方案中，本发明提供了式(I)化合物，其为实施例1－25(特别是实施例22－25)的化合物的游离碱。
式(I)化合物及其亚组还包括其离子形式、盐、溶剂合物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、同位素和保护形式，如下所述；优选其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂合物；更优选其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂合物，甚至更优选其盐或互变异构体或溶剂化物。在下文中，本发明任何方面中所定义的化合物及其离子形式、盐、溶剂化物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、同位素和受保护形式(化学过程中的中间体化合物除外)均被称为“本发明的化合物”。
式(I)化合物可以以盐的形式存在，例如酸加成盐，或在某些情况下为有机和无机碱的盐，例如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐。所有此类盐均在本发明的范围内，对式(I)化合物的提及包括化合物的盐形式。在一个实施方案中，式(I)化合物作为磷酸盐存在。
本发明的盐可以通过常规化学方法由含有碱性部分的母体化合物合成，所述方法例如描述于Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(可药用的盐：性质、选择和应用),P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,精装,第388页,2002年8月。通常，此类盐可以通过使得这些化合物的碱形式与适当的碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；通常采用非水介质，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。
酸加成盐(单盐或二盐)可以用各种酸形成，包括无机和有机酸。酸加成盐的实例包括与选自下列的酸形成的单盐和二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、(+)-樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸(粘酸)、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(例如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳酸和戊酸以及酰化的氨基酸和阳离子交换树脂。
一组特定的盐包括由下列酸形成的盐：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸(甲磺酸酯)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸。一种特定的盐是盐酸盐。另一种特定的盐是硫酸氢盐，也称为半硫酸盐。
仅举例来说，盐还包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等。
应当理解，当靶结合部分表示核酸适体时，式(I)化合物理想地以无盐形式存在以避免核酸适体的任何潜在降解。
当式(I)化合物含有胺官能团时，这些可以形成季铵盐，例如根据技术人员公知的方法通过与烷基化剂反应形成。此类季铵化合物在式(I)的范围内。
根据形成盐的酸的pKa，本发明的化合物可以以单盐或二盐形式存在。
本发明化合物的盐形式通常为可药用的盐，可药用的盐的实例描述于Berge等,1977,“Phamistry Acceptable Salts(可药用的盐)”,J.Pharm.Sci.,第66卷,第1－19页。然而，非可药用的盐也可以制备为中间体形式，然后可以将其转化为可药用的盐。可用于例如本发明化合物的纯化或分离的此类非可药用的盐形式也构成本发明的一部分。
有机化学领域的技术人员应当理解，许多有机化合物可以与溶剂形成复合物，它们在该溶剂中反应或从其中沉淀或结晶。这些复合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的复合体被称为“水合物”。本发明化合物的可药用的溶剂合物也包括在本发明的范围内。
含有胺官能团的式(I)化合物也可以形成N-氧化物。本文提及的含有胺官能团的式(I)化合物还包括N-氧化物。
当化合物含有数个胺官能团时，一个或多个氮原子可以被氧化形成N-氧化物。N-氧化物的具体实例为叔胺或含氮杂环的氮原子的N-氧化物。
可以通过采用氧化剂如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺来形成N-氧化物，参见例如Advanced Organic Chemistry(高等有机化学),Jerry March,第4版，Wiley Interscience，pages。更具体地说，N-氧化物可以通过L.W.Deady(Syn.Comm.1977,7,509－514)的方法制备，其中胺化合物与间氯过氧苯甲酸(mCPBA)反应，例如在惰性溶剂如二氯甲烷中反应。
本领域技术人员应当理解，可以在最后的脱保护阶段之前制备的式(I)化合物的某些被保护的衍生物可能本身不具有药理学活性，但是在某些情况下可以通过口服或肠道外给药，然后在体内代谢形成具有药理活性的本发明化合物。因此此类衍生物可以被描述为“前体药物”。本发明化合物的所有此类前体药物都包括在本发明的范围内。适用于本发明化合物的前体药物官能性的实例描述于Drugs of Today(今日药物),第19卷,第9期,1983,第499－538页以及Topics in Chemistry(化学话题),第31章,第306－316页和“Design of Prodrugs(前药设计)”,H.Bundgaard,Elsevier,1985,第1章(其公开内容引入本文作为参考)。本领域技术人员还应当理解，本领域技术人员已知为“前体部分”的某些部分(例如如H.Bundgaard在“Design of Prodrugs(前药设计)”中所述(其中公开的文献引入本文作为参考))可以置于适当官能团上，当本发明化合物中存在此类官能团时。
本发明化合物和各种盐的范围内还包括其多晶型物。
式(I)化合物可以以许多不同的几何异构和互变异构形式存在，式(I)化合物包括所有这些形式。为免生歧义，当化合物可以以多种几何异构或互变异构形式之一存在并且只有一种被具体描述或示出时，也包含式(I)的所有其它形式。
本发明包括本发明即式(I)化合物的所有可药用的同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数但原子质量或质量数不同于通常在自然界发现的原子质量或质量数的原子所代替。
适合于包含在本发明化合物中的同位素的实例包括下列元素的同位素：氢，例如2H(D)和3H(T)；碳，例如11C、13C和14C,；氟，例如18F；氮，例如13N和15N；氧，例如15O、17O和18O。
式(I)的某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究。式(I)化合物还可以具有有价值的诊断性质，因为它们可以用于检测或鉴定标记化合物与其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用被标记物标记的化合物，所述标记物例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、水母发光蛋白和萤光素酶)等。鉴于其容易结合和具有现成的检测手段，放射性同位素氚即3H(T)和碳-14即14C对此目的特别有用。
用较重的同位素例如氘(即2H(D))取代可以提供由更好的代谢稳定性所带来的某些治疗优势，例如增加体内半衰期或降低剂量需求，因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素如11C、18F、15O和13N的取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查靶点占用情况。
同位素标记的式(I)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术制备，或者根据与所附实施例和制备方法中所述类似的方法使用适当的同位素标记试剂代替以前使用的未标记试剂制备。
式(I)化合物的制备方法
在该部分内容中，如在本申请的所有其它部分中，除非上下文另有说明，提及式(I)时还包括如本文所定义的所有其它亚组及其实例。
本文所述的本发明化合物可以根据下面方法和流程中所示的逐步合成顺序制备。所述合成包括各种中心结构的制备，然后其能够选择与两个结合部分连接的连接基团的分支和长度。式(I)化合物可以根据本领域技术人员公知的合成方法制备。例如，本领域技术人员应当理解，保护基团的化学步骤和选择可以以任何顺序操作以使得合成成功。
本发明的另一方面提供了如上文中所定义的式(I)化合物的制备方法，其包括：
(a)通过使得式(II)化合物与式(III)化合物反应制备式(I)化合物，其中Y1代表–CONH-(即式(IA)化合物)：
Figure BDA0001687660830000221
其中S2、Y2、m、Cy、S1、X1、L和F如上文所定义；或者
(b)通过使得式(IV)化合物与式(V)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表–(CH2)3-NHCO-CH2-，Y2代表–O-(即式(IB)化合物)：
Figure BDA0001687660830000222
其中Y2、m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如上文所定义；或者
(c)通过使得式(IV)化合物与式(VI)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表–(CH2)3-NHCO-(CH2)2-(OCH2CH2)4-NHCO-CH2-，Y2代表–O-(即式(IC)化合物)：
Figure BDA0001687660830000223
其中Y2、m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如上文所定义；或者
(d)通过使得式(IV)化合物与式(VII)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表–(CH2)3-NH-CH2-，Y2代表键(即式(ID)化合物)：
Figure BDA0001687660830000224
其中m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如上文所定义；或者
(e)通过使得式(IV)化合物与式(VIII)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表–(CH2)3-NHCO-(CH2)4-CONH-CH2-，Y2代表键(即式(IE)化合物)：
Figure BDA0001687660830000231
其中m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如上文所定义，Succ代表琥珀酰亚胺；或者
(f)通过使得式(IV)化合物与式(IX)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表–(CH2)3-NHCO-，Y2代表键(即式(IF)化合物)：
Figure BDA0001687660830000232
其中m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如上文所定义；或者
(g)通过使得式(IIA)化合物与式(III)化合物反应制备式(I)化合物，其中Y1代表–CONH-，S1含有-CONH-基团(基式(IG)化合物)：
Figure BDA0001687660830000233
其中S2、Y2、m、Cy、S1、X1、L和F如上文所定义；和/或
(h)将式(I)化合物的被保护的衍生物去保护；和/或
(i)式(I)化合物或其被保护的衍生物互变为其它式(I)化合物或其被保护的衍生物。
方法(a)、(b)、(c)、(f)和(g)通常包含酰胺键形成反应，该反应包括在有机碱存在下、在有机溶剂中采用含磷酸盐的试剂、三嗪类试剂或含碳二亚胺的试剂活化羧酸。优选的条件包括HATU((1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐)与三乙胺或二异丙基乙胺在DMF或DMF和DMSO的混合物中；DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉-4-鎓氯化物或四氟硼酸盐)与无机碱在DMF中；或者HBTU与三乙胺在DMF中。
方法(d)通常包含还原胺化反应，该反应包括将通式(IV)的胺和通式(VII)的醛在惰性溶剂中的溶液与适当的还原剂一起搅拌。可以使用醛衍生物如缩醛或半缩醛而不是其母体。适当的还原剂包括氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷，在惰性溶剂如二氯甲烷、甲醇或THF存在下，可以任选加入乙酸。优选的条件包括甲基吡啶硼烷与乙酸在MeOH中于室温下。
方法(e)通常包括由预先制备的式(VIII)的活化酯和式(IV)的胺的酰胺键形成反应。优选的条件包括在室温下、在有或者没有添加有机碱例如三乙胺(例如实施例13，制备14)或二异丙基碳二亚胺的DMF溶液中，和碳酸盐碱水溶液在DMF中于室温下或者在DIPEA/TEA的DMF/氯仿/DMSO溶液中搅拌。
方法(h)通常包含任何适当的脱保护反应，其条件将取决于保护基团的性质。当保护基代表tBoc时，此类脱保护反应通常包括在适当的溶剂中使用适当的酸。例如，所述酸可以适当地含有三氟乙酸或盐酸，所述溶剂可以适当地包括二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二氧六环、甲醇或水。任选可以使用溶剂混合物，例如含水甲醇或乙酸乙酯/1,4-二氧六环。
过程(i)通常包括本领域技术人员已知的互变方法。例如，在式(I)化合物中，第一个取代基可以根据本领域技术人员已知的方法转化成第二个备选取代基。本领域技术人员已知用于将前体化合物转化为式(I)化合物的各种众所周知的官能团互变，描述于JerryMarch编写的Advanced Organic Chemistry(高等有机化学),第4版,John Wiley&Sons,1992。例如采用有机锡试剂(Stille反应)、格氏试剂的可能的金属催化的官能化反应和与氮亲核试剂的反应描述于'Palladium Reagents and Catalysts(钯试剂和催化剂)'[JiroTsuji,Wiley,ISBN 0-470-85032-9]和Handbook of OrganoPalladium Chemistry forOrganic Synthesis(有机合成的有机钯化学手册)[第1卷，由Ei-ichi Negishi编辑，Wiley，ISBN 0-471-31506-0]。
如果适当的话，可以在先前方法(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中描述的反应之前或之后进行一种或多种本领域技术人员已知的反应，它们以适当的顺序进行以实现对上文所定义的S2、Y2、m、Cy、S1、X1、Y1、L和F进行必要的取代以得到其它式(I)的化合物。可以在文献中发现其条件的此类反应的非限制性实例包括：
反应官能团的保护反应，
反应官能团的脱保护反应，
卤化反应，
脱卤化反应，
去烷基化反应，
胺、苯胺、醇和酚的烷基化和芳基化反应，
羟基上的Mitsunobu反应，
适当基团上的环加成反应，
硝基、酯、氰基、醛的还原反应，
过渡金属催化的偶合反应，
酰化反应，
磺酰基的磺酰化反应/引入反应，
酯基的皂化反应/水解反应，
酯基的酰氨化反应(amidification)或酯基转移反应，
羧基的酯化反应或酰氨化反应，
卤素交换反应，
采用胺、硫醇或醇的亲核取代反应，
还原胺化反应，
羰基和羟胺基团上的肟形成反应，
S-氧化反应，
N-氧化反应，
成盐反应。
可以根据流程1中所述方法由作为连接分子的关键中间体的式(X)化合物制备式(II)、(V)、(VI)和(IX)化合物。
Figure BDA0001687660830000261
其中m、Cy、Y1、S1、X1、S2、Y2、F和L如上文所定义、PG1为包含烯丙基、叔-丁基、甲基、乙基或苄基的保护基团，PG2为包含甲基、乙基或叔-丁基的正交(orthogonal)保护基团。
式(II)化合物可以根据方法步骤(iv)催化氢化介导的脱保护反应由式(X)化合物制备。优选的条件包括在氢气环境下(15－70psi)、在MeOH/EtOH或水或其任何组合中的10％Pd/C。或者，脱保护反应可以通过相转移反应介导。优选的条件包括TEA和水于室温下16小时。
式(V)化合物可以根据方法步骤(v)由式(X)化合物制备，如所用保护基团所要求的酸或碱介导的脱保护反应。当需要酸介导的脱保护条件时，优选的条件包括TFA、4M HCl的二氧六环溶液或者37％HCl水溶液以及必要时的DCM或水的共溶剂。当需要碱介导的条件时，优选的条件包括在水性介质(如甲醇或THF与水)中的氢氧化钠或氢氧化锂。当PG1表示烯丙基时，可以采用钯催化剂介导的脱保护。优选的条件包括四(三苯基膦)钯(0)与哌啶的THF溶液。
式(VI)化合物可以根据使用反应步骤(v)和(i)的一系列方法由式(X)化合物制备。式(VI)化合物可以如下制备：首先根据如前所述的方法步骤(v)采用适当的脱保护步骤，其次根据上面方法(a)中所述的方法步骤(i)通过与适当的胺的酰胺键反应，第三根据方法步骤(v)通过另一种适当的脱保护反应。
式(IX)化合物可以根据如上所述的方法步骤(iv)或(v)由式(X)化合物制备。
式(IIA)化合物可以根据流程1A中描述的方法由式(II)化合物和式(XIII)化合物制备：
Figure BDA0001687660830000271
其中F、S2、Y2、Cy和S1如上文所述，PG1为包含苄基的保护基团。
式(X)化合物可以根据流程2中所述方法由式(XI)化合物制备。
Figure BDA0001687660830000272
其中m和Cy如上文所定义，PG1为包含烯丙基、叔-丁基、甲基、乙基或苄基的保护基团，PG2为包含甲基、乙基或叔-丁基的正交保护基团，X为Cl、Br或I。
式(X)化合物可以根据方法步骤(vi)(烷基化反应)制备自式(XI)和(XII)化合物。典型的条件包括于室温下在极性有机溶剂中的无机碱。优选的条件包括在DMF中的碳酸钾。
当Cy为联苯基或三苯基时，式(XI)化合物可以通过使用Suzuki反应构建联/三苯基单元来制备。优选的条件包括在二氯甲烷中的四(三苯基膦)钯(0)或[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)复合物与碳酸钠、乙酸钾或碳酸氢钠在二氧六环和水中于100－110℃。当采用适当的所需保护基团时，例如TBS，可以使用氟化物介导的脱保护反应将此类保护基团脱保护。优选的条件包括于室温下在THF中的TBAF。
或者，其中Cy为联/三苯基时，式(X)化合物可以通过使用Suzuki反应直接制备，以采用如上文和本文所述的条件构建双/三苯基单元。
式(III)、(XII)和(XIII)化合物可以商购，或者根据本文所述的方法制备。
式(IV)和(VIII)化合物可以根据文献制备，或者根据本文所述的方法制备。
式(VII)化合物可以根据文献制备，或者根据本文所述方法制备(例如制备35)。
本领域技术人员应当理解，可以选择方法(a)至(f)或流程1和2中描述的步骤的适当组合以获得本文所述实施例和制备的最高收率。
应该理解，本文所述的某些中间体代表了本领域之前未知的新化合物。因此，根据本发明的另一方面，提供了选自式(II)、(IIA)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)或(XI)化合物的中间体化合物。
药用组合物
虽然式(I)化合物可以单独给药，但优选将其作为药物组合物(例如制剂)给药。
因此，根据另一方面，本发明提供了药物组合物和制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含(例如混合)至少一种其中L代表核酸适体的本发明化合物以及一或多种可药用的赋形剂和任选的其它治疗剂或预防剂，如本文所述。
可药用的赋形剂可以选自例如载体(例如固体、液体或半固体载体)、辅料、稀释剂、填充剂或膨胀剂、成粒剂、包衣剂、释放控制剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增稠剂、调味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或常规用于药物组合物中的任何其它赋形剂。下面更详细地阐述了用于各种类型的药物组合物的赋形剂的实例。
本文使用的术语“可药用的”指在合理医学判断范围内适合用于与受试者(例如人)的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，其不会产生过度的毒性(即一般认为安全(GRAS))、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，具有合理的效益/风险比。每种载体、赋形剂等在与该制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
含有本发明化合物的药物组合物可根据已知技术配制，参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),Mack Publishing Company,Easton,PA,USA。
药物组合物可以是适用于肠胃外、鼻内、支气管内、舌下、眼、耳、直肠、阴道内或透皮给药的任何形式。当组合物预计用于肠胃外给药时，它们可以配制用于静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下给药，或者通过注射、输液或其它传递方式直接传递到靶器官或组织中。所述传递可以通过快速注射、短期输液或长期输液进行，可以通过被动传递或通过使用适当的输液泵或注射器泵来进行。
适用于肠胃外给药的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液制剂，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精络合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳剂)、用于形成脂质体的脂质体成分、用于形成聚合物凝胶的可凝胶化聚合物、冻干保护剂以及尤其是用于使活性成分稳定为可溶形式并且使制剂与预期接受者的血液等渗的试剂的组合。用于肠胃外给药的药物制剂还可以采用水性和非水性无菌混悬液的形式，其可以包括助悬剂和增稠剂(R.G.Strickly，Solubilizing Excipients inoral and injectable formulations(在口服和注射制剂中的增溶辅料)，PharmaceuticalResearch，第21卷(2)2004，第201－230页)。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿、小瓶和预充式注射器，可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在即将使用前仅需要添加无菌液体载体，例如注射用水。
药物制剂可以通过将本发明化合物冷冻干燥进行制备。冷冻干燥是指将组合物冻干的过程。因此，冻干和冷冻干燥在本文中作为同义词使用。
即时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
用于肠胃外注射的本发明的药物组合物还可以包含可药用的无菌水性或非水性溶液、分散体、混悬液或乳液以及用于在即将使用前重新配制成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。
适当的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其适当的混合物、植物油(例如葵花油、红花油、玉米油或橄榄油)和可注射用的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用增稠剂或包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持需要的粒度以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
本发明的组合物还可以含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保避免微生物的作用。也可能需要包含调节张力的试剂，如糖、氯化钠等。可注射药物形式的延长吸收可以通过包含能够延迟吸收的成分(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在本发明的一个优选实施方案中，药物组合物为适合静脉内给药的形式。例如通过注射或输液给药。对于静脉内或皮下给药，溶液可以原样给药，或者可以在给药前注入输液袋(含有可药用的赋形剂，例如0.9％盐水或5％葡萄糖)中。
在另一个优选的实施方案中，药物组合物为适合于皮下(s.c.)给药的形式。
本发明的化合物可以与载体一起配制并以纳米颗粒的形式施用，纳米颗粒的增加的表面积有助于它们的吸收。另外，纳米颗粒提供了直接渗透到细胞内的可能性。纳米粒子药物传递系统描述于Ram B Gupta和Uday B.Kompella编辑的“Nanoparticle Technologyfor Drug Delivery(用于药物传递的纳米粒子技术)”，Informa Healthcare,ISBN9781574448573,公开于2006年3月13日。用于药物传递的纳米粒子也描述于J.Control.Release,2003,91(1－2),167－172和Sinha等,Mol.Cancer Ther.August 1,(2006)5,1909。
药物组合物通常包含约1％(w/w)至约95％(w/w)的活性成分和99％(w/w)至5％(w/w)的可药用的赋形剂或赋形剂的组合。优选所述组合物包含约20％(w/w)至约90％(w/w)的活性成分和80％(w/w)至10％的可药用的赋形剂或赋形剂的组合。药物组合物包含约1％至约95％，优选约20％至约90％的活性成分。本发明的药物组合物可以是例如单位剂量形式，例如安瓿、小瓶、栓剂、预填充注射器、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
可药用的赋形剂可以根据制剂的所需物理形式来选择，可以例如选自稀释剂(例如固体稀释剂，如填充剂或膨胀剂；液体稀释剂，如溶剂和共溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、释放控制剂(例如释放阻滞剂或释放延迟聚合物或蜡)、粘合剂、成粒剂、颜料、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、张力调节剂和包衣剂。
本领域技术人员应当具有选择用于制剂中的成分的适当量的专业知识。例如，片剂和胶囊通常含有0－20％的崩解剂、0－5％的润滑剂、0－5％的助流剂和/或0－99％(w/w)的填充剂/或膨胀剂(取决于药物剂量)。它们也可以含有0－10％(w/w)的聚合物粘合剂、0－5％(w/w)的抗氧化剂、0－5％(w/w)的颜料。此外，缓释片剂还可以含有0－99％(w/w)控制释放(例如延迟释放)的聚合物(取决于剂量)。片剂或胶囊的薄膜包衣通常含有0－10％(w/w)的聚合物、0－3％(w/w)的颜料和/或0－2％(w/w)的增塑剂。
肠道外或皮下制剂通常含有0－20％(w/w)缓冲剂、0－50％(w/w)共溶剂和/或0－99％(w/w)注射用水(WFI)(取决于剂量和是否冷冻干燥)。肌内注射用制剂也可以含有0－99％(w/w)的油。
本发明的化合物也可以配制成固体分散体。固体分散体是两种或更多种固体的均匀的极细分散相。众所周知固体溶液(分子分散体系)是一种固体分散体，用于制药技术(参见(Chiou和Riegelman,J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971))，用于增加溶出速度和提高水溶性差的药物的生物利用度。
药物制剂可以以单一包装中包含整个疗程的“患者包装”提供给患者，通常为泡罩包装。患者包装比传统处方有优势，其中药剂师可以将患者的药物供给从大量供应中分离出来，因为患者随时可以查看包含在患者包装中的包装插页，而这通常在患者处方中并不存在。已经显示包装说明书的加入可以改善患者对医生指令的依从性。患者包装的一个实例包括预充式注射器。这种预填充注射器已经含有药物。用喷嘴帽密封与针头连接的预装注射器的前端部分。在注射之前，将喷嘴帽从前端部分移除，将针头与其连接。然后通过将柱塞杆推向前端部分滑动垫圈，从而排出药物。
用于鼻腔传递的组合物包括软膏、乳膏、喷雾剂、贴片、凝胶、滴液和植入物(例如眼内植入物)。此类组合物可以根据已知的方法配制。
用于直肠或阴道内给药的制剂的实例包括阴道栓剂和栓剂，其可以例如由含有活性化合物的适合成型的可塑或蜡类材料形成。活性化合物的溶液也可以用于直肠给药。
通过吸入给药的组合物可以采取可吸入粉末组合物或者液体或粉末喷雾剂的形式，可以采用粉末吸入器装置或气雾分配装置以标准形式给药。此类设备是众所周知的。对于吸入给药，粉末制剂通常包含活性化合物以及惰性固体粉末稀释剂如乳糖。
本发明的化合物通常以单位剂型存在，因此通常含有足够的化合物以提供所需水平的生物活性。例如，制剂可以含有1纳克至2克的活性成分，例如，从1纳克到2毫克的活性成分。在这些范围内，化合物的特定亚范围为0.1毫克至2克活性成分(更通常为10毫克至1克，例如50毫克至500毫克)或1微克至20毫克(例如1微克至10毫克，例如0.1毫克至2毫克活性成分)。
将活性化合物以足以达到所需治疗效果的量施用于需要的患者(例如人或动物患者)。
治疗用途
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物，用于治疗。
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物，用于治疗癌症或由感染物介导的疾病。
根据本发明的另一方面，提供了本文所定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物在生产药物中的用途，所述药物用于治疗癌症或由感染物介导的疾病。
根据本发明的另一方面，提供了治疗癌症或由感染物介导的疾病的方法，该方法包括给予需要的个体本文所定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物。
本发明化合物通常给药于需要此类给药的个体，例如人类或动物患者，优选人类。
典型地，本发明的化合物以治疗或预防有用的量且通常是无毒的量施用。然而，在某些情况下(例如在威胁生命的疾病的情况下)，施用本发明化合物的益处可能胜过毒性作用或副作用的缺点，在这种情况下以与一定程度的毒性相关的量施用本发明化合物可以认为是合理的。
本发明化合物可以在持续的时间内(即长期给药)给药以保持有益的治疗效果，或者可以仅短时间给药(即急性给药)。或者，它们可以以连续方式或以能够提供间歇剂量的方式(例如脉冲方式)给药。
本发明化合物的典型日剂量可以在每千克体重100皮克至100毫克的范围内，更通常为每千克体重5纳克至25毫克，更通常为每千克体重10纳克至15毫克(例如10纳克/千克至10毫克/千克，更通常为1微克/千克至20毫克/千克，例如1微克至10毫克/千克)，但是可以在需要时施用更高或更低剂量。例如，本发明化合物可以每天或者每2或3或4或5或6或7或10或14或21或28天重复给药。或者，本发明化合物可以通过输注每天多次给药。
本发明的化合物可以以一定的剂量范围给药，例如1至1500mg，2至800mg或5至500mg，例如2至200mg或10至1000mg，剂量的具体实例包括10、20、50和80mg。本发明的化合物可以每天给药一次或多于一次。本发明的化合物可以连续给药(即，在治疗方案的持续时间内每天服用而不中断)。或者，本发明的化合物可以间歇给药(即，在整个治疗方案持续时间内，连续给药一段时间，例如一周，然后停止一段时间，例如一周，然后连续服用另一段时间，例如一周等)。涉及间歇给药的治疗方案的实例包括其中给药周期为一周、休息一周的治疗方案；或二周给药，休息一周；或三周给药，休息一周；或两周给药，休息两周；或四周给药，休息两周；或一周给药，休息三周-进行一个或多个周期，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个循环。
在一个特定的给药方案中，给予患者本发明化合物的输液，每天一小时，至多十天，特别是一周至多五天，以期望的间隔重复治疗，例如二至四周，特别是每隔三周。
更特别地是，患者可以每天一小时的时间输注本发明化合物5天，治疗每三周重复一次。
在另一个具体的给药方案中，患者在30分钟至1小时内输注，随后进行可变持续时间的维持输注，例如1至5小时，例如3小时。
在进一步的特定给药方案中，给患者连续输注12小时至5天，特别是连续输注24小时至72小时。
然而，最终施用的本发明化合物的量和所用组合物的类型应当与待治疗的疾病或生理状况的性质一致，这应当由医师决定。
应该理解，本发明的化合物可以作为单一药剂使用或与其它治疗药物组合使用。例如，可以根据下文所述进行组合试验：Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis ofdose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzymeinhibitors(剂量-效应关系的定量分析：多种药物或酶抑制剂的联合作用).Adv EnzymeRegulat 1984；22:27－55。
当本发明化合物与1、2、3、4或更多种其它治疗药物(优选一种或两种，更优选一种)在联合治疗中给药时，可以同时或依次给予药物。在后一种情况下，两种或更多种药物可以在一段时间内以足以确保达到有利效果或协同效果的量和方式给药。当按顺序给药时，它们可以以密集的间隔给药(例如在5－10分钟的时间段内)或以较长的间隔给药(例如，间隔1、2、3、4或更多小时，或者当需要时甚至更长的时间间隔)，精确的剂量方案应当与治疗药物的性质一致。这些剂量可以例如在每个疗程中一次、两次或更多次施用，其可以例如每7、14、21或28天重复施用。
应该理解，优选的给药方法和顺序以及组合中每种组分的各自的剂量和方案应当取决于所施用的具体的其它药物和本发明的化合物、其给药途径、待治疗的具体肿瘤和待治疗的特定宿主。本领域技术人员采用常规方法并参考此本文阐述的信息可以容易地确定最佳给药方法和顺序以及剂量和方案。
本发明化合物与一或多种其它治疗药物以组合形式给药时的重量比可以由本领域技术人员确定。所述比例和确切的给药剂量和频率取决于使用的本发明的具体化合物和其它治疗药物、待治疗的具体病症、待治疗病症的严重程度、年龄、体重、性别、饮食、给药时间和具体患者的一般身体状况、给药方式以及个体可能服用的其它药物，如本领域技术人员所熟知的。此外，显而易见的是，根据治疗个体的反应和/或根据处方本发明化合物的医师的评估，有效的每日量可以降低或增加。本发明化合物和另一种治疗药物的具体重量比可以为1/10至10/1，更特别为1/5至5/1，甚至更特别为1/3至3/1。
抗癌治疗
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的其中L表示核酸适体的式(I)的化合物，用于治疗癌症。
根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的其中L表示核酸适体的式(I)化合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途。
根据本发明的另一方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括向需要的个体给予如本文所定义的其中L表示核酸适体的式(I)化合物。
可以治疗(或抑制)的癌症(以及它们的良性相对物)的实例包括但不限于：上皮来源的肿瘤(各种类型的腺瘤和癌，包括腺癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌和其它癌)，例如膀胱癌和泌尿道癌，乳癌、胃肠道癌(包括食管、胃、小肠、结肠、直肠和肛门)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆管系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃腺癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤及附件癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育不良性痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病，淋巴瘤)和癌前病变血液系统疾病和交界恶性疾病，包括血液系统恶性肿瘤和相关的淋巴谱系疾病(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B-细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、不明原因的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病)和血液系统恶性肿瘤及相关的骨髓谱系疾病(例如急性骨髓性白血病[AML]、慢性粒细胞白血病[CML]、慢性粒单细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性疾病如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓炎纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病)；间质来源的肿瘤，例如软组织肉瘤、骨或软骨例如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道基质瘤、良性和恶性组织细胞瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤；中枢或外周神经系统肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌肿瘤和甲状腺髓样癌)；眼部及其附件肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；小儿和胚胎肿瘤(例如成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤和原始神经外胚层瘤)；或使患者易患恶性肿瘤的综合征，先天性或非先天性的(例如着色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum))。
在一个实施方案中，所述癌症选自肺癌、头颈癌以及结肠直肠癌。
可以与本发明化合物一起施用(无论是同时或以不同时间间隔)的其它抗癌治疗药物的实例包括但不限于：
●拓扑异构酶I抑制剂；
●抗代谢药；
●微管蛋白靶向药；
●DNA粘合剂和拓扑异构酶II抑制剂；
●烷化剂；
●单克隆抗体；
●抗激素药；
●信号转导抑制剂；
●蛋白酶体抑制剂；
●DNA甲基转移酶；
●细胞因子和维甲酸；
●染色质靶向疗法；
●放疗；和
●其它治疗或预防药物，例如免疫治疗药物。
本发明的化合物也可以与非化学疗法结合施用，例如放射疗法、光动力疗法、基因疗法、手术和控制饮食。
在用于与另一种化学治疗药物的联合疗法时，本发明的化合物和一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗药物可以例如一起配制成含有2、3、4或更多种治疗药物的剂型，即在单一药用组合物中包含所有组分。在另一个实施方案中，单一的治疗剂可以分别配制并以试剂盒的形式提供，任选包含其使用的说明书。
抗感染治疗
根据本发明的另一方面，提供了如本文定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物，用于治疗由感染物介导和/或引起的疾病或病症。
根据本发明的另一方面，提供了如本文定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物在生产药物中的用途，所述药物用于治疗由感染物介导和/或引起的疾病或病症。
根据本发明的另一方面，提供了治疗由感染物介导和/或引起的疾病或病症的方法，该方法包括给予需要的个体本文定义的其中L代表核酸适体的式(I)化合物。
感染物的实例包括任何病原体，例如细菌、真菌、寄生虫或病毒。因此，在一个实施方案中，由感染物介导和/或引起的疾病或病症为细菌感染。
例如，细菌感染的实例包括以下细菌的感染：葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)(MRSA))，梭状芽孢杆菌属(Clostridia sp)(例如艰难梭菌(Clostridium difficile)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum))，肠杆菌属(Enterobacter species)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，志贺氏菌属(Shigella sp.)例如志贺氏痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)，弯曲菌属(Campylobacter sp.)例如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)，肠球菌属(Enterococcus sp.)例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)，链球菌属(Streptococcal species)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurim)，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，衣原体属(Chlamydia species)，梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，革兰氏阴性病原体(Gram-negative pathogens)如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)(包括对一或多种抗生素有耐药性的菌株，特别是多重耐药(MDR)菌株)。
实施例
现在将通过参考下面实施例中描述的具体实施方案说明本发明，但不限于此。化合物的名称采用自动命名软件包例如AutoNom(MDL)或ChemDraw，或由化学品供应商命名。
提供以下合成方法以说明所使用的方法；对于给定的制备或步骤，所用的前体可能不一定源于根据给出的描述中的步骤合成的单独的批次。
分析方法
LCMS
系统：LCMS Agilent 1100(四元泵)；质谱仪：Waters Micromass ZQ
柱：XBridge C18 4.6×50mm，5μm
溶剂：A＝水；B＝乙腈；C＝10mm甲酸铵的水溶液；D＝0.05％甲酸的乙腈溶液
柱温：25℃，进样量：5μL
LCMS方法A：4.5分钟酸性运行
时间(mins) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/min)
0 95 0 0 5 2.0
3.5 0 95 0 5 2.0
4.5 0 95 0 5 2.0
4.6 95 0 0 5 2.0
LCMS方法B：4.5分钟缓冲运行
时间(mins) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/min)
0 0 5 95 0 2.0
3.5 0 95 5 0 2.0
4.5 0 95 5 0 2.0
4.6 0 5 95 0 2.0
LCMS方法C：8分钟酸性运行
Figure BDA0001687660830000391
/>
Figure BDA0001687660830000401
LCMS方法D：8分钟缓冲运行
时间(mins) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/min)
0 0 5 95 0 2.0
3.5 0 95 5 0 2.0
8.0 0 95 5 0 2.0
8.10 0 5 95 0 2.0
系统：LCMS Agilent 1100(四元泵)；质谱：PE SCIEX API 2000MS/MS
柱：Agilent Poroshell 120柱，SB-C18,4.6mm×30mm,2.7μm
溶剂：A＝水；B＝0.1％甲酸的乙腈溶液
柱温：20℃，进样量：5μL
LCMS方法E：4.5分钟酸性运行
时间(mins) A(％) B(％) C(％) D(％) 流速(mL/min)
0.5 95 5 0 5 2.0
1.5 0 100 0 5 2.0
4.0 0 100 0 5 2.0
4.3 95 5
4.5 95 5 0 5 2.0
NMR
NMR详情记录在Oxford Instruments AS400或Bruker Avance III Ultrashieldplus 400MHz上。
反相HPLC
当实施例和制备使用反相HPLC纯化时，可以采用以下条件：
系统：Gilson TRILUTIONTM包括：Gilson 215液体处理器；Gilson 811C动态混合器；Gilson 306泵，Gilson测压模块(manometric module)；Gilson 155UV/Vis检测器，Gilson 819进样量控制器(injection value actuator)和Gilson valvemate II量控制器。
方法：采用Phenomenex Luna C-18，5μm,150×21.20mm，
Figure BDA0001687660830000411
(产品型号00F-4041-P0)柱或Phenomenex Magellen C-18,5μm,150×10,00mm(产品型号00F-4118-N0)在单一实验中按照说明的方法进行实验，在λmax以2mL级分收集。
或者，制备性HPLC可以在室温下采用配备Agilent Pursuit 5柱(C18,5μm,21.2mm×250mm)的Varian自动纯化系统进行，由Varian Star软件(版本6.41)控制。
流动相由乙腈和水组成，均含有0.1％v/v甲酸。
方法：
时间(min) 0 2 3 13 14 21 22 25
水(％) 95 95 50 10 5 5 95 95
乙腈(％) 5 5 50 90 95 95 5 5
流速：20mL/min
MALDI-ToF
当实施例的分子量超过1500Da时，MALDI-ToF数据采用Bruker ultrafleXtreme获得。
缩写
当采用下列缩写时，其含义如下：
AcOH为乙酸；
aq.为含水的；
BBr3为三溴化硼；
Boc为叔-丁基氧基羰基；
br s为宽单峰；
δ为以ppm计的化学位移；
d为双峰；
dd为双双峰；
ddd为双双双峰；
DCM为二氯甲烷；
DIPEA为二异丙基乙胺；
DMF为二甲基甲酰胺；
DMTMM为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物或四氟硼酸盐；
DMSO为二甲基亚砜；
DMSO-d6为全氘化的二甲基亚砜NMR溶剂；
DNA为脱氧核糖核酸；
ES为电喷雾离子化技术；
EtOH为乙醇；
EtOAc为乙酸乙酯；
HATU为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基鎓六氟磷酸盐；
HBTU为O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基鎓六氟磷酸盐；
HFIP为六氟异丙醇；
HPLC为高效液相色谱；
IMS为工业甲基化酒精(通常在EtOH中含有5％－10％的MeOH)；
μ为微；
m为多重峰；
MALDI-ToF为基质辅助激光解吸电离-飞行时间；
MeCN为乙腈；
MeOH为甲醇；
mins为分钟；
mL为毫升；
MS为质谱；
NH3为氨或氢氧化铵(28％的水溶液)；
NMR为核磁共振；
OD为光密度；
Pd/C为(通常5％－10％)钯炭氢化催化剂(水-湿)；
Pd(PPh3)4为四三苯膦钯(0)；
ppm为百万分之；
q为四重峰；
RNA为核糖核酸；
RP为反相；
Rt为保留时间；
r.t.为室温；
s为单峰；
t为三重峰；
TBAF为四-正-丁基氟化铵；
TBME为叔-丁基甲醚；
TEA为三乙胺；
TEAA为三乙基乙酸铵；
TBS为叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基；
TBTU为O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基鎓四氟硼酸盐；
TFA为三氟乙酸；
TFAA为三氟乙酸酐；和
THF为四氢呋喃。
当述及α-Gal时，是指下列中间体：
3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)胺
Figure BDA0001687660830000441
该中间体可以根据Bovin等(Mendeleev Communications(2002),(4),143－145)所述的方法制备。
制备1－137描述了用于从偶联到实施例中所需的关键连接分子制备中间体的方法，如上文所述的方法(a)－(g)和流程1－2所述进行。
制备1
1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二({[(14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲氧基})苯基]苯氧基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
Figure BDA0001687660830000442
将溶于DCM:TFA:H2O(10:10:1v/v/v,5mL)中的1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]苯氧基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(制备30,30.9mg,19.3μmol)溶液于室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩，与甲苯/二氧六环(1:1v/v,3×5mL)共沸，获得目标化合物，为灰白色固体。将固体溶于DMF(1mL)获得储备溶液，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法A：Rt＝1.88mins，ES+MS m/z 1431.4[M+H]+
制备2
1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷(dodecaoxanonatriacontan)-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
Figure BDA0001687660830000451
目标化合物根据制备1所述方法制备。
LCMS方法A：Rt＝1.97mins，ES-MS m/z 1310.2[M-H]-
前体：制备21
制备3
3-(2-氧代-2-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)乙氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830000452
目标化合物根据制备10所述方法采用制备44制备，可以直接用于下一步骤。
制备4
2-(4-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000461
目标化合物根据制备1所述方法采用制备26制备。
LCMS方法A：Rt＝1.52mins，ES+MS m/z 465.3[M+H]+
制备5
2,2',2”-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸
Figure BDA0001687660830000462
目标化合物根据制备1所述方法采用制备29制备。
LCMS方法A：Rt＝1.66mins，ES+MS m/z 689.4[M+H]+
制备6
1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-{[(14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲氧基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
Figure BDA0001687660830000463
将溶于二氧六环(1mL)和HCl水溶液(37％的水溶液,1mL)中的1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(制备27,10.0mg,5.7μmol)的溶液于室温下搅拌2小时。将反应物真空浓缩，与甲苯(2×5mL)共沸，获得目标化合物，为无色油状物，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法A：Rt＝1.93mins，ES+MS m/z 1633.8[M+H]+
制备7
2,2',2”,2”'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四乙酸
Figure BDA0001687660830000471
目标化合物根据制备1所述方法采用制备28制备，可以直接用于下一步骤。
LCMS方法A：Rt＝1.52mins，ES+MS m/z 465.3[M+H]+
制备8
2-((2-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)喹啉-4-基)氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000481
目标化合物根据制备1所述方法采用制备32制备。
LCMS方法E：Rt＝2.99mins，ES+MS m/z 516.0[M+H]+
制备9
2-((3'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000482
目标化合物根据制备1所述方法采用制备33制备。
LCMS方法E：Rt＝3.00mins，ES+MS m/z 541.0[M+H]+
制备10
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-(羧基甲氧基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000483
向2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯氧基)乙酸乙酯的MeOH/水(制备23,1:1v/v,1mL,10.0μmol)的溶液中加入2M NaOH水溶液(30μL,60μmol)，将反应物于室温下搅拌1小时。反应物采用2M HCl水溶液酸化，真空浓缩。将残留物与甲苯共沸(3×4mL)，获得目标化合物，为奶油色固体，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法B：Rt＝1.58mins，ES+MS m/z 1139.1[M+H]+
制备11
2-(3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000491
目标化合物根据制备10所述方法采用制备19制备。
LCMS方法A：Rt＝1.71mins，ES+MS m/z 465.2[M+H]+
制备12
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000492
目标化合物根据制备10所述方法采用制备20制备。
LCMS方法A：Rt＝1.89mins，ES+MS m/z 1062.8[M+H]+
制备13
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二乙酸
Figure BDA0001687660830000501
目标化合物根据制备10所述方法采用制备22制备，可以直接用于下一步骤。
制备14
2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-氧代-6-((3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基)氨基)己酸酯
Figure BDA0001687660830000502
向二(N-琥珀酰亚胺基)己二酸酯(制备34,187mg,0.55mmol)在二甲基甲酰胺(4mL)和氯仿(4mL)中的悬浮液中加入6-(3-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄胺(制备48,50mg,0.11mmol)和三乙胺(0.016mL,0.12mmol)，将反应混合物于室温下搅拌20小时。将反应物真空浓缩，采用硅胶柱色谱纯化，采用2.5－25％的甲醇二氯甲烷溶液洗脱。将获得的固体用DCM研磨，过滤，获得为白色固体的目标化合物(27mg,38％)。可以直接用于下一步骤。
制备15
2-(3-((6-氧代-6-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)己酰氨基)甲基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000503
向溶于MeOH(1mL)、THF(2mL)和水(1mL)中的2-(3-((6-氧代-6-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)己酰氨基)甲基)苯氧基)乙酸甲酯(制备38,35mg,0.06mmol)溶液中加入LiOH单水合物(5mg,0.1mmol)。将反应物于室温下搅拌6小时，然后真空浓缩。将残留物通过加入1M HCl酸化，真空浓缩，获得目标化合物(17mg,59％)，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法E：Rt＝3.02mins，ES+MS m/z 578[M+H]+
制备16
3',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000511
向溶于IMS(3.4mL)的3',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备36,34mg,21.2μmol)中加入10％Pd/C(3.40mg)。将反应物置于氢气环境中(50psi)，于室温下搅拌3小时。采用注射滤器过滤除去催化剂，真空浓缩，获得为无色固体的目标化合物(33mg,>99％)。
LCMS方法A：Rt＝1.53mins，ES+MS m/z 757.0[M+2H]+/2，理论质量：1512.4
制备17
3',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000521
向溶于MeOH/水(1:1v/v,10mL)的4',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备49,73.0mg,45.5μmol)中加入10％Pd/C(20mg)。将反应物置于氢气环境中(70psi)于室温下搅拌3小时。通过Dicalite过滤除去催化剂，真空浓缩。将残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,4g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的2－30％MeCN/水洗脱)，获得为无色固体的目标化合物(64.1mg,93％)。
LCMS方法A：Rt＝1.32mins，ES+MS m/z 1513.5[M+H]+
制备18
1-[2-(4-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-{[(14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲氧基}苯基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
Figure BDA0001687660830000531
目标化合物根据制备1所述方法制备，采用1-[2-(4-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(制备25,10.0mg,5.7mol)。
LCMS方法B：Rt＝1.93mins，ES-MS m/z 1108.2[M-H]-
制备19
2-(3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830000532
向溶于DMF(1mL)的2-(3-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯三氟乙酸盐(制备50,87.0mg,229μmol)中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸酯(85.9mg,252μmol)和TEA(95.7μL,686μmol)。将反应物于室温下搅拌1小时，然后真空浓缩。将残留物溶于DMF(1mL)，10分钟内于室温搅拌下加入NH4OH(2滴)。过滤获得的沉淀物，用DMF洗涤(2×2mL)。真空浓缩合并的有机萃取液，将残留物通过硅胶柱色谱纯化，采用5－15％的MeOH的DCM溶液洗脱，获得为无色玻璃状物的目标化合物(47.5mg,42％)。
LCMS方法A：Rt＝2.03mins，ES+MS m/z 493.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.50(1H,t),7.95(1H,t),7.45-7.35(3H,m),7.10(1H,dd),6.40(1H,s),6.35(1H,s),5.75(1H,s),4.85(2H,s),4.30-4.25(1H,m),4.15(2H,q),4.10-4.05(1H,m),3.25-3.15(2H,m),3.10－3.05(1H,m),2.80(1H,dd),2.60-2.55(1H,m),2.10-2.05(3H,m),1.65-1.55(1H,m),1.55-1.40(3H,m),1.35-1.25(2H,m),1.20(3H,t)。
制备20
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸乙基酯
Figure BDA0001687660830000541
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-(3-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯三氟乙酸盐(制备50,87.0mg,229μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸酯(35.0mg,37.0μmol)并分离，为无色油状物(29.2mg,66％)。
LCMS方法A：Rt＝2.11mins，ES+MS m/z 1092.9[M+H]+
制备21
1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000542
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸的DMF溶液(制备12,500μL,17.4μmol)和1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(5.3μL,17.4μmol)，分离，为无色油状物(14.5mg,61％)。
LCMS方法A：Rt＝2.26mins，ES-MS m/z 1366.3[M-H]-
制备22
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二乙酸二乙酯
Figure BDA0001687660830000551
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-{3-[(2-氨基乙基)氨基甲酰基]-5-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯氧基}乙酸乙酯三氟乙酸盐(146mg,426μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸酯(制备64)，分离，为无色膜状物(117mg,46％)。
LCMS方法B：Rt＝2.23mins，ES+MS m/z 595.2[M+H]+
制备23
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯氧基)乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830000552
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-{3-[(2-氨基乙基)氨基甲酰基]-5-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯氧基}乙酸乙酯三氟乙酸盐(制备64,41.2mg,85.0μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸乙酯。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,12g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的2－25％的MeCN/水洗脱)，获得为澄清油状物的目标化合物(55mg,60％)，将其溶于MeOH/H2O(1:1v/v,4.6mL)制备储备溶液，用于下一步骤。
LCMS方法B：Rt＝2.26mins，ES+MS m/z 1195.1[M+H]+
制备24
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000561
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用4',5-二(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备63,174mg,378μmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(163mg,568μmol)，分离为无色固体(181mg,66％)。
LCMS方法A：Rt＝3.03mins，ES+MS m/z 728.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.75-7.70(1H,m),7.65-7.60(2H,m),7.35-7.30(2H,m),7.05-7.00(2H,m),4.75(2H,s),4.65(2H,s),4.40(1H,dd),4.15(1H,dd),3.55-3.45(4H,m),3.35-3.30(2H,m)3.05-3.00(1H,m),2.85-2.80(1H,m),2.65-2.60(1H,m),2.30,(1H,s),2.20(2H,td),1.65-1.60(2H,m),1.50(18H,s),1.50-1.45(2H,m),1.40-1.35(3H,m)。
制备25
1-[2-(4-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基}苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000571
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸(制备39,20.0mg,32.6μmol)和1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(24.7μL,81.5μmol)，分离为无色油状物(21.8mg,55％)。
LCMS方法A：Rt＝2.70mins，ES+MS m/z 1222.0[M+H]+
制备26
2-(4-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000572
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用4-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸(WO 2011/71570A1,137mg,543μmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(155mg,543μmol)，分离为无色固体(205mg,72％)。
LCMS方法B：Rt＝2.30mins，ES+MS m/z 521.3[M+H]+
制备27
1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯氧基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000581
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-(羧基甲氧基)苯氧基)乙酸(制备10,19mg,15μmol)和1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(11.4μL,37.5μmol)，分离为无色油状物(10.0mg,38％)。
LCMS方法A：Rt＝2.60mins，ES+MS m/z 1746.8[M+H]+
制备28
2,2',2”,2”'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四乙酸四-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000591
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用3',4,5',6-四(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备77,130mg,177μmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(50.7mg,177μmol)，分离为无色固体(81mg,46％)。
LCMS方法B：Rt＝3.61mins，ES+MS m/z 987.8[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.70(1H,t),8.20(1H,s),7.10-7.05(1H,m),6.80(2H,d),6.45(1H,s),6.30(1H,s),5.80(1H,s),5.10(1H,s),4.60(2H,s),4.50(4H,s),4.45(2H,s),4.40-4.35(1H,m),4.20-4.15(1H,m),3.70－3.55(1H,m),3.55-3.40(1H,m),3.05-3.00(1H,m),2.80(1H,dd),2.60(1H,d),2.25-2.10(2H,m),1.70-1.55(3H,m),1.55(9H,s),1.50(18H,s),1.45(9H,s),1.40-1.30(3H,m)。
制备29
2,2',2”-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000592
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用3',5,5'-三(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备71,152mg,258μmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(79.3mg,258μmol)，为黄色膜状物(166mg,75％)。
LCMS方法B：Rt＝3.30mins，ES+MS m/z 857.7[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.00(1H,t),7.65(1H,s),7.40(1H,s),7.20(1H,s),6.90-6.85(1H,m),6.80(2H,d),6.45(1H,t),6.20(1H,s),5.45(1H,s),4.60(2H,s),4.50(4H,s),4.45-4.40(1H,m),4.20-4.15(1H,m),3.55(2H,m),3.50－3.40(2H,m),3.05-3.00(1H,m),2.80(1H,dd),2.60(1H,d),2.15(2H,t),1.70-1.55(4H,m),1.45(27H,s),1.30(2H,s)。
制备30
1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二({[15-(叔-丁氧基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]苯氧基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000601
向溶于DMF(500μL)的2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二(羧基甲氧基)苯基]苯氧基}乙酸(制备5,20.0mg,29.0μmol)中加入HATU(44.0mg,116μmol)和DIPEA(40.5μL,232μmol)。1分钟后，加入1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(35.0μL,116μmol)，将反应物于室温下、氮气环境中搅拌3小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(BiotageSP1,4g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN水溶液洗脱)，获得目标化合物，为无色油状物(30.9mg,67％)。
LCMS方法B：Rt＝2.96mins，ES+MS m/z 599.7[M+H]+
制备31
4-羟基-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)喹啉-2-甲酰胺
Figure BDA0001687660830000611
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用4-羟基喹啉-2-甲酸(200mg,1.06mmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(303mg,1.06mmol)，分离为灰白色固体(196mg,40％)。可以直接用于下一步骤。
制备32
2-((2-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)喹啉-4-基)氧基)乙酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000612
目标化合物根据制备57所述方法制备，采用4-羟基-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)喹啉-2-甲酰胺(制备31，196mg,0.43mmol)，分离为绿色固体(167mg,68％)。
LCMS方法E：Rt＝3.14mins，ES+MS m/z 572.0[M+H]+
制备33
2-((3'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-4-基)氧基)乙酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000621
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用4'-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备60,226mg,0.69mmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(197mg,0.69mmol)，分离为绿色固体(511mg,>100％)。
LCMS方法E：Rt＝3.21mins，ES+MS m/z 597.0[M+H]+
制备34
二(N-琥珀酰亚胺基)己二酸酯
Figure BDA0001687660830000622
于0℃将三氟乙酸酐(3.80mL,27.3mmol)加至含有己二酸(2.0g,13.70mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(3.15g,27.3mmol)和吡啶(4.4mL,54.7mmol)的氯代苯(17mL)悬浮液中。将反应混合物于0℃搅拌15分钟，然后于室温下搅拌20小时。过滤产物，用乙醇洗涤，获得白色固体。将固体用乙腈重结晶，获得目标化合物(2.45g,52％)。
LCMS方法E：Rt＝3.00mins，ES+MS m/z 341.0[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.81(8H,s),2.77-2.70(4H,m),1.78-1.62(4H,m)。
制备35
3-甲酰基-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺
Figure BDA0001687660830000623
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用3-羧基苯甲醛(100mg,0.67mmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(190mg,0.67mmol)，分离为黄色固体(168mg,60％)。
LCMS方法E：Rt＝2.90mins，ES+MS m/z 419.0[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 10.08(1H,s),8.74(1H,t),8.37(1H,s),8.15(1H,dt),8.07(1H,dt),7.94(1H,t),7.71(1H,t),6.42(1H,s),6.36(1H,s),4.30-4.28(1H,m),4.10-4.08(1H,m),3.26-3.24(2H,m),3.09-3.00(1H,m),2.85-2.75(1H,dd),2.62-2.50(3H,m),2.07(2H,t),1.67-1.18(6H,m)。
制备36
3',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000631
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)二(氧基))二乙酸(制备61,13.9mg,31.9μmol)的DMF(2mL)与三乙胺(26.7μL,191μmol)溶液和α-Gal(50mg,83μmol)，分离为无色固体(34mg,66％)。
LCMS方法B：Rt＝2.08mins，ES+MS m/z 1607.4[M+H]+
制备37
2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-((3-(2-甲氧基-2-氧代乙氧基)苄基)氨基)-6-氧代己酸酯
Figure BDA0001687660830000641
向二(N-琥珀酰亚胺基)己二酸酯(制备34,495mg,1.46mmol)的DMF(32mL)溶液中加入2-[3-(氨基甲基)苯氧基]乙酸甲基酯(90mg,0.29mmol)和DIPEA(0.15mL,0.87mmol)的氯仿(14.5mL)溶液中。将反应混合物于室温下搅拌3小时，真空浓缩，与甲苯和乙腈的混合物共沸。将残留物用1:1乙腈:甲醇研磨数次，随后用己烷和乙醚研磨，获得为棕色油状物的目标化合物(160mg,>100％,含有1当量的二异丙基乙胺三氟乙酸盐和1当量的N-羟基琥珀酰亚胺)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.25(1H,t),6.92(1H,d),6.84(1H,br s),6.80(1H,dd),4.64(2H,s),4.41(2H,d),3.81(3H,s),2.83(4H,br s),2.67-2.63(2H,m),2.32(2H,t),1.85-1.78(4H,m)。
制备38
2-(3-((6-氧代-6-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)己酰氨基)甲基)苯氧基)乙酸甲基酯
Figure BDA0001687660830000642
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-((3-(2-甲氧基-2-氧代乙氧基)苄基)氨基)-6-氧代己酸酯(制备37,160mg,0.29mmol)的DMF(12mL)溶液中加入N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(83mg,0.29mmol)在DMF(2mL)和氯仿(2mL)中的浆液，将反应混合物于室温下搅拌20小时。将反应物真空浓缩，采用硅胶柱色谱纯化，采用在0－20％甲醇二氯甲烷中的2－4％的氢氧化铵洗脱，获得为灰白色固体的目标化合物(60mg,53％)。
LCMS方法E：Rt＝3.04mins，ES+MS m/z 592.0[M+H]+
制备39
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸
Figure BDA0001687660830000651
目标化合物根据制备1所述方法制备，采用2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯(制备24,181mg,249μmol)，分离为无色固体(147mg,96％)。
LCMS方法A：Rt＝1.77mins，ES+MS m/z 615.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.60(1H,t),7.95(1H,t),7.70(2H,d),7.65(1H,s),7.30(2H,dd)7.05(2H,d),6.40(2H,br s),4.80(2H,s),4.75(2H,s),4.30(1H,dd),4.10(1H,dd),3.35-3.30(2H,m),3.25-3.20(2H,m),2.80(1H,dd),2.55(1H,d),2.05(2H,t),1.60-1.40(4H,m),1.35-1.25(3H,m)。
制备40
N-[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000652
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用(2-氨基乙基)氨基甲酸叔-丁基酯(11.9mg,74.4μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸酯(70mg,70.4μmol)的DMF溶液，可以直接用于下一步骤。
制备41
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-(2-氨基乙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺盐酸盐
Figure BDA0001687660830000661
目标化合物根据制备48所述方法制备，采用N-[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酸叔-丁基酯(制备40,79mg,70.4μmol)，分离为无色胶状物(39mg,二步收率56％)。
LCMS方法B：Rt＝1.64mins，ES+MS m/z 886.8[M+H]+
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 4.50(1H,s),4.30(1H,s),3.70(2H,t),3.75-3.55(48H,m),3.50(2H,t),3.25-3.20(1H,m),2.90(1H,dd),2.80(2H,t),2.70(1H,d),2.45(2H,t),2.20(2H,t),1.80-1.55(4H,m),1.50-1.40(2H,m)。
制备42
3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000671
方法A
目标化合物根据制备16所述方法制备，采用3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备43,71.2mg,31.4μmol)，分离为无色固体(61.2mg 89％)。
LCMS方法B：Rt＝1.27mins，ES+MS m/z 1088.4[M+2H]+/2，理论质量：2174.4
制备42也可以根据下列方法制备：
方法B
向溶于水(7mL)中的3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备43,278mg,123μmol)中加入TEA(7mL)，将反应物于室温下剧烈搅拌16小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(Biotage Isolera,30g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的5－40％MeCN/水洗脱)，获得为无色固体的目标化合物(224mg,83％)。
LCMS方法B：Rt＝1.27mins，97％,ES+MS m/z 1088.4[M+2H]+/2，理论质量：2174.4
制备43
3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000681
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用α-Gal(100mg,166μmol)和2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸(制备73,21.2mg,41.5μmol)，分离为无色固体(71.2mg,76％)。
LCMS方法B：Rt＝1.80mins，ES+MS m/z 1313.3[M+2H]+/2，理论质量：2624.3
制备44
3-(2-氧代-2-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)乙氧基)苯甲酸甲酯
Figure BDA0001687660830000682
目标化合物根据实施例1所述方法制备，采用2-(3-(甲氧基羰基)苯氧基)乙酸(制备51,100mg,475μmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(136mg,475μmol)，分离为无色固体(135mg,59％)。
LCMS方法B：Rt＝1.98mins，ES+MS m/z 479.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.20(1H,t),7.85(1H,t),7.60-7.55(1H,m),7.55-7.50(1H,m),7.45(1H,t),7.25-7.20(1H,m),6.40(1H,s),6.35(1H,s),4.50(2H,s),4.30-4.25(1H,m),4.10-4.05(1H,m),3.85(3H,s),3.20－3.10(4H,m),3.10－3.05(1H,m),2.80(1H,dd),2.55(1H,d),2.05(2H,t),1.65-1.50(1H,m),1.50-1.35(3H,m),1.30-1.20(2H,m)。
制备45
3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000691
向溶于DMSO(250μL)和DMF(2.5mL)的α-Gal(50.0mg,83.0μmol)中加入TEA(167μL,1.20mmol)和2-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)乙酸(制备56,68.6mg,240μmol)。加入HATU(137mg,360μmol)的DMF(750μL)溶液，将反应物于室温下、氮气环境中搅拌16小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,12g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的7－60％MeCN/水洗脱)。将需要的残留物冷冻干燥，进一步纯化(Biotage SP1,12g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的7－60％MeCN/水洗脱)。将残留物冷冻干燥，获得为无色固体的目标化合物(99mg 47％)。
LCMS方法B：Rt＝2.22mins，ES+MS m/z 871.6[M+H]+
制备46
3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830000701
向溶于MeOH/水(1:1v/v,10mL)中的3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸苄基酯(制备45,99.0mg,113μmol)中加入10％Pd/C(9.9mg)。将反应物置于氢气环境中(50psi)，于室温下搅拌3小时。将反应物采用注射滤器过滤，真空浓缩，获得为无色固体的目标化合物(98mg,100％)。
LCMS方法A：Rt＝1.43mins，ES+MS m/z 781.6[M+H]+
制备47
3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基氨基甲酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000702
/>
向3-(叔-丁基氧基羰基-氨基甲基)苯甲酸(200mg,0.80mmol)和HBTU(364mg,0.96mmol)的DMF(16mL)溶液中加入TEA(0.33mL,2.40mmol)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(228mg,0.80mmol)，将反应混合物于室温下搅拌20小时。将反应物真空浓缩，采用硅胶柱色谱纯化，采用5－10％的MeOH的DCM溶液洗脱，获得为米色固体的目标化合物(360mg,84％)。
LCMS方法E：Rt＝2.98mins，ES+MS m/z 520.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.47(1H,t),7.93(1H,t),7.71(1H,br s),7.68(1H,d),7.43(1H,t),7.42-7.36(2H,m),6.41(1H,br s),6.35(1H,br s),4.29(1H,dd),4.16(2H,d),4.09(1H,ddd),3.29(2H,t),3.21(2H,t),3.09-3.03(1H,m),2,80(1H,dd),2.56(1H,d),2.06(2H,t),1.64-1.43(4H,m),1.39(9H,s),1.33-1.26(2H,m)。
制备48
3-(氨基甲基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺盐酸盐
Figure BDA0001687660830000711
向3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基氨基甲酸叔-丁基酯(制备47,355mg,0.68mmol)的二氧六环(2.7mL)和MeOH(2.7mL)溶液中加入4M HCl的二氧六环溶液(0.85mL,3.40mmol)，将反应混合物于室温下搅拌20小时。将反应物真空浓缩。将获得的固体用DCM、MeOH和TBME研磨，于50℃真空干燥3小时，获得为白色固体的目标化合物(378mg,53％)。
LCMS方法A：Rt＝2.28mins，ES+MS m/z 420.5[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.63(1H,t),8.50(3H,br s),8.06(1H,t),8.04(1H,s),7.85(1H,d),7.64(1H,d),7.49(1H,t),4.29(1H,dd),4.10(2H,dd),4.06(2H,q),3.30－3.28(2H,m),3.22-3.20(2H,m),3.10－3.05(1H,m),2,80(1H,dd),2.57(1H,d),2.08(2H,t),1.64-1.39(4H,m),1.37-1.24(2H,m)。
制备49
4',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000721
向溶于DMSO(500μL)和DMF(7mL)中的α-Gal(109mg,182μmol)中加入DIPEA(76.0μL,437μmol)和2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸(制备62,31.8mg,72.9μmol)。加入HATU(82.9mg,219μmol)的DMF(500μL)溶液，将反应物于室温下、氮气环境中搅拌2小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,12g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的5－40％MeCN水溶液洗脱)，获得为无色固体的目标化合物(73.0mg,62％)。
LCMS方法B：Rt＝2.03mins，ES+MS m/z 1606.6[M+H]+
下列制备描述了用于制备连接分子的方法，该连接分子对于提供一或多个F基团非常关键。
具有一个F基团的制备：
制备50
2-(3-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯三氟乙酸盐
Figure BDA0001687660830000722
将溶于DCM(1mL)的2-(3-((2-((叔-丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯(制备54,100mg,273μmol)加入TFA(209μL,2.73mmol)中。将反应物于室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩，与甲苯/二氧六环(1:1v/v,2×1mL)共沸，获得为胶状物的目标化合物(107mg,>99％)。
LCMS方法A：Rt＝1.70mins，ES+MS m/z 267.2[M+H]+
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 8.70(1H,m),7.50-7.40(3H,m),7.15(1H,dd),4.80(2H,s),4.25(2H,q),3.70－3.65(4H,m),3.20(2H,t),1.30(3H,t)。
制备51
2-(3-(甲氧基羰基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000731
/>
目标化合物根据制备1所述方法制备，采用3-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸甲酯(制备55)。可以直接用于下一步骤。
制备52
(3-烯丙氧基羰基)苯氧基乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830000732
向3-羟基苯甲酸烯丙基酯(制备82,17.82g,0.1mol)的DMF(100mL)溶液中加入K2CO3(18.0g,0.13mol)和溴乙酸乙酯(98％,14.7mL,0.13mol)。将反应物于40℃搅拌24小时。加入水(500mL)，产物用EtOAc萃取(2×200mL)。合并的有机萃取液用盐水洗涤(3×200mL)，真空浓缩，采用硅胶柱色谱纯化，采用10－30％的EtOAc庚烷溶液洗脱，获得为澄清油状物的目标化合物(24.3g,二步收率92％)。
LCMS方法B：Rt＝2.93mins，ES+MS m/z 265.1[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.72-7.70(1H,m),7.59-7.57(1H,m),7.40-7.35(1H,m),7.22(1H,m),6.10－5.99(1H,m),5.39(1H,dd),5.27(1H,dd),4.80(2H,d),4.66(2H,s),4.28(2H,q),1.19(3H,t)。
制备53
(3-羧基)苯氧基乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830000741
将四-(三苯膦)钯(0.35g,0.3mmol)加至搅拌的3-乙氧基羰基甲氧基苯甲酸烯丙基酯(制备52,2.64g,10mmol)和哌啶(10mL,0.1mol)的无水THF(50mL)溶液中。将反应混合物于室温下氮气环境中搅拌2小时。向反应物中加入硅胶(5g)，将反应物真空浓缩。固体残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用EtOAc:庚烷:AcOH(30:60:1－50:50:1)洗脱，获得为灰白色固体的目标化合物(1.0g,45％)。用庚烷研磨获得无色固体(566mg,25％)。
LCMS方法A：Rt＝2.26mins，没有检测质量离子
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.79-7.74(1H,m),7.62-7.59(1H,m),7.43-7.39(1H,m),7.22-7.19(1H,m),4.69(2H,s),4.30(2H,q),1.30(3H,t)。
制备54
2-(3-((2-((叔-丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830000742
向(3-羧基)苯氧基乙酸乙酯(制备53,448mg,2mmol)的DMF(6mL)溶液中加入boc-亚乙基二胺(384mg,2.4mmol)的DMF(2mL)溶液，随后加入DIEA(1.04mL,6mmol)。将获得的悬浮液在冰浴中冷却，滴加HATU(824mg,2.1mmol)的DMF(2mL)溶液，获得黄色溶液。移除冰浴，将反应混合物于室温下搅拌16小时。加入等量的水，产物用EtOAc萃取(2×30mL)。合并的有机萃取液用水洗涤(3×30mL)，真空浓缩，采用硅胶柱色谱纯化，采用EtOAc:庚烷(1:1to 3:2)，获得为油状物的目标化合物(830mg,>100％)。
LCMS方法B：Rt＝2.73mins，ES+MS m/z 367.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.43-7.32(3H,m),7.16(1H,br s),7.10-7.04(1H,m),4.96(1H,br s),4.64(2H,s),4.27(2H,q),3.59-3.52(2H,m),3.46-3.35(2H,m),1.42(9H,s),1.28(3H,t)。
制备55
3-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸甲酯
Figure BDA0001687660830000751
目标化合物根据制备57所述方法制备，采用3-羟基苯甲酸甲酯(1.00gm6.57mmol)，分离为黄色油状物(1.55g.89％)。
LCMS方法A：Rt＝2.95mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.65(1H,d),7.50(1H,s),7.35(1H,t),7.10(1H,d),4.55(2H,s),3.90(3H,s),1.45(9H,s)。
制备56
2-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830000752
向溶于DCM(10mL)的3-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸苄基酯(制备57,2.42g,7.07mmol)中加入TFA(1.08mL,14.1mmol)。于室温下搅拌16小时后，再加入TFA(1.08mL,14.1mmol)，将反应物再搅拌24小时。将反应物真空浓缩，将残留物与甲苯/二氧六环(1:1v/v,10mL)共沸。将残留物溶于DCM(10mL)，过滤，真空浓缩。将残留物再次溶于DCM，用2M HCl水溶液(20mL)洗涤。有机层经硫酸镁干燥，真空浓缩，获得为浅棕色油状物的目标化合物(1.91g,94％)。
LCMS方法A：Rt＝3.92mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.75(1H,d),7.60(1H,s),7.45-7.25(6H,m),7.10-7.05(1H,m),5.40(2H,s),4.70(2H,s),3.40(1H,br s)。
制备57
3-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000761
向溶于DMF(10mL)的3-羟基苯甲酸苄基酯(3.12g,13.7mmol)中加入溴乙酸叔-丁基酯(2.02mL,13.7mmol)和碳酸钾(4.16g,30.1mmol)，将反应物于室温下氮气环境中搅拌16小时。将反应物真空浓缩，溶于水(10mL)，用EtOAc萃取(2×10mL)。合并的有机层用盐水(10mL)、2M NaOH水溶液(10mL)洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩，获得为浅黄色油状物的目标化合物(2.42g,51％)。
LCMS方法B：Rt＝3.74mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.70(1H,d),7.60(1H,s),7.45-7.30(6H,m),7.10(1H,dd),5.35(2H,s),4.55(2H,s),1.45(9H,s)。
制备58
4'-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000762
向苄基氯(295μL,2.56mmol)的DMF(5mL)溶液中加入4'-羟基联苯-4-甲酸(500mg,2.33mmol)和碳酸钾(322mg,2.33mmol)。将反应混合物于室温下搅拌20小时，然后真空浓缩。将残留物在水(20mL)和乙醚(20mL)之间分配。分离有机层，水层用乙醚(20mL)再次萃取。合并的有机萃取液用水洗涤(10mL)，经硫酸钠干燥，真空浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，采用0－30％EtOAc的己烷溶液洗脱，获得为白色固体的目标化合物(378mg,53％)。
LCMS方法E：Rt＝3.48mins，ES+MS m/z 305.0[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.26-8.24(1H,m),8.03-7.98(1H,m),7.75-7.71(1H,m),7.51-7.43(5H,m),7.42-7.31(3H,m),6.95-6.90(2H,m),5.40(2H,s)。
制备59
4'-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000771
向4'-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备58,368mg,1.21mmol)和溴乙酸叔-丁基酯(178μL,1.21mmol)的DMF(5mL)溶液中加入碳酸钾(200mg,1.45mmol)，将反应物于室温下搅拌20小时，随后于50℃搅拌2小时。将反应物真空浓缩，将获得的残留物在水(20mL)和DCM(20mL)之间分配。分离有机层，水层用DCM(20mL)再次萃取。合并的有机萃取液用水洗涤(10mL)，经硫酸钠干燥，真空浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，采用0－15％的EtOAc的己烷溶液洗脱，获得为油状物的目标化合物(510mg,100％)。
LCMS方法E：Rt＝3.85mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.25(1H,t),8.03-7.99(1H,dt),7.76-7.71(1H,m),7.58-7.31(8H,m),7.06-6.95(2H,m),5.39(2H,s),4.56(2H,s),1.50(9H,s)。
制备60
4'-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000772
向4'-(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备59,420mg,1.0mmol)的乙醇(10mL)溶液中加入10％Pd/C(11.0mg)。将反应物置于氢气环境中(15psi)，于室温下搅拌20小时。通过硅藻土过滤除去催化剂，将反应物真空浓缩，获得为白色固体的目标化合物(286mg,87％)。
LCMS方法E：Rt＝3.37mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.31(1H,t),8.08-8.03(1H,m),7.82-7.77(1H,m),7.60-7.49(3H,m),7.03-6.96(2H,m),4.57(2H,s),1.50(9H,s)。
具有两个F基团的制备：
制备61
2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)二(氧基))二乙酸
Figure BDA0001687660830000781
将溶于DCM/TFA/水(10:10:1v/v/v,5mL)的2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯(制备66,100mg,182μmol)溶液于室温下搅拌16小时。将反应物真空浓缩，残留物溶于MeOH(1mL)。将溶液用水处理(10mL)，真空浓缩。将残留物溶于MeCN，过滤获得的颗粒，将滤液真空浓缩，获得为粘性固体的目标化合物(42.0mg.53％)。
LCMS方法A：Rt＝2.81mins，ES-MS m/z 435.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.95(1H,t),7.60-7.55(1H,m),7.45-7.40(2H,m),7.40-7.35(4H,m),7.35-7.30(1H,m),7.25-7.20(1H,m),7.10(1H,t),6.95(1H,dd),5.40(2H,s),4.80(2H,s),4.75(2H,s)。
制备62
2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸
Figure BDA0001687660830000791
将溶于DCM/TFA/水(10:10:1v/v/v,10mL)的2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯(制备68,200mg,365μmol)溶液于室温下搅拌3小时。将反应物真空浓缩，与二氧六环/甲苯(1:1,v/v,2×10mL)共沸，然后冷冻干燥过夜，获得为无色固体的目标化合物(101mg,64％)。
LCMS方法A：Rt＝1.83mins，ES-MS m/z 435.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.90(1H,t),7.65-7.55(2H,m),7.55-7.50(1H,m),7.50-7.45(2H,m)7.45-7.35(4H,m),7.10-7.00(2H,m),5.40(2H,s),4.80(2H,s),4.70(2H,s)。
制备63
4',5-二(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000792
向2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯(制备68,210mg,383μmol)的IMS(5mL)溶液中加入10％Pd/C(20mg)。将反应物置于氢气环境中(70psi)，于室温下搅拌5小时。通过Dicalite过滤除去催化剂，将反应物真空浓缩，获得为黄色油状物的目标化合物(174mg,99％)。
LCMS方法A：Rt＝3.45mins，ES-MS m/z 457.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.95-7.90(1H,m),7.55-7.50(2H,m),7.50-7.45(1H,m),7.35(1H,t),7.00-6.95(2H,m),4.60(2H,s),4.55(2H,s),1.50(9H,s),1.50(9H,s)。
制备64
2-{3-[(2-氨基乙基)氨基甲酰基]-5-(2-乙氧基-2-氧代乙氧基)苯氧基}乙酸乙酯三氟乙酸盐
Figure BDA0001687660830000801
目标化合物根据制备1所述方法制备，采用2,2'-((5-((2-((叔-丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二乙酸二乙酯(J.Am.Chem.Soc.2006,128,10362)，为无色固体(207mg,>99％)。
LCMS方法B：Rt＝2.09mins，ES+MS m/z 369.2[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.55-8.50(1H,m),7.75(2H,brs),7.00(2H,s),6.70(1H,s),4.80(4H,s),4.15(4H,q),3.45-3.40(2H,m),3.00-2.95(2H,m),1.20(6H,t)。
制备65
3',5-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000802
将溶于二氧六环/水(30mL,5:1v/v)的3-溴-5-羟基苯甲酸苄基酯(制备78,1.00g,3.26mmol)、碳酸钠(1.21g,11.4mmol)和3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯酚(860mg,3.91mmol)的混合物用氮气脱气30分钟。加入Pd(PPh3)4(284mg,246μmol)，将反应物在氮气环境中加热至100℃16小时。冷却至室温后，加入EtOAc(50mL)和水(25mL)。分层，水相用EtOAc萃取(2×15mL)。合并的有机相经硫酸镁干燥，真空浓缩。残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用5－40％的EtOAc庚烷洗脱，获得目标化合物，为无色油状物(860mg,82％)。
LCMS方法A：Rt＝3.03mins，ES-MS m/z 319.2[M-H]-
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 10.0(1H,s),9.60(1H,s),7.60(1H,s),7.50-7.45(2H,m),7.40(2H,t),7.30-7.25(2H,m),7.25(1H,t),7.25-7.20(1H,m),7.05-7.00(1H,m),6.95(1H,s),5.30(2H,s)。
制备66
2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000811
向溶于DMF(30mL)的3',5-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备65,860mg,2.68mmol)溶液中加入溴乙酸叔-丁基酯(1.19mL,8.05μmol)和碳酸钾(2.23g,16.1mmol)。将获得的悬浮液在氮气环境中搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物溶于水(10mL)，用EtOAc萃取(2×10mL)。合并的有机层用盐水(10mL)、2M NaOH水溶液(10mL)洗涤，硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用5－40％的EtOAc庚烷洗脱，获得为无色胶状物的目标化合物(1.29g,89％)。
LCMS方法B：Rt＝4.22mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(1H,t),7.55-7.50(1H,m),7.45-7.30(7H,m),7.20-7.15(1H,m),7.15-7.10(1H,m),6.90(1H,dd),5.40(2H,s),4.60(2H,s),4.55(2H,s),1.50(9H,s),1.45(9H,s)。
制备67
4',5-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000821
将溶于二氧六环/水(3:1v/v,30mL)的3-溴-5-羟基苯甲酸苄基酯(制备78,1.05g,3.42mmol)、碳酸钠(1.27g,12.0mmol)和(4-羟基苯基)硼酸(565mg,4.10mmol)的混合物用氮气脱氧30分钟。加入Pd(PPh3)4(395mg,341μmol)，将反应物在氮气环境中加热至100℃5小时。冷却至室温后，加入EtOAc(50mL)和水(30mL)，分层。水层用EtOAc萃取(2×50mL)，合并的有机层用盐水(50mL)洗涤。有机层经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用5－40％EtOAc/庚烷洗脱，获得为黄色固体的目标化合物(815mg,74％)。
LCMS方法A：Rt＝2.94mins，ES-MS m/z 319.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.70(1H,t),7.50-7.35(8H,m),7.20(1H,t),6.85-6.80(2H,m),5.35(2H,s)。
制备68
2,2'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二乙酸二-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000822
向溶于DMF(10mL)的4',5-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备67,815mg,2.54mmol)中加入溴乙酸叔丁基酯(752μL,5.09μmol)和碳酸钾(1.58g,11.5mmol)。将获得的悬浮液于室温下氮气环境中搅拌5小时。将反应物真空浓缩，将获得的残留物溶于水(30mL)，用EtOAc萃取(2×30mL)。合并的有机层用盐水(30mL)、2M NaOH水溶液(30mL)洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩，获得为黄色油状物的目标化合物，将其固化一段时间(1.49g,>99％)，可以直接用于下一步骤。
LCMS方法C：Rt＝4.23mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.85(1H,t),7.60-7.55(2H,m),7.50-7.35(7H,m),7.05-6.95(2H,m),5.40(2H,s),4.70(2H,s),4.65(2H,s),1.50(9H,s),1.45(9H,s)。
具有三个F基团的制备：
制备69
3',5'-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000831
将溶于二氧六环/水(30mL,5:1v/v)的3-溴-5-羟基苯甲酸苄基酯(制备78,755mg,2.46mmol)、碳酸钠(912mg,8.60mmol)和((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二(叔-丁基二甲基硅烷)(制备80,1.87g,2.95mmol)的混合物用氮气脱气30分钟。加入Pd(PPh3)4(284mg,246μmol)，将反应物在氮气环境中加热至100℃90分钟。冷却至室温后，加入EtOAc(100mL)和水(50mL)。分层，水相用EtOAc回洗(2×25mL)。合并的有机相经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物用庚烷(100mL)处理，将获得的混合物超声5分钟，然后过滤以除去固体。将滤液真空浓缩，获得粗品目标化合物，为澄清的棕色油状物(1.27g)，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法C：Rt＝5.47mins，ES+MS m/z 565.4[M+H]+
制备70
3',5,5'-三羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000841
向溶于THF(12mL)的粗品3',5'-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备69,1.27g,2.46mmol)溶液中滴加TBAF溶液(1M的THF溶液,6.15mL,6.15mmol)。将反应物于室温下、氮气环境中搅拌90分钟，然后用EtOAc(100mL)稀释。有机相用水洗涤(2×50mL)，经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用5％MeOH的DCM溶液洗脱，获得目标化合物，为浅棕色固体(356mg,三步总收率43％)。
LCMS方法A：Rt＝2.66mins，ES-MS m/z 335.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.60(1H,t),7.45-7.40(2H,m),7.40-20(4H,m),7.15-7.10(1H,m),6.45(2H,d),6.20(1H,t),5.30(2H,s)。
制备71
3',5,5'-三(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000842
/>
向溶于IMS(2.7mL)的2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸三叔-丁基酯(制备72,267mg,393μmol)中加入10％Pd/C(2.7mg)。将反应物置于氢气环境中(50psi)，于室温下搅拌3小时。通过采用MeOH的Dicalite过滤除去催化剂，真空浓缩，获得目标化合物，为浅黄色胶状物(152mg,66％)。
LCMS方法A：Rt＝3.72mins，ES-MS m/z 587.4[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(1H,s),7.55-7.50(1H,m),7.35-7.30(1H,m),6.75(2H,d),6.50(1H,t),4.60(2H,s),4.50(4H,s),1.50(27H,s)。
制备72
2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000851
向溶于DMF(10mL)的3',5,5'-三羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备70,356mg,1.06mmol)中加入溴乙酸叔-丁基酯(625μL,4.23mmol)和碳酸钾(1.17g,8.47mmol)。将获得的悬浮液在氮气环境中搅拌16小时，然后真空浓缩。将获得的残留物溶于水(10mL)，用EtOAc萃取(2×10mL)。合并的有机层用盐水(10mL)、2M NaOH水溶液(10mL)洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用7－60％EtOAc/庚烷洗脱，获得目标化合物，为澄清的无色胶状物(618mg,86％)。
LCMS方法C：Rt＝4.34mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.85(1H,s),7.55-7.50(1H,m),7.45-7.25(6H,m),6.70(2H,d),6.45-6.40(1H,m),5.35(2H,s),4.55(2H,s),4.50(4H,s),1.45(27H,s)
制备73
2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸
Figure BDA0001687660830000852
将溶于DCM/TFA/水(10:10:1v/v/v,5mL)的2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯(制备72,100mg,147μmol)溶液于室温下搅拌16小时。将反应物真空浓缩，溶于MeOH(1mL)，用水(10mL)沉淀。过滤收集沉淀物，用水洗涤，真空干燥，获得为无色固体的目标化合物(57.8mg.77％)。
LCMS方法A：Rt＝2.48mins，ES-MS m/z 509.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 13.05(3H,br s),7.90(1H,s),7.55-7.45(3H,m),7.45-7.30(4H,m),6.80(2H,d),6.50(1H,t),5.402H,s),4.85(2H,s)。4.75(4H,s)。
具有四个F基团的制备：
制备74
3',5'-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4,6-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000861
将溶于二氧六环/水(60mL,5:1v/v)的5-溴-2,4-二羟基苯甲酸苄基酯(制备79,1.59g,4.93mmol)、碳酸钠(1.83g,17.2mmol)和((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二(叔-丁基二甲基硅烷)(制备80,2.59g,5.91mmol)的混合物用氮气脱气30分钟。加入Pd(PPh3)4(569mg,493μmol)，将反应物在氮气环境中加热至100℃5小时。冷却至室温后，加入EtOAc(100mL)和水(50mL)。分层，水相用EtOAc萃取(2×25mL)。合并的有机相经硫酸镁干燥，真空浓缩，获得粗品目标化合物，其可以直接用于下一步骤。
制备75
3',4,5',6-四羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000871
向溶于THF(25mL)的粗品3',5'-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4,6-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备74,4.50g,4.93mmol)溶液中滴加TBAF溶液(1M的THF溶液,12.3mL,12.3mmol)。将反应物于室温下氮气环境中搅拌90分钟，然后用EtOAc(100mL)稀释。有机相用水洗涤(2×50mL)，经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化(BiotageIsolera,45g,采用0－20％的MeOH的EtOAc溶液洗脱)，随后通过第二个硅胶柱色谱纯化(Biotage Isolera,45g,采用10－50％的MeOH的EtOAc溶液洗脱)，获得为橙色固体的目标化合物(306mg,三步收率18％)。
LCMS方法A：Rt＝2.81mins，ES-MS m/z 351.2[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 10.80(1H,s),7.65(1H,s),7.35-7.20(5H,m),6.45(1H,s),6.35(1H,d),6.30(1H,t),5.25(2H,s)。
制备76
2,2',2”,2”'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四乙酸四-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830000872
向溶于DMF(10mL)的3',4,5',6-四羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备75,306mg,868μmol)中加入溴乙酸叔-丁基酯(770μL,5.21μmol)和碳酸钾(1.17g,8.47mmol)，获得悬浮液，将其于室温下氮气环境中搅拌16小时。再次加入溴乙酸叔-丁基酯(770μL,5.21μmol)和碳酸钾(1.17g,8.47mmol)，将反应物搅拌4小时，然后真空浓缩。将获得的残留物溶于水(10mL)，用EtOAc萃取(2×10mL)。然后合并的有机层用盐水(10mL)、2M NaOH水溶液(10mL)洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化(Biotage SP1,30g柱,采用2－50％EtOAc/庚烷洗脱)，随后经第二个硅胶柱色谱纯化(Biotage Isolera,45g柱,采用5－40％的EtOAc庚烷溶液洗脱)，获得为无色胶状物的目标化合物(286mg,41％)。
LCMS方法C：Rt＝4.36mins，ES+MS m/z 809.6[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.90(1H,s),7.45-7.40(2H,m),7.40-7.25(3H,m),6.75(2H,d),6.45(1H,t),6.35(1H,s),5.35(2H,s),4.60(2H,s),4.50(4H,s),4.45(2H,s),1.50(9H,s),1.45(18H,s),1.45(9H,s)。
制备77
3',4,5',6-四(2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000881
向溶于IMS(1.4mL)的2,2',2”,2”'-((5-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四乙酸四-叔-丁基酯(制备76,143mg,177μmol)溶液中加入10％Pd/C(14.3mg)。将反应物置于氢气环境中(50psi)，于室温下搅拌3小时。采用MeOH通过Dicalite过滤除去催化剂，将反应物真空浓缩，获得为浅黄色胶状物的目标化合物(130mg,>99％)。
LCMS方法A：Rt＝3.97mins，ES-MS m/z 717.6[M-H]-
1H NMR(400MHz,CD3OD):δppm 7.90(1H,s),6.80(2H,s),6.60(1H,s),6.45(1H,s),4.80(2H,s),4.65(2H,s),4.60(4H,s),1.50(9H,s),1.50(9H,s),1.45(18H,s)。
关键构建模块的制备：
制备78
3-溴-5-羟基苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000891
向溶于DMF(25mL)的3-溴-5-羟基苯甲酸(4.08g,18.8mmol)溶液中加入K2CO3(2.60g,18.8mmol)，5分钟后，在10分钟内滴加苄基溴(2.24mL,18.8mmol)。将反应物于室温下、氮气环境中搅拌16小时过夜。加入另外的K2CO3(520mg,3.76mmol)和苄基溴(450μL,3.79mmol)，将反应物搅拌3小时。将反应物真空浓缩，将残留物在EtOAc(30mL)和水(30mL)之间分配。水层用EtOAc萃取(2×20mL)，合并的有机层用盐水(30mL)洗涤。有机层经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱纯化，采用5％的EtOAc庚烷洗脱，获得为无色固体的目标化合物(3.88g,67％)。
LCMS方法A：Rt＝3.36mins，ES-MS m/z 307.2[M-H]-
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.75(1H,t),7.50-7.45(1H,m),7.45-7.30(5H,m),7.20(1H,t),5.30(2H,s),5.30(1H,br s)。
制备79
5-溴-2,4-二羟基苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830000892
向溶于DMF(25mL)的5-溴-2,4-二羟基苯甲酸(2.50g,10.7mmol)中加入KHCO3(1.07g,10.7mmol)和苄基溴(1.30mL,10.7mmol)，然后于室温下氮气环境中搅拌16小时。将反应物真空浓缩，将残留物在EtOAc(20mL)和水(20mL)之间分配。分层，有机层用1M柠檬酸水溶液(20mL)、饱和的NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤。有机层经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化(Biotage Isolera,45g柱,采用0－40％EtOAc/庚烷洗脱)，获得为无色固体的目标化合物(2.36g,68％)。
LCMS方法A：Rt＝3.37mins，没有观察到质量离子。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 10.80(1H,s),8.00(1H,s),7.45-7.35(5H,m),6.60(1H,s),5.90(1H,s),5.35(2H,s)。
制备80
((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二(叔-丁基二甲基硅烷)
Figure BDA0001687660830000901
将溶于异己烷(15mL)的1,3-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯(制备81,1.00g,2.95mmol和双(频哪醇合)二硼(750mg,2.95mmol)溶液用氮气脱气1小时。加入[Ir(OMe)(COD)]2(19.6mg,59.1μmol)和4,4'-二-叔-丁基-2,2'-联吡啶(15.9mg,59.0μmol)，将反应物密封，加热至110℃16小时。将反应物冷却，真空浓缩，直接用于下一步骤(1.87g)。
LCMS方法C：Rt＝6.19mins，ES+MS m/z 465.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.85(2H,d),6.40(1H,t),1.25(12H,s),0.95(18H,s),0.15(12H,s)。
制备81
1,3-二((叔-丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯
Figure BDA0001687660830000902
向溶于DCM(40mL)的间苯二酚(2.00g,18.2mmol)和咪唑(3.71g,54.5mmol)中加入叔-丁基二甲基氯代硅烷(8.21g,54.5mmol)。形成沉淀，再加入DCM(40mL)，然后于室温下氮气环境中搅拌16小时。将反应物过滤，将滤液真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化(Biotage SP1,120g硅胶柱,采用0－10％的EtOAc庚烷洗脱)，获得目标化合物，为无色油状物(6.18g,>99％)。
LCMS方法C：Rt＝5.39mins，ES+MS m/z 339.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.95(1H,t),6.35(2H,dd),6.25(1H,t),1.85(18H,s),0.10(12H,s)。
制备82
3-羟基苯甲酸烯丙酯
Figure BDA0001687660830000911
将烯丙基溴(97％,13.1g,0.105mol)缓慢加至搅拌的3-羟基苯甲酸(99％,13.95g,0.1mol)和Na2CO3(11.66g,0.11mol)的无水DMF(200mL)悬浮液中，将反应混合物于室温下搅拌48小时。加入水(500mL)，产物用EtOAc萃取(3×250mL)。将合并的有机萃取液真空浓缩，获得粗品残留物，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法B：Rt＝2.53mins，没有检测质量离子
制备83－139进一步举例说明了能够提供单个或多个F基团的中间体和关键链接分子，如流程1－8所述用于结合到实施例26－62中。
制备83
3',5,5'-三((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基(docosyl))氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000912
步骤1
向1,1',1”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸)(制备111,48.0mg,38.3μmol)的DMF(4mL)溶液中加入TEA(48.1μL,345μmol)，随后加入α-Gal(92.4mg,153μmol)的DMSO(500μL)溶液。加入HATU(58.3mg,153μmol)，将反应物于室温下氮气环境中搅拌1小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,10g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN/水洗脱)。
步骤2
向溶于MeOH/水(1:1v/v,10mL)的残留物(94.0mg,31.3μmol)中加入Pd/C(10％,10mg)。将反应物置于氢气环境中(50psi)，于室温下搅拌3小时。通过注射滤器过滤除去催化剂，将反应物真空浓缩，获得为无色固体的目标化合物(92mg,两步收率81％)。
LCMS方法A：Rt＝1.58mins ES-MS m/z 1457.2[M-2H]-/2，理论质量：2915.9
制备84－101根据制备83所述的方法制备，所述两步反应方案包括：步骤1)使用标准酰胺键形成步骤加入氨基丙基连接的α-Gal，随后：步骤2)如下所述，将苄基保护的苯甲酸/羧酸中间体脱保护，从适当的羧酸前体开始。将反应物搅拌1－24小时进行步骤1，于50－80psi氢化1－3小时进行步骤2，除非另有说明，采用如下所述的反相纯化条件进行纯化：
纯化方法1：Biotage SP1(10g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN/水洗脱)。
制备84
4',5-二((46-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂(dodecaoxa)-3,43-二氮杂四十六烷基(hexatetracontyl))氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000931
方法：制备83，采用2.5eqα-Gal、4eq DIPEA和3eq HATU。
分离的收率(Isolated yield)：二步共50％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的10－80％的MeCN水溶液
LCMS方法A：Rt＝1.68mins，ES-MS m/z 1357.2[M-2H]-/2，理论质量：2714.8
前体：制备113
制备85
4'-((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基(docosyl))氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000932
方法：制备83，采用1.3eqα-Gal、3eq TEA和1.3eq HATU。
分离的收率：二步共78％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－80％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.55mins，ES-MS m/z 1102.7[M-H]-，理论质量：1104.1
前体：制备114
制备86
4',5-二((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000941
/>
方法：制备83，采用2.5eqα-Gal、3.5eq TEA和2.6eq HATU。
分离的收率：二步共58％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－70％的MeCN水溶液，随后氢化，残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,10g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的2－20％的MeCN/水洗脱)。
LCMS方法B：Rt＝1.49mins，ES+MS m/z 1006.0[M+2H]+/2，理论质量：2010.0
前体：制备115
制备87
3',5,5'-三((46-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二烷基氧杂(dodecaoxa)-3,43-二氮杂四十六烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000951
方法：制备83，采用4eqα-Gal、9eq TEA和4eq HATU。
分离的收率：二步共45％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－70％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.68 mins，ES-MS m/z 1985.4[M-2H]-/2，理论质量：3973.2
前体：制备116
制备88
3',5,5'-三((27-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18,23-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19,24-三氮杂二十七烷基(heptacosyl))氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000952
方法：制备83，采用4eqα-Gal、10eq TEA和4eq HATU。
分离的收率：二步共48％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液，随后氢化，残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,10g,C-18柱,采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN/水洗脱)。
LCMS方法A：Rt＝1.56mins，ES+MS m/z 1058.2[M+3H]+/3，理论质量：3171.2
前体：制备117
制备89
3',5,5'-三(2-((4-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-4-氧代丁基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000961
方法：制备83，采用4eqα-Gal、10eq TEA和4eq HATU。
分离的收率：二步共65％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液，随后氢化，将残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,4g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的5－40％MeCN/水洗脱)。
LCMS方法A：Rt＝1.39mins，ES+MS m/z 1215.6[M+2H]+/2，理论质量：2429.3
前体：制备118
制备90
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000971
方法：制备83，采用1.3eqα-Gal、3eq TEA和1.5eq HATU。
分离的收率：二步共55％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液，随后氢化，将残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,4g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN/水洗脱)。
LCMS方法A：Rt＝1.83mins，ES+MS m/z 857.6[M+H]+，理论质量：856.8
前体：制备121
制备91
3”,5”-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1':3',1”-三联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830000981
方法：制备83，采用2.4eqα-Gal、5eq TEA和2.5eq HATU。
分离的收率：二步共83％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.60mins，ES+MS m/z 1591.8[M]+，理论质量：1591.5
前体：制备119
制备92
3,3”,5,5”-四(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1':3',1”-三联苯]-5'-甲酸
Figure BDA0001687660830000991
方法：制备83，采用5.2eqα-Gal、11eq TEA和5eq HATU。
分离的收率：二步共64％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.35mins，ES-MS m/z 1453.5[M-2H]-/2，理论质量：2908.7
前体：制备120
制备93
3,3”,5,5”-四((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1':3',1”-三联苯]-5'-甲酸
Figure BDA0001687660830001001
方法：制备83，采用6eqα-Gal、13eq TEA和6eq HATU。
分离的收率：二步共73％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.41mins，ES+MS m/z 1300.8[M+3H]+/3，理论质量：3897.9
前体：制备112
制备94
3',4',5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830001002
方法：制备83，采用5eqα-Gal、9eq TEA和5eq HATU。
分离的收率：二步共55％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.26mins，ES-MS m/z 1086.4[M-2H]-/2，理论质量：2174.0
前体：制备122
下列制备根据如上所述制备83制备，采用上述苯甲酸前体和下述相应的胺-链接分子：
制备95
3-((1,6,46-三氧代-1-(3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-基)-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十二氧杂-2,5,45-三氮杂四十七烷(heptatetracontan)-47-基)氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830001011
方法：制备83，采用1.2eq制备134、2.5eq TEA和1.2eq HATU。
分离的收率：二步共57％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液
LCMS方法A：Rt＝1.71mins，ES-MS m/z 1495.6[M-2H]-/2，理论质量：2994.0
前体：制备42和制备134
制备96
3-((1,6,22-三氧代-1-(3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-基)-9,12,15,18-四氧杂-2,5,21-三氮杂二十三烷(tricosan)-23-基)氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830001021
方法：制备83，采用1.2eq制备130、4eq TEA和1.2eq HATU。
分离的收率：二步共38％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的10－80％的MeCN水溶液
LCMS方法A：Rt＝1.57mins，ES-MS m/z 1319.5[M-2H]-/2，理论质量：2641.6
前体：制备89和制备130
制备97
3-((1,6,22-三氧代-1-(3',5,5'-三((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-基)-9,12,15,18-四氧杂-2,5,21-三氮杂二十三烷-23-基)氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830001031
方法：制备83，采用1.2eq制备130、4eq TEA和1.2eq HATU。
分离的收率：二步共25％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的10－80％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.48mins，ES-MS m/z 1690.4[M-2H]-/2，理论质量：3383.4
前体：制备83和制备130
制备98
3-((1,6,46-三氧代-1-(3',5,5'-三((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-基)-9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42-十二氧杂-2,5,45-三氮杂四十七烷-47-基)氧基)苯甲酸
Figure BDA0001687660830001032
方法：制备83，采用1.2eq制备135、2.5eq TEA和1.2eq HATU。
分离的收率：二步共76％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液
LCMS方法A：Rt＝1.77mins，ES+MS m/z 1868.7[M+2H]+/2，理论质量：3735.8
前体：制备83和制备134
制备99
6-(6-(3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-基甲酰氨基)己酰氨基)己酸
Figure BDA0001687660830001041
方法：制备83，采用1.2eq 6-(6-氨基己酰胺)己酸苄基酯、2.5eq TEA和1.2eqHATU。
分离的收率：二步共71％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN水溶液
LCMS方法B：Rt＝1.47mins，ES+MS m/z 1201.3[M+2H]+/2，理论质量：2400.3
前体：制备42和6-(6-氨基己酰胺)己酸苄基酯(JACS(2014)136(52)18034－18043)。
制备100
1,8,15,22-四氧代-1-(3,3”,5,5”-四((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1':3',1”-三联苯]-5'-基)-2,9,16,23-四氮杂二十九烷(nonacosan)-29-酸
Figure BDA0001687660830001051
方法：制备83，采用1.2eq胺、2.5eq TEA和1.2eq HATU，随后制备42方法B。
分离的收率：二步共59％，纯化方法1采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN水溶液，随后Biotage Isolera(10g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的5－40％MeCN/水洗脱)，然后进行去保护步骤。
LCMS方法B：Rt＝1.65mins，ES+MS m/z 1451.6[M+3H]+/3，理论质量：4350.5
前体：制备93和制备110
制备101
1-氧代-1-(3',5,5'-三((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-基)-5,8,11,14-四氧杂-2-氮杂十七烷-17-酸
Figure BDA0001687660830001061
目标化合物根据制备83上述方法制备，采用3',5,5'-三((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备83)、1.3eq 1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯、4eq TEA和1.3eq HATU，随后通过反相纯化，采用纯化方法1(含有0.1％NH3的5－60％的MeCN水溶液)。将残留物溶于DCM(1mL)，采用4M HCl的二氧六环(5mL)处理，于室温下搅拌30分钟，随后于30℃加热90分钟。再加入4M HCl的二氧六环溶液(25mL)，将反应物超声2小时。将反应物溶于水(2mL)并冷冻干燥，获得目标化合物，收率99％。
LCMS方法A：Rt＝1.61mins，ES+MS m/z 1582.6[M+2H]+/2，理论质量：3162.0
制备102
2-({3'-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-4,5-二(羧基甲氧基)-[1,1'-联苯]-3-基}氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830001062
向2-({3'-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-4,5-二[2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基]-[1,1'-联苯]-3-基}氧基)乙酸叔-丁基酯(制备103,20mg,23μmol)的DCM(1.5mL)溶液中加入4N HCl的二氧六环溶液(0.5mL,2mmol)，将反应物于室温下搅拌1小时。将反应物真空浓缩，与甲苯共沸，可以直接用于下一步骤。
制备103
2-({3'-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-4,5-二[2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基]-[1,1'-联苯]-3-基}氧基)乙酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830001071
目标化合物根据制备72所述方法制备，采用5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-({3',4',5'-三羟基-[1,1'-联苯]-3-基}甲酰氨基)乙基]戊酰胺(制备104)和溴乙酸叔-丁基酯。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用2－10％的MeOH的DCM溶液洗脱，直接用于下一步骤。
LCMS方法B：Rt＝3.26mins；ES+MS m/z 857.4[M+H]+
制备104
5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-({3',4',5'-三羟基-[1,1'-联苯]-3-基}甲酰氨基)乙基]戊酰胺
Figure BDA0001687660830001072
/>
向5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-({3',4',5'-三甲氧基-[1,1'-联苯]-3-基}甲酰氨基)乙基]戊酰胺(制备105,142mg,0.25mmol)和一些分子筛
Figure BDA0001687660830001073
的DCM(15mL)悬浮液中滴加BBr3(1M的DCM溶液,5mL)。将反应物温热至室温1小时，搅拌16小时过夜。将反应物通过加入MeOH骤冷，获得40mL溶液。倾出反应物，将溶液加热至回流，然后真空浓缩。将残留物在EtOAc和水之间分配，产物保留在两层中。合并两层，真空浓缩，残留物直接用于下一步骤。
制备105
5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-({3',4',5'-三甲氧基-[1,1'-联苯]-3-基}甲酰氨基)乙基]戊酰胺
Figure BDA0001687660830001081
目标化合物根据制备30所述方法制备，采用3',4',5'-三甲氧基-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备125)和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用1－10％的MeOH的DCM溶液洗脱。
LCMS方法A：Rt＝2.22mins，ES+MS m/z 557.4[M+H]+
制备106
1-(3-((4,44-二氧代-48-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷基(octatetracontyl))氨基甲酰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷(dotetracontan)-42-酸
Figure BDA0001687660830001082
目标化合物根据制备30所述方法制备，随后根据制备1所述方法，采用1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸叔-丁基酯和2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸(制备107)。
LCMS方法B：Rt＝1.98mins，ES+MS m/z 1664.9[M+H]+
制备107
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830001091
向2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸乙酯(制备108,10.0mg,9.20μmol)的MeOH/H2O(500μL,1:1v/v)溶液中加入NaOH(2M,14.0μL,27.6μmol)。将反应混合物于室温下搅拌30分钟，减压除去溶剂。将残留物溶于水(1mL)，采用HCl(2M,5滴)酸化。减压除去溶剂，与甲苯共沸(3×2mL)，获得粗品产物，为灰白色固体。将固体溶于DMF(500μL)制备粗品储备溶液，其可以直接用于下一步骤。
LCMS方法A：Rt＝1.89mins，ES-MS m/z 1062.8[M+H]-
制备108
2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}苯氧基)乙酸乙酯
Figure BDA0001687660830001101
向溶于DMF(500μL)的2-(3-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苯氧基)乙酸酯三氟乙酸乙盐(制备50,87.0mg,229μmol)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸酯(35.0mg,37.0μmol)和TEA(20.0μL,111μmol)。将反应物于室温下搅拌1小时，然后真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化(Biotage SP1，采用2－20％的MeOH/DCM洗脱)，获得目标化合物，为无色油状物(29.2mg,66％)。
LCMS方法A：Rt＝2.11mins，ES+MS m/z 1092.9[M+H]+
制备109
1,1',1”,1”'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四(2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸)
Figure BDA0001687660830001102
目标化合物根据制备30所述方法制备(采用DIPEA代替TEA)，随后根据制备1所述方法，采用1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯和2,2’,2”,2”’-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1’-联苯]-2,3’,4,5’-四基)四(氧基))四乙酸(制备7)。
LCMS方法A：Rt＝1.91mins，没有观察到质量离子。.
制备110
6-(6-(6-(6-氨基己酰氨基)己酰氨基)己酰氨基)己酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001111
将6-(6-((叔-丁氧基羰基)氨基)己酰氨基)己酸(Pharmazie,1985,40,9,617－622,321mg,932mmol)和6-(6-氨基己酰氨基)己酸苄基酯盐酸盐(JACS(2014)136,52,18034－18043,380mg,1.025mmol)溶于DMF(8.4mL)。加入TEA(0.46mL 3.26mmol)，随后加入HATU(425mg,1.118mmol)，将反应混合物于室温下、氮气环境中搅拌60小时。将获得的固体过滤，用EtOAc洗涤，通过硅胶柱色谱纯化，采用2－6％的MeOH的DCM溶液洗脱。将获得的白色固体(338.0mg,0.511mmol)溶于二氧六环(6.76mL)，加入4M HCl的二氧六环溶液(1.28mL,5.12mmol)。将反应混合物于室温下搅拌18小时，真空浓缩。将获得的固体悬浮于TBME(10mL)，过滤，用TBME洗涤，真空干燥1小时，获得为白色固体的目标化合物(271mg,89％)。
LCMS方法B：Rt＝2.32mins，ES+MS m/z 561.3[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.90-7.67(6H,m),7.38-7.29(5H,m),5.10－5.01(2H,s),3.01-2.90(6H,m),2.45-2.42(6H,s),2.36-2.29(2H,m),2.37-2.28(6H,m),2.08-1.92(6H,m),1.56-1.14(14H,m)。
制备111
1,1',1”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸)
Figure BDA0001687660830001121
步骤1
向溶于DMF(30mL)的2,2',2”-((5'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸(制备73,750mg,1.47mmol)中加入TEA(1.84mL,13.2mmol)和1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(1.89g,5.88mmol)。加入HATU(2.23g,5.88mmol)，将反应物于室温下、氮气环境中搅拌2小时。将反应物真空浓缩，将残留物采用反相柱色谱纯化(BiotageSP1,120g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的20－80％的MeCN/水洗脱)。
步骤2
将残留物溶于DCM/TFA/水(10:10:1v/v/v,24mL)，随后于室温下搅拌2小时。将反应物真空浓缩，与二氧六环/甲苯(1:1v/v,3×24mL)共沸，采用反相柱色谱纯化(BiotageSP1,30g,C-8柱，采用含有0.1％甲酸的5－40％的MeCN/水洗脱)，获得为无色胶状物的目标化合物(1.11g,60％)。
LCMS方法A：Rt＝2.36mins，ES-MS m/z 1250.8[M-H]-
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.20(3H,br s),8.25(1H,t),8.15-8.10(2H,m),7.80(1H,s),7.55-7.45(4H,m),7.45-7.30(3H,m),6.90(2H,d),6.65-6.60(1H,m),5.40(2H,s),4.65(2H,s),4.55(4H,s),3.55(6H,t),3.50－3.40(42H,m),3.30－3.25(6H,m),2.40(6H,t)。
下列制备根据制备111所述方法制备，采用1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯或1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸叔-丁基酯或4-氨基丁酸叔-丁基酯以及下述适当的羧酸：
步骤1后纯化：Biotage SP1(C-18柱，采用含有0.1％甲酸的12－100％的MeCN/水溶液洗脱)或Biotage SP1(C-18柱，采用含有0.1％NH3的12－100％的MeCN/水溶液洗脱)
步骤2后的纯化：Biotage SP1(C-18柱，采用含有0.1％NH3的2－100％的MeCN/水溶液洗脱)或Biotage SP1(C-18柱，采用含有0.1％甲酸的0－80％MeCN/水溶液洗脱)。
Figure BDA0001687660830001131
/>
Figure BDA0001687660830001141
/>
Figure BDA0001687660830001151
/>
Figure BDA0001687660830001161
以下制备根据制备66所述的方法制备，随后根据制备61所述，采用如下所述的适当的酚。必要时，采用以下反相色谱条件纯化目标化合物：
纯化方法：Biotage SP1(C-18柱，采用含有0.1％NH3的5－40％的MeCN/水溶液洗脱)。
Figure BDA0001687660830001162
/>
Figure BDA0001687660830001171
制备122
2-({3'-[(苄基氧基)羰基]-4,5-二(羧基甲氧基)-[1,1'-联苯]-3-基}氧基)乙酸
Figure BDA0001687660830001172
目标化合物根据制备61所述方法制备，采用制备123。
LCMS方法D：Rt＝1.84mins，ES+MS m/z 528.0[M+NH4]+
制备123
2,2',2”-((3'-((苄基氧基)羰基)-[1,1'-联苯]-3,4,5-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830001181
将3-溴苯甲酸苄基酯(Bioorganic and Medicinal Chemistry,2013,21,3,608－617,308.0mg,1.06mmol)、4,4,4′,4′,5,5,5′,5′-八甲基-2,2′-二(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(403.0mg,1.59mmol)和乙酸钾(311mg,3.17mmol)悬浮于二氧六环(10mL)并充分脱气。加入[1,1′-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)与二氯甲烷的复合物(86mg,0.106mmol)，将反应混合物再次脱气，然后于100℃氮气环境中加热4小时。将反应混合物冷却至室温，加入NaHCO3(267.0mg,3.18mmol)、2,2',2”-((5-溴苯-1,2,3-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯(580.0mg,1.06mmol)和更多的[1,1′-二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)与二氯甲烷的复合物(86.0mg,0.106mmol)。将反应物于100℃氮气环境中加热4小时，然后冷却至室温。将反应物真空浓缩，将残留物在EtOAc(25mL)和水(25mL)之间分配。将混合物通过Hyflo过滤，分离EtOAc层。水层用EtOAc(25mL)再萃取一次，合并的有机萃取液用盐水(25mL)洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用5－30％的EtOAc庚烷溶液洗脱，获得目标化合物(105mg,15％)。
LCMS方法B：Rt＝4.34mins，ES+MS m/z 696.3[M+NH4]+
制备124
2,2',2”-((5-溴苯-1,2,3-三基)三(氧基))三乙酸三-叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830001182
向溶于DMF(38mL)的5-溴苯-1,2,3-三醇(JACS,2011,vol.133,no.34,第13437－13444页,1.89g,9.22mmol)中加入碳酸钾(4.21g,30.43mmol)和溴乙酸叔-丁基酯(4.49mL,30.43mmol)，获得悬浮液，将其在氮气环境中搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物在水(100mL)和TBME(100mL)之间分配。分离有机层，水层用TBME(50mL)萃取。合并的有机萃取液经硫酸镁干燥，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用10－20％的EtOAc庚烷溶液洗脱，获得目标化合物(5.0g,>100％,含有EtOAc)。
LCMS方法B：Rt＝4.06mins，ES+MS m/z 566.3[M+NH4]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 6.68(2H,s),4.61(2H,s),4.62(2H,s),4.59(4H,s),1.47(27H,s)。
制备125
3',4',5'-三甲氧基-[1,1'-联苯]-3-甲酸
Figure BDA0001687660830001191
目标化合物根据制备65所述方法制备，采用3-溴苯甲酸和3,4,5-三甲氧基苯基硼酸。
LCMS方法B：Rt＝2.62mins，ES+MS m/z 289.4[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.32(1H,s),8.10(1H,d),7.81(1H,d),7.58-7.54(1H,m),6.81(2H,s),3.95(6H,s),3.90(3H,s)。
制备126
5-{3,5-二[2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基]苯基}-3',5'-二[2-(叔-丁氧基)-2-氧代乙氧基]-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001192
目标化合物根据制备66制备，采用5-(3,5-二羟基苯基)-3',5'-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备127)和溴乙酸叔-丁基酯。
LCMS方法D：Rt＝4.57分钟ES+MS m/z 903.5[M+NH4]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.22(2H,s),7.88(1H,s),7.49-7.42(2H,m),7.40-7.37(3H,m),6.80(4H,s),6.52(2H,s),5.42(2H,s),4.56(8H,s),1.49(36H,s)。
制备127
5-(3,5-二羟基苯基)-3',5'-二羟基-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001201
目标化合物根据制备69和70所述方法制备，采用2,4-二溴苯甲酸苄基酯。
LCMS方法B：Rt＝2.73分钟，ES-MS m/z 427.3[M-H]-
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 9.45(4H,s),8.02(2H,s),7.89(1H,s),5.53-5.38(5H,m),6.56(4H,d),6.28(2H,s),5.39(2H,s)。
制备128
3-{3',5'-二羟基-[1,1'-联苯]-3-基}苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001202
目标化合物根据制备69和70所述方法制备，采用3'-溴-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯(制备129)和((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二(叔-丁基二甲基硅烷)(制备80)。第二次纯化采用硅胶柱色谱，采用TBME:庚烷1:1洗脱。
LCMS方法A：Rt＝3.39mins，ES+MS m/z 397.4[M+H]+
制备129
3'-溴-[1,1'-联苯]-3-甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001211
将苄基溴(718mg,4.1mmol)缓慢加至搅拌的3’-溴联苯-3-甲酸(985mg,3.78mmol)和碳酸钾(621mg,4.49mmol)的DMF(20mL)悬浮液中。将反应物于室温下搅拌24小时。反应物通过加入水(50mL)骤冷，用EtOAc萃取(50mL和25mL)。合并的有机萃取液用盐水洗涤(3×30mL)，真空浓缩。将残留物采用硅胶柱色谱纯化，采用0－10％的EtOAc庚烷溶液洗脱，获得目标化合物，为无色油状物(1.70g,100％)。
LCMS方法B：Rt＝4.22mins，没有观察到质量离子。.
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.26(1H,s),8.06-8.01(1H,m),7.74-7.69(2H,m),7.49-7.45(5H,m),7.36-7.3(4H,m),5.40(2H,s)。
制备130
3-((21-氨基-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十一烷基(azahenicosyl))氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001212
向3-((2,2-二甲基-4,9,25-三氧代-3,12,15,18,21-五氧杂-5,8,24-三氮杂二十六烷-26-基)氧基)苯甲酸苄基酯(制备131,666mg,986μmol)的二氧六环(10mL)溶液中加入HCl的二氧六环溶液(4.0N,5mL)，将反应物搅拌2小时。再加入HCl的二氧六环溶液(4.0N,5mL)，将反应物搅拌3小时，然后真空浓缩。将残留物首先通过SCX-2短柱(1N NH3/MeOH)洗脱，然后通过反相柱色谱纯化(Biotage SP1,30g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的7－60％的MeCN/水洗脱)，随后通过第二个反相柱色谱纯化(Biotage SP1,30g柱,含有1％7NH3/MeOH的2－40％DCM/MeOH)，获得目标化合物，为浅黄色胶状物(441mg,78％)。
LCMS方法B：Rt＝2.36mins，ES+MS m/z 576.5[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.70-7.60(3H,m),7.45-7.30(7H,m),7.20-7.15(1H,m),5.35(2H,s),4.55-4.50(2H,m),3.70－3.50(20H,m),3.35-3.30(1H,m),3.00(1H,t),2.40-2.35(2H,m)。
制备131
3-((2,2-二甲基-4,9,25-三氧代-3,12,15,18,21-五氧杂-5,8,24-三氮杂二十六烷-26-基)氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001221
向1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(制备132,695mg,1.30mmol)的DMF(7mL)溶液中加入TEA(363μL,2.61mmol)，随后加入Boc-乙二胺(209mg,1.30mmol)的DMF(2mL)溶液。用10分钟向反应混合物中逐份加入HATU(743mg,1.95mmol)，然后于室温下搅拌30分钟。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(BiotageSP1,60g,C-18柱，采用含有0.1％甲酸的5－70％的MeCN/水洗脱)，获得为浅黄色油状物的目标化合物。
LCMS方法B：Rt＝2.87mins，ES+MS m/z 676.5[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.15(1H,t),7.80-7.75(1H,m),7.60(1H,d),7.55(1H,s),7.45-7.30(6H,m),7.25(1H,dd),6.75-6.70(1H,m),5.35(2H,s),4.55(2H,s),3.55(2H,t),3.50－3.35(14H,m),3.30－3.25(2H,m),3.10－3.05(2H,m),3.00-2.95(2H,m),2.40(2H,t),1.35(9H,s)。
制备132
1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸
Figure BDA0001687660830001222
向1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸叔-丁基酯(制备133,1.09g,1.84mmol)的DCM(9.5mL)溶液中加入水(1.0mL)，随后加入TFA(9.5mL)。将反应物于室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,60g,C-18柱，采用含有0.1％甲酸的10－70％MeCN/水洗脱)，获得目标化合物，为无色油状物(695mg,71％)。
LCMS方法A：Rt＝2.67mins，ES+MS m/z 534.5[M+H]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 12.15(1H,br s),8.15(1H,t),7.60(1H,d),7.55-7.50(1H,m),7.50-7.35(6H,m),7.25(1H,dd),5.35(2H,s),4.55(2H,s),3.60(2H,t),3.50－3.40(14H,m),3.30－3.25(2H,m),2.40(2H,t)。
制备133
1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830001231
向2-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)乙酸(制备56,870mg,3.04mmol)的DMF(5.0mL)溶液中加入溶于DMF(4.0mL)的1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔-丁基酯(1.27g,3.95mmol)。然后向溶液中加入TEA(1.69mL,12.2mmol)，随后在10分钟内分次加入HATU(1.50g,3.95mmol)。将反应物于室温下搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,120g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的10－30％MeCN/水洗脱)，获得目标化合物，为无色油状物(1.09g,57％)。
LCMS方法B：Rt＝3.29mins，ES+MS m/z 607.6[M+NH4]+
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.15(1H,t),7.60(1H,d),7.55-7.50(1H,m),7.50-7.30(6H,m),7.25(1H,dd),5.35(2H,s),4.55(2H,s),3.60(2H,t),3.50－3.45(12H,m),3.45(2H,t),3.25(2H,q),2.40(2H,t),1.40(9H,s)。
制备134
3-((45-氨基-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3,43-二氮杂四十五烷基)氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001241
向溶于二氧六环(4.0mL)的3-((2,2-二甲基-4,9,49-三氧代-3,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45-十三氧杂(tridecaoxa)-5,8,48-三氮杂五十烷-50-基)氧基)苯甲酸苄基酯(制备135,225mg,219μmol)中加入4MHCl的二氧六环溶液(4.0mL,16.0mmol)。将反应混合物于室温下搅拌18小时，然后真空浓缩。将残留物溶于DCM，通过SCX-2柱采用MeOH洗脱，随后用1N NH3的MeOH溶液洗脱，获得目标化合物，为浅黄色胶状物(190mg,94％)。
LCMS方法A：Rt＝2.56mins，ES+MS m/z 929.7[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.73(1H,d),7.60(1H,d),7.46-7.32(6H,m),7.15-7.06(3H,m),5.23(2H,s),4.52(2H,s),3.74(2H,t),3.67-3.52(48H,m),3.38-3.30(2H,m),2.86(2H,t),2.47(2H,t)。
制备135
3-((2,2-二甲基-4,9,49-三氧代-3,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45-十三氧杂-5,8,48-三氮杂五十烷-50-基)氧基)苯甲酸苄基酯
Figure BDA0001687660830001242
向溶于DMF(4.50mL)的1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酸(制备136,225.0mg,254μmol)中加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔-丁基酯(49.0mg,305μmol)和三乙胺(89μL,635μmol)，随后加入HATU(116.0mg,305μmol)。将反应混合物于室温下搅拌21小时，然后真空浓缩。将残留物在EtOAc(40mL)和盐水(25mL)之间分配，水层用EtOAc萃取(20mL)，合并的有机萃取液用1M HCl(25mL)、10％aq.K2CO3溶液(25mL)和盐水(25mL)洗涤，然后经硫酸镁干燥，真空浓缩。残留物通过硅胶柱色谱纯化，采用2－5％的MeOH的DCM溶液洗脱，获得目标化合物，为浅黄色油状物(226mg,87％)。
LCMS方法A：Rt＝2.83mins，ES+MS m/z 1028.8[M+H]+
制备136
1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酸
Figure BDA0001687660830001251
将1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酸叔-丁基酯(制备137,241mg,256μmol)溶于TFA:DCM:H2O混合物(10:10:1v/v/v,10mL)中，于室温下搅拌3小时。将反应物真空浓缩，与甲苯:二氧六环(1:1,10mL)共沸，获得目标化合物，为浅黄色油状物(232mg,>100％,含有DCM)。
LCMS方法A：Rt＝2.37mins，ES+MS m/z 886.6[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.72(1H,d),7.61(1H,d),7.46-7.32(5H,m),7.25-7.20(1H,m),7.17-7.11(1H,m),5.37(2H,s),4.58(2H,s),3.72-3.56(52H,m)。
制备137
1-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酸叔-丁基酯
Figure BDA0001687660830001252
向溶于DMF(2.0mL)的2-(3-((苄基氧基)羰基)苯氧基)乙酸(制备56,96.0mg,0.335mmol)、1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸叔-丁基酯(249.0mg,0.369mmol)和TEA(140μL,1.01mmol)中加入HATU(153mg,0.402mmol)。将混合物于室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。残留物采用反相柱色谱纯化(Biotage SP1,30g,C-18柱，采用含有0.1％NH3的10－80％MeCN/水洗脱)，获得目标化合物，为黄色油状物(241mg,76％)。
LCMS方法B：Rt＝3.12mins，ES+MS m/z 942.7[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 7.75(1H,d),7.60(1H,s),7.50-7.30(2H,m),7.15(1H,d),7.10-7.00(1H,m),5.40(2H,s),4.55(2H,s),3.70(2H,t),3.65-3.50(48H,m),2.50(2H,t),1.40(9H,s)。
实施例1
2,2',2”-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(E1)
Figure BDA0001687660830001261
向2,2',2”-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三乙酸(制备5,5.72mg,8.30μmol)的DMF(750μL)溶液中加入TEA(10.4μL,74.7μmol)，随后加入α-Gal(20.0mg,33.2μmol)的DMSO(250μL)溶液。加入HATU(12.6mg,33.2μmol)的DMF(250μL)溶液，将反应物于室温下氮气环境中搅拌1小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化(TRILUTIONTM Lunar C-18，采用含有0.1％NH3的10－40％MeCN/水洗脱35mins，然后采用含有0.1％NH3的40％MeCN/水洗脱5min)，获得为无色固体的目标化合物(10.3mg,51％)。
LCMS方法B：Rt＝1.47mins，ES+MS m/z[M+2H]+/2 1222.74，理论质量：2442.7
MALDI-ToF 2463.91[M+Na]
实施例2－12根据实施例1所述方法制备和纯化，采用如下所述的适当的羧酸或化学计量或过量的α-Gal。
实施例2
3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺(E2)
Figure BDA0001687660830001271
分离的收率：22％
LCMS方法A：Rt＝1.57mins，ES+MS m/z 1049.8[M+H]+
前体：制备11
实施例3
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-[2-({3-[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}甲酰氨基)乙基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E3)
Figure BDA0001687660830001281
分离的收率：36％
LCMS方法A：Rt＝1.73mins，ES-MS m/z 1647.9[M-H]-
前体：制备12
实施例4
N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-3-(2-氧代-2-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基)乙氧基)苯甲酰胺(E4)
Figure BDA0001687660830001282
分离的收率：35％
LCMS方法B：Rt＝1.49mins，ES+MS m/z 1049.8[M+H]+
前体：制备3
实施例5
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-1,3-亚苯基)二(氧基))二(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(E5)
Figure BDA0001687660830001291
分离的收率：17％
LCMS方法B：Rt＝1.41mins，ES-MS m/z 1706.8[M-H]-
前体：制备13
MALDI-ToF：单一同位素质量：1706.8，实测质量1729.6[M+Na]
实施例6
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-(2-{[3,5-二({[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲氧基})苯基]甲酰氨基}乙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E6)
Figure BDA0001687660830001292
分离的收率：33％
LCMS方法B：Rt＝1.65mins，ES+MS m/z 1155.2[M+2H]+/2，理论质量：2307.4
前体：制备10
MALDI-ToF：单一同位素质量：2306.0，实测质量2329.0[M+Na]
实施例7
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(E7)
Figure BDA0001687660830001301
分离的收率：10％
LCMS方法B：Rt＝1.56mins，ES+MS m/z 1783.9[M+H]+
前体：制备39
MALDI-ToF：单一同位素质量：1882.6，实测质量1905.6[M+Na]
实施例8
4-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺(E8)
Figure BDA0001687660830001311
分离的收率：42％
LCMS方法B：Rt＝1.49mins，ES+MS m/z 1049.7[M+H]+
前体：制备4
实施例9
2,2',2”,2”'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(E9)
Figure BDA0001687660830001312
分离的收率：23％
LCMS方法A：Rt＝1.38mins，ES+MS m/z 1552.0[M+2H]+/2，理论质量：3101.0
前体：制备7
MALDI-ToF：单一同位素质量：3099.1，实测质量3122.1[M+Na]
实施例10
4-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)喹啉-2-甲酰胺(E10)
Figure BDA0001687660830001321
分离的收率：50％
LCMS方法B：Rt＝1.72mins，ES+MS m/z 1100.9[M+H]+
前体：制备8
实施例11
4'-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺(E11)
Figure BDA0001687660830001322
分离的收率：74％
LCMS方法B：Rt＝1.72mins，ES+MS m/z 1125.9[M+H]+
前体：制备9
实施例12
N1-(3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苄基)-N6-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)己二酰二胺(adipamide)(E12)
Figure BDA0001687660830001331
分离的收率：15％
LCMS方法B：Rt＝1.52mins，ES+MS m/z 1162.9[M+H]+
前体：制备15
实施例13
N1-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-N6-(3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基)己二酰二胺(E13)
Figure BDA0001687660830001332
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-氧代-6-((3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基)氨基)己酸酯(制备14,13.5mg,24.9μmol)的DMF(500μL)溶液中加入DIPEA(13.0μL,74.7μmol)和α-Gal(15.0mg,24.9μmol)的DMSO(200μL)溶液。将反应物于室温下氮气环境中搅拌16小时，然后真空浓缩。将残留物采用反相柱色谱纯化(Trilution,Magellen C-18，采用5－40％的MeCN水溶液洗脱35mins，含有0.1％NH3的40％的MeCN水溶液洗脱5mins)，获得为无色固体的目标化合物(14.8mg,55％)。
LCMS方法B：Rt＝1.46mins，ES+MS m/z 1132.9[M+H]+
实施例14－16根据实施例48所述方法制备，采用如下所述的适当的苯甲酸和适当的胺。
实施例14
2,2'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3'-二基)二(氧基))二(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)(E14)
Figure BDA0001687660830001341
分离的收率：40％
LCMS方法B：Rt＝1.57mins，ES+MS m/z 1785.7[M+H]+
前体：制备16和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺
MALDI-ToF：单一同位素质量：1782.2，实测质量1805.7[M+Na]
实施例15
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-{2-[(3-{[(3-{[(2R,4R,5S)-5-{[(2S,4S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,4S,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲氧基}-5-(4-{[(3-{[(2R,4R,5S)-5-{[(2S,4S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,4S,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲氧基}苯基)苯基)甲酰氨基]乙基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E15)
Figure BDA0001687660830001351
分离的收率：22％
LCMS方法B：Rt＝1.69mins，ES+MS m/z 1193.2[M+2H]+/2，理论质量：2383.5
前体：制备17和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量：2382.0，实测质量2405.0[M+Na]
实施例16
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-[2-({3-[3,5-二({[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲氧基})苯基]-5-{[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]甲氧基}苯基}甲酰氨基)乙基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E16)
Figure BDA0001687660830001361
分离的收率：32％
LCMS方法A：Rt＝1.62mins，ES+MS m/z 1522.8[M+2H]+/2，理论质量：3042.1
前体：制备42和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量：3040.3，实测质量3063.3[M+Na]
实施例17
3-(((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)甲基)-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺(E17)
Figure BDA0001687660830001362
向溶于MeOH(1mL)的3-甲酰基-N-(2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)苯甲酰胺(制备35,20.0mg,33.2μmol)和α-Gal(13.9mg,33.2μmol)中加入AcOH(7.6μL,132μmol)和甲基吡啶-硼烷复合物(3.55mg,33.2μmol)。将反应物于室温下氮气环境中搅拌5天。将反应物真空浓缩，将残留物溶于2M HCl水溶液(2mL)，于室温下搅拌30分钟。真空浓缩溶剂，将残留物用水(1mL)处理。溶液通过滴加TEA中和至pH 7，采用反相柱色谱纯化(TRILUTION,Magellen C-18，采用含有0.1％NH3的10－40％MeCN/水洗脱35mins，含有0.1％NH3的40％MeCN/水洗脱5mins)，获得为无色固体的目标化合物(10.2mg,31％)。
LCMS方法B：Rt＝1.36mins，ES+MS m/z 1005.8[M+H]+
实施例18
1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-{3,5-二[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}苯氧基}乙酰氨基)-N-(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(E18)
Figure BDA0001687660830001371
/>
向1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二({[(14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲氧基})苯基]苯氧基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸在DMF中的粗品储备溶液(制备1,500μL,9.65μmol)中加入DIPEA(13.4μL,77.2μmol)，随后加入α-Gal(23.3mg,38.6μmol)的DMSO(200μL)溶液。加入HATU(14.7mg,38.6μmol)的DMF(200μL)溶液，将反应混合物于室温下氮气环境中搅拌2小时。将反应物真空浓缩，残留物采用反相柱色谱纯化(TRILUTION,Magellen C-18，采用含有0.1％NH3的5－40％MeCN/水洗脱35mins，然后采用含有0.1％NH3的40％MeCN/水洗脱5mins)，获得为无色固体的目标化合物(6.85mg,22％)。
LCMS方法B：Rt＝1.58mins，ES+MS m/z 1591.9[M+2H]+/2，理论质量：3184.3
MALDI-ToF：单一同位素质量：3182.3，实测质量3205.3[M+Na]
实施例19－21根据实施例18所述方法制备，采用如下所述的适当的羧酸和化学计量或过量的α-Gal。
实施例19
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-[2-({3-[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}甲酰氨基)乙基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E19)
Figure BDA0001687660830001381
分离的收率：43％
LCMS方法B：Rt＝1.87mins，ES+MS m/z 1897.6[M+H]+
前体：制备2
MALDI-ToF：单一同位素质量：1894.9，实测质量1917.9[M+Na]
实施例20
1-[2-(4-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}苯氧基)乙酰氨基]-N-(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(E20)
Figure BDA0001687660830001391
分离的收率：7％
LCMS方法B：Rt＝1.87mins，ES+MS m/z 1140.7[M+2H]+/2，理论质量：2278.7
前体：制备18
MALDI-ToF：单一同位素质量：2276.9，实测质量2299.9[M+Na]
实施例21
1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-[2-({3,5-二[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}甲酰氨基)乙基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(E21)
Figure BDA0001687660830001401
分离的收率：9％
LCMS方法B：Rt＝1.70mins，ES+MS m/z 1400.6[M+H]+
前体：制备6
MALDI-ToF：单一同位素质量：2800.4，实测质量2823.4[M+Na]
实施例22
RNA适体缀合物1的合成
Figure BDA0001687660830001402
方法1
向3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸(制备46,21eq)的DMF溶液中加入DMTMM氯化物(3eq)的DMF/水1:1溶液，将混合物于室温下搅拌20分钟。将该混合物加至RNA适体(C6-氨基-连接的-SEQ IDNO:79，源自国际专利申请PCT/GB2015/051812，本文中称为SEQ ID NO:1)在碳酸盐缓冲水溶液中，将反应物搅拌2小时。反应物通过加入TEAA骤冷，采用反相HPLC纯化，采用XBridge Prep C18柱(10×50mm,5μ)，用在TEAA水溶液中的5－20％的TEAA的MeCN溶液梯度洗脱。收集目标化合物，获得26OD(1mg)。
LCMS(XBridge OST C18柱(2.1×50mm,2.5μm)，采用1－36％的溶剂B的溶剂A溶液洗脱30分钟.(溶剂A＝100mmol HFIP、16.3mmolTEA和1％的MeOH水溶液；溶剂B＝100mmolHFIP、16.3mmol TEA和95％MeOH)，流速0.25mL/min。
Rt＝20.43分钟；MS[M+H]+15073.4
实施例23
RNA适体缀合物2的合成
Figure BDA0001687660830001411
目标化合物根据实施例22所述方法制备，采用3',5-二(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备17)和RNA适体(C6-氨基-连接的-SEQ ID NO:79，源自国际专利申请号PCT/GB2015/051812；在本文中称为SEQ ID NO:1)，获得12OD(0.5mg)。LCMS条件如实施例22所用。
Rt＝20.81分钟；MS[M+H]+15806.8
实施例24
RNA适体缀合物3的合成
Figure BDA0001687660830001412
目标化合物根据实施例22所述方法制备，采用3',5,5'-三(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备42)和RNA适体(C6-氨基-连接的-SEQ ID NO:79，源自国际专利申请号PCT/GB2015/051812；在本文中称为SEQ ID NO:1)，获得10.2OD(0.41mg)。LCMS条件如实施例22所用。
Rt＝20.46分钟；MS[M+H]+16465.7
实施例25
DNA适体缀合物1的合成
Figure BDA0001687660830001421
目标化合物根据实施例22所述方法制备，采用3-(2-((3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯甲酸(制备46)和DNA适体(C6-氨基-连接的-GAS适体20A24，P,J.Mol.Med(2015)93,619-631；在本文中称为SEQ ID NO:2)。
LCMS条件如实施例22所用。
Rt＝18.41分钟；MS[M+H]+26021.3
制备适体缀合物的替代方法
方法2
向所需羧酸(1mg，1eq)的DMF(30μl)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.1eq)，然后加入二异丙基碳二亚胺(1.05eq)，将反应物在室温下搅拌过夜。将获得的混合物分两次加入到适体(1eq)的碳酸盐缓冲水溶液中，相隔1小时。在室温下搅拌反应物，根据需要加入额外当量的NHS-活化的酸以形成所需的反应产物。如实施例22所述，获得的溶液采用制备性反相HPLC纯化，获得适体-糖缀合物。
方法3
向所需羧酸(1mg，1eq)的DMF(30μL)的溶液中加入DMTMM BF4盐的DMF溶液(2eq)，将混合物在室温下搅拌40分钟。将5eq所得溶液加入到适体(1eq)在碳酸盐缓冲水溶液中的溶液中，将反应物搅拌40分钟。如果需要，再加入5eq活化的酸，将反应物在室温下搅拌1小时。如实施例22所述，获得的溶液采用制备性反相HPLC纯化，得到期望的适体-糖缀合物。
实施例26－43根据方法1－3之一的方法制备并分析，采用RNA适体1(C6-氨基-连接的-SEQ ID NO:79，PCT/GB2015/051812；在本文中称为SEQ ID NO:1)和下文所述的适当的羧酸：
实施例26
RNA适体缀合物4的合成
Figure BDA0001687660830001431
方法：2
前体：制备90
计算的MWt：15148
实测的DatA：Rt＝21.80分钟；80.4％；MS 15150
实施例27
RNA适体缀合物5的合成
Figure BDA0001687660830001441
方法：1
前体：制备85
计算的MWt：15396
实测的DatA：Rt＝22.74分钟；95.7％；MS 15396
实施例28
RNA适体缀合物6的合成
Figure BDA0001687660830001442
方法：2
前体：制备86
计算的MWt：16302
实测的DatA：Rt＝22.58分钟；90.9％；MS 16303
实施例29
RNA适体缀合物7的合成
Figure BDA0001687660830001443
方法：2
前体：制备84
计算的MWt：17007
实测的DatA：Rt＝22.74分钟；92.6％；MS 17005
实施例30
RNA适体缀合物8的合成
Figure BDA0001687660830001451
方法：1
前体：制备83
计算的MWt：17209
实测的DatA：Rt＝22.80分钟；86.3％；MS 17207
实施例31
RNA适体缀合物9的合成
Figure BDA0001687660830001452
方法：1
前体：制备87
计算的MWt：18265
实测的DatA：Rt＝29.52分钟；90.1％；MS 18265
实施例32
RNA适体缀合物10的合成
Figure BDA0001687660830001461
方法：1
前体：制备89
计算的MWt：16721
实测的DatA：Rt＝20.89分钟；89.5％；MS 16721
实施例33
RNA适体缀合物11的合成
Figure BDA0001687660830001462
方法：1
前体：制备88
计算的MWt：17463
实测的DatA：Rt＝22.91分钟；86.2％；MS 17465
实施例34
RNA适体缀合物12的合成
Figure BDA0001687660830001471
方法：1
前体：制备91
计算的MWt：15883
实测的DatA：Rt＝22.23分钟；92.6％；MS 15882
实施例35
RNA适体缀合物13的合成
Figure BDA0001687660830001472
方法：1
前体：制备96
计算的MWt：16932
实测的DatA：Rt＝22.04分钟；99.9％；MS 16933
实施例36
RNA适体缀合物14的合成
Figure BDA0001687660830001481
方法：2
前体：制备95
计算的MWt：17285
实测的DatA：Rt＝22.82分钟；89.5％；MS 17286
实施例37
RNA适体缀合物15的合成
Figure BDA0001687660830001482
方法：1
前体：制备97
计算的MWt：17675
实测的DatA：Rt＝23.16分钟；89.6％；MS 17675
实施例38
RNA适体缀合物16的合成
Figure BDA0001687660830001483
方法：1
前体：制备98
计算的MWt：18027
实测的DatA：Rt＝26.50分钟；90.7％；MS 18028
实施例39
RNA适体缀合物17的合成
Figure BDA0001687660830001491
方法：1
前体：制备92
计算的MWt：17200
实测的DatA：Rt＝20.79分钟；90.4％；MS 17201
实施例40
RNA适体缀合物18的合成
Figure BDA0001687660830001492
方法：3
前体：制备93
计算的MWt：18188
实测的DatA：Rt＝22.17分钟；83.3％；MS 18189
实施例41
RNA适体缀合物19的合成
Figure BDA0001687660830001501
方法：3
前体：制备94
计算的MWt：16465
实测的DatA：Rt＝19.99分钟；83.7％；MS 16464
实施例42
RNA适体缀合物20的合成
Figure BDA0001687660830001502
前体：制备99
计算的MWt：16692
实测的DatA：Rt＝20.66分钟；83.3％；MS 16690
实施例43
RNA适体缀合物21的合成
Figure BDA0001687660830001511
方法：3
前体：制备100
计算的MWt：18642
实测的DatA：Rt＝25.61分钟；83.3％；MS 18641
实施例44－47根据方法1－3之一的方法制备并分析，采用RNA适体2(C6-氨基-连接的-SEQ ID fmA12Δ9，Biomaterials 36(2015)110-123；在本文中称为SEQ ID NO:3)和如下所述的适当的羧酸：
实施例44
RNA适体缀合物22的合成
Figure BDA0001687660830001512
方法：1
前体：制备85
计算的MWt：21765
实测的DatA：Rt＝22.84分钟；99.6％；MS 21766
实施例45
RNA适体缀合物23的合成
Figure BDA0001687660830001521
方法：1
前体：制备86
计算的MWt：22670
实测的DatA：Rt＝22.56分钟；97.2％；MS 22671
实施例46
RNA适体缀合物24的合成
Figure BDA0001687660830001522
方法：1
前体：制备83
计算的MWt：23576
实测的DatA：Rt＝22.56分钟；98.2％；MS 23577
实施例47
RNA适体缀合物25的合成
Figure BDA0001687660830001531
方法：1
前体：制备42
计算的MWt：22833
实测的DatA：Rt＝21.27分钟；97.3％；MS 22836
核酸适体合成
对本领域技术人员显而易见的是，本文使用的核酸适体可以根据常用常识内的技术来合成，例如固相核苷酸合成(CR Noe，LKaufhold；Chemistry of AntisenseOligonucleotides in New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry(合成药物化学中反义寡核苷酸化学新趋势)，Ed:F Gualtieri；Wiley-VCH,Weinheim,2000；第261－347页，ISBN 3527297995)。
实施例48－62根据实施例1或实施例48所述的方法制备，采用适当的羧酸和化学计量或过量α-Gal或生物素化的胺，搅拌1－24小时，采用如下所述的反相纯化条件，除非另有说明：
反相条件：
方法1：Trilution(Magellen C-18，用2－50％的含有0.1％NH3的MeCN/水洗脱35分钟，40％的含有0.1％NH 3的MeCN/水洗脱5分钟)
实施例48
1-{2-[4-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-[({38-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷(octatriacontan)-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基)苯氧基]乙酰氨基}-N-(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺
Figure BDA0001687660830001541
向4',5-二((46-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3,43-二氮杂四十六烷基)氧基)-[1,1'-联苯]-3-甲酸(制备84,8.50mg,3.13μmol)的DMSO/DMF(1:5v/v,1.5mL)溶液中加入DIPEA(1.64μL,9.40μmol)和1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-N-(2-氨基乙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺(制备41,4.16mg,4.70μmol)。加入HATU(1.79mg,4.70μmol)的DMF(200μL)溶液，将反应物于室温下氮气环境中搅拌1小时。将反应物真空浓缩，采用反相柱色谱纯化，采用纯化方法1，获得为无色固体的目标化合物(6.25mg,56％)。
LCMS方法B：Rt＝1.86mins，ES-MS m/z 1791.1[M-2H]-/2，理论质量：3583.0
MALDI-ToF：单一同位素质量3580.8，实测质量3603.6[M+Na]
实施例49
1-[2-(4-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[({38-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}苯氧基)乙酰氨基]-N-(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺
Figure BDA0001687660830001551
方法：实施例48
分离的收率：40％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.80mins，ES+MS m/z 1492.9[M+2H]+/2，理论质量：2983.2
前体：制备84和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺.
MALDI-ToF：单一同位素质量2981.4，实测质量3004.4[M+Na]
实施例50
3-((46-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3,43-二氮杂四十六烷基)氧基)-N-(4,44-二氧代-48-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷基(octatetracontyl))苯甲酰胺
Figure BDA0001687660830001561
方法：实施例1
分离的收率：64％,纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.85mins ES+MS m/z 1125.7[M+2H]+/2，理论质量：2248.5
前体：制备106
MALDI-ToF：单一同位素质量2247.1，实测质量2270.1[M+Na]
实施例51
1-(2-{2-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-4-{3,5-二[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}-5-[({14-[(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯氧基}乙酰氨基)-N-(3-{[(2R,5S)-5-{[(2S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
Figure BDA0001687660830001571
向溶于DMF(1mL)的1,1',1'',1”'-((5-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-2,3',4,5'-四基)四(氧基))四(2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸)(制备109,10.6mg,6.7μmol)溶液中加入DIPEA(13.9μL,75.2μmol)和α-Gal(28.3mg,47.0μmol)的DMSO(400μL)溶液。加入HATU(21.4mg,56.4μmol)，将反应物于室温下氮气环境中搅拌2小时。将反应物真空浓缩，根据方法1纯化，获得为无色固体的目标化合物(1.33mg,5％)。
LCMS方法B：Rt＝1.54mins ES+MS m/z 1364.6[M+3H]+/3，理论质量：4090.2
MALDI-ToF：单一同位素质量4087.7，实测质量4111.0[M+Na]
实施例52
4'-((22-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷基)氧基)-N-(4,44-二氧代-48-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
Figure BDA0001687660830001572
方法：实施例48
分离的收率：74％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.90mins ES+MS m/z 1973.7[M+H]+，理论质量：1972.2
前体：制备85和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量1970.9，实测质量1993.9[M+Na]
实施例53
1,1'-((2,2'-((5-((4,44-二氧代-48-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4'-二基)二(氧基))二(乙酰基))二(氮烷二基))二(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺)
Figure BDA0001687660830001581
方法：实施例48
分离的收率：59％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.77mins ES+MS m/z 1438.0[M-2H]-/2，理论质量：2878.1
前体：制备86和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量2876.3，实测质量2899.3[M+Na]
实施例54
1,1',1”-((2,2',2”-((5'-((4,44-二氧代-48-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(乙酰基))三(氮烷二基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺)
Figure BDA0001687660830001591
方法：实施例48
分离的收率：61％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.70mins ES+MS m/z 1890.7[M-2H]-/2，理论质量：3784.0
前体：制备83和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量3781.7，实测质量3804.2[M+Na]
实施例55
2,2',2”-((3'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,4,5-三基)三(氧基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)
Figure BDA0001687660830001601
方法：实施例1
分离的收率：11％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.43mins ES+MS m/z 1222.2[M+2H]+/2，理论质量：2442.4
前体：制备102
MALDI-ToF：单一同位素质量2440.9，实测质量2464.0[M+Na]
实施例56
1-[2-(3-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[({38-[(3-{[(2R,5S,6R)-5-{[(2S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}-5-[({38-[(3-{[(2R,5S,6R)-5-{[(2S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯氧基)乙酰氨基]-N-(3-{[(2R,5S,6R)-5-{[(2S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺
Figure BDA0001687660830001611
方法：实施例48
分离的收率：78％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.76mins，ES+MS m/z 1414.8[M+3H]+/3和ES+MS m/z 1061.4[M+4H]+/4，理论质量：4241.6
前体：制备87和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺
MALDI-ToF：单一同位素质量4239.0，实测质量4261.7[M+Na]
实施例57
1-[2-(3-{[2-(1-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-{3,5-二[({38-[(3-{[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基}氨基甲酰基)甲氧基]苯基}苯氧基)乙酰氨基]-N-(3-{[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰胺
Figure BDA0001687660830001621
方法：实施例48
分离的收率：46％,纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.81mins ES+MS m/z 1211.4[M+4H]+/4，理论质量：4841.3
前体：制备87和制备41
MALDI-ToF：单一同位素质量4838.3，实测质量4860.9[M+Na]
实施例58
1,1',1”-((2,2',2”-((5'-((15,20-二氧代-24-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-3,6,9,12-四氧杂-16,19-二氮杂二十四烷基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(乙酰基))三(氮烷二基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺)
Figure BDA0001687660830001622
方法：实施例48，采用额外当量的碱(2eq)和HATU(1.3eq)。
分离的收率：10％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.62mins ES+MS m/z 1144.9[M+3H]+/3，理论质量：3431.6
前体：制备101和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺.
MALDI-ToF：单一同位素质量3429.5，实测质量3452.4[M+Na]
实施例59
1-(2-{3-[(2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰氨基}乙基)氨基甲酰基]-5-[3,5-二({[14-({3-[(3-{[(2R,4R,5S)-5-{[(2S,4S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,4S,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]丙基}氨基甲酰基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基]氨基甲酰基}甲氧基)苯基]苯氧基}乙酰氨基)-N-{3-[(3-{[(2R,4R,5S)-5-{[(2S,4S,5S)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-{[(2R,4S,5R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}环氧己烷-2-基]氧基}-3-乙酰氨基-4-羟基-6-(羟基甲基)环氧己烷-2-基]氧基}丙基)氨基甲酰基]丙基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
Figure BDA0001687660830001631
方法：实施例48
分离的收率：94％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.47mins ES+MS m/z 1147.8[M+3H]+/3，理论质量：3439.6
前体：制备88和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺.
MALDI-ToF：单一同位素质量3437.5，实测质量3460.5[M+Na]
实施例60
4,4',4”-((2,2',2”-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1'-联苯]-3,3',5-三基)三(氧基))三(乙酰基))三(氮烷二基))三(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)丁酰胺)
Figure BDA0001687660830001641
方法：实施例48
分离的收率：42％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.47mins ES+MS m/z 1349.8[M+2H]+/2，理论质量：2697.7
前体：制备89和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺。
MALDI-ToF：单一同位素质量2696.1，实测质量2719.1[M+Na]
实施例61
2,2'-((3”-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1':3',1”-三联苯]-3,5-二基)二(氧基))二(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)
Figure BDA0001687660830001651
方法：实施例48
分离的收率：65％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.78mins ES+MS m/z 1860.2[M+H]+，理论质量：1859.91
前体：制备91和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺.
实施例62
2,2',2”,2”'-((5'-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)乙基)氨基甲酰基)-[1,1':3',1”-三联苯]-3,3”,5,5”-四基)四(氧基))四(N-(3-(((2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-5-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,5-二羟基-6-(羟基甲基)-4-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-4-羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)丙基)乙酰胺)
Figure BDA0001687660830001661
/>
方法：实施例48
分离的收率：43％，纯化方法1
LCMS方法B：Rt＝1.48mins，ES+MS m/z 1589.6[M+2H]+/2，理论质量：3177.1
前体：制备92和N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺。
试验
ELISA试验
采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定含有F(代表能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)和L(作为生物素)的化合物在该化合物两端的结合。链霉亲和素包被的平板将生物素捕获到平板表面，用HRP(辣根过氧化物酶)标记的二级抗体报道抗-α-半乳糖基抗体与α-半乳糖基部分的结合。设计ELISA试验以证明试剂与化合物的F和L部分同时结合。
将化合物从磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8537)+0.025％DMSO(二甲基亚砜，Sigma D8418)中的50nM最高剂量(top dose)滴定1.5倍。链霉亲和素固定剂(immobilizer)96孔板(nunc 436014)在室温下采用100μL化合物包被2小时，以500rpm振荡。将板用2×200μL PBS-T(含有0.05％Tween 20的PBS(Sigma P9416))和1×200μL PBS-T洗涤，于室温下振荡温育5分钟，然后用PBS-T中的1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma A2153)在室温下封闭1小时。除去封闭缓冲液后，将50μL的抗-α-半乳糖基IgG抗体(使用Rockland ImmunochemicalsInc.的α-半乳糖基-HAS(人血清白蛋白)琼脂糖凝胶柱通过亲和纯化从人IVIG(Gammagard)中纯化获得的抗-α-半乳糖基抗体)，以0.5μg/mL溶于PBS-T+1％BSA，于室温下振荡温育1小时。
在加入50μL的1:5000山羊抗-人IgG-HRP(辣根过氧化物酶)缀合物(Abcamab97175)之前，将板用2×200μL的PBS-T和3×200μL的PBS-T洗涤。将板于室温下振荡温育1小时，然后用2×200μL的PBS-T和3×200μl的PBS-T洗涤同时于室温下振荡5分钟，向板中加入100μL的TMB缓冲液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，辣根过氧化物酶的发色底物)(Pierce34021)并使其显色5－10分钟，然后样品用50μL的2M硫酸(Sigma 258105)骤冷。在Envision板读数器(Perkin Elmer)上于450nm处读取吸光度。将获自孔(一式二份)的结果平均，计算50％结合亲和力。
表1显示了采用上述ELISA的实施例的结合活性。达到半数最大结合的浓度以几何平均值表示，括号中为标准误。还给出了独立实验的次数。为了获取信号，需要分子的两个末端同时结合(生物素与链霉亲和素以及α-半乳糖基与抗α-半乳糖基抗体)。
表1
Figure BDA0001687660830001671
/>
Figure BDA0001687660830001681
采用α-半乳糖基IgG抗体的流式细胞试验
流式细胞术用于证明L(作为EGFR核酸适体，RNA适体1，C6-氨基-连接的-SEQ IDNO:79,PCT/GB2015/051812；在本文中称为SEQ ID NO:1)与人细胞系上的受体和F(作为能与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水合物分子)结合。A431细胞用于捕获EGFR核酸适体，众所周知，该细胞显著地过度表达EGFR受体。采用次级藻红蛋白标记的抗-人IgG抗体来检测α-半乳糖基IgG抗体与化合物的结合。
将化合物直接用于测定试验中，或在用于试验之前加热至70℃10分钟，冷却至室温10分钟。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，以5×10 6个细胞/mL重悬于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白–Sigma A2153)+0.1mg/mL酵母t-RNA(Invitrogen 15401-011)+5mM MgCl2(Sigma M1028)，在冰上孵育30分钟以封闭。然后在室温下将5×105个细胞与如下所述的各种浓度的化合物或者缓冲液一起温育，以450rpm振荡1小时。用3×200μL的PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后在PBS+0.1％BSA中以45μg/mL添加50μL的抗-α半乳糖基IgG抗体(从人IVIG常规纯化，Rockland Immunochemicals,Inc.)，于4℃温育1小时。用3×200μL的PBS+0.1％BSA进一步洗涤细胞，然后用100μL的1:40稀释的抗人IgG-PE(藻红蛋白)(Biolegend 409303)于4℃处理1小时。最后用200μL的PBS+0.1％BSA洗涤3次后，将细胞重悬于200μL的PBS+0.1％BSA中，在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上评估。获自所有样品的数据在Kaluza软件包(Beckman Coulter)中进行分析。
图1显示采用实施例22(图1A)、实施例23(图1B)和实施例24(图1C)将抗-α-半乳糖基IgG抗体捕获到细胞表面。由于该分子每个端的结合事件，荧光强度(PE)发生改变。
图2为使用所述流式细胞试验对实施例22－24进行的剂量滴定。图2显示通过实施例22－24在抗半乳糖基抗体向人癌细胞系A431募集方面的差异。募集的增加以发射于荧光标记的二级抗体的平均荧光强度(MFI)的增加表示。
表2显示了实施例26－39在上述流式细胞试验中的结合活性。通过将在10nM或1μMalphamer存在下获得的平均荧光强度(MFI)除以没有alphamer存在下获得的平均荧光强度(MFI)来计算相对于基线的变倍数值(The fold shift over background)。相对于基线的变倍数值以具有括号内的标准误的几何平均值表示。还报告了独立实验的次数。为了获得信号，需要分子的两个末端结合(适体与A431细胞的细胞表面上的EGFR的结合以及α-半乳糖基与抗-α-半乳糖基抗体的结合)
表2
Figure BDA0001687660830001701
图3显示采用实施例40(图3A)、实施例41(图3B)、实施例42(图3C)和实施例43(图3D)将抗-α-半乳糖基抗体捕获到细胞表面。由于分子各端的结合事件，荧光强度(PE)发生改变。
图4是采用所述流式细胞试验对实施例40－43进行的剂量滴定。图4显示通过实施例40－43在抗半乳糖基抗体向人癌细胞系A431募集方面的差异。募集的增加以相对于基线的变倍数值表示。
采用抗-人IgM-F(ab’)2片段抗体的流式细胞试验
流式细胞术用于证明L(作为蛋白质A核酸适体，RNA适体2，C6-氨基-连接的-SEQ-IDfmA12Δ9,Biomaterials 36(2016)110－123；在本文中称为SEQ ID NO:3)与金黄色葡萄球菌上的蛋白A和F(作为能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)结合。蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁中的表面蛋白。采用二级FITC标记的抗-人IgM-F(ab’)2片段抗体检测α-半乳糖基与化合物的结合。
将化合物溶解于不含核酸酶的dH2O中，直接用于试验，或加热至70℃10分钟，在用于试验之前冷却至室温10分钟。
试验在聚苯乙烯96孔U底板(Costar)中进行。将96孔板用酪蛋白封闭缓冲液(Thermo Fisher 37528)预先封闭，然后在试验前用(HBSS+/+)(Life Technologies14025-050)洗涤三次。金黄色葡萄球菌Newman菌株细菌(Public Health England，NCTC10833)在LB培养基(Fisher BP1426-500)中生长至指数后期。随后，将细菌以10000rpm离心5分钟，以2*109CFU/mL的细菌密度重新悬浮于HBSS+/+。向细菌中加入Celltrace Far RedCell染色试剂盒(Thermo Fisher C34564)，至最终浓度为1μM，于室温下黑暗中温育20分钟。向细菌中加入PBS(Sigma D8662)+1％BSA(Sigma A2153)(原始细菌悬浮液体积的5倍)，于室温下黑暗中温育10分钟。将细菌离心(10000rpm，5分钟)，以2×109CFU/mL的浓度重新悬浮于HBSS+/+中。然后将1×108CFU与各种浓度的实施例44－47(图5)一起或与单独的缓冲液一起在室温下孵育，以450rpm振荡1小时。用3×200μL的HBSS+/+洗涤细菌(以4000rpm离心5分钟)，然后加入100μL的在HBSS+/+中的50μg/mL的抗-α-半乳糖基人IgM M86抗体(由Absolute Antibody常规制备)。将该板于室温下温育1小时。用3×200μL的HBSS+/+洗涤细菌(以4000rpm离心5分钟)，然后加入100μL的在HBSS+/+中的15μg/mL的抗-人IgM F(ab’)2-FITC片段抗体(Jackson ImmunoResearch 109-096-127)，于室温下温育1小时。最后用3×200μL的HBSS+/+洗涤后，将细菌重新悬浮于200μL的HBSS+/+中，在流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)上评估。所有样品的数据采用Kaluza软件包(Beckman Coulter)分析。样品一式三份操作，试验重复二次。
图5是采用所述流式细胞试验对实施例44－47进行的剂量滴定，证明了浓度为1.25－20μM的实施例44(图5A)、实施例45(图5B)、实施例46(图5C)和实施例47(图5D)的抗半乳糖基抗体向金黄色葡萄球菌的募集。抗半乳糖基抗体的募集的增加表示为发射于荧光标记的二级抗体的MFI的增加。通过将在化合物存在下获得的MFI除以在不存在化合物情况下获得的MFI来计算相对于基线的变倍数值，以括号中的标准误表示。图5(右图)证明采用20μM实施例44(图5A)、实施例45(图5B)、实施例46(图5C)和实施例47(图5D)将抗-α-半乳糖基抗体捕获到细菌表面。由于分子各端的结合事件，荧光强度(FITC)发生改变。
L(作为GAS核酸适体，C6-氨基连接的-20A24P，J.Mol.Med(2015)93，619－631；本文中称为SEQ ID NO：2)与如由实施例25所例举的A组链球菌(GAS)细菌上的受体和F(能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)的结合可以如Kristian等(同上)所述推断。
采用α-半乳糖基IgM抗体的流式细胞试验
采用流式细胞术证明L(作为EGFR核酸适体，RNA适体1，C6-氨基-连接的-SEQ IDNO:79，PCT/GB2015/051812；本文称为SEQ ID NO:1)与人细胞系上的受体和F(作为能够与人抗-α-半乳糖基抗体结合的碳水化合物分子)的结合。A431细胞用于捕获EGFR核酸适体，众所周知，该细胞显著地过度表达EGFR受体。采用二级FITC(荧光素)标记的抗-人IgM抗体来检测α-半乳糖基IgM抗体与化合物的结合。
在用于试验之前，将化合物加热至70℃10分钟，冷却至室温10分钟。
收获A431细胞(ATCC CRL-1555)，将其以5×106个细胞/mL重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma D8662)+0.1％BSA(牛血清白蛋白–Sigma A2153)+0.1mg/mL酵母t-RNA(Invitrogen 15401-011)+5mM MgCl2(Sigma M1028)，在冰上孵育30分钟以封闭。然后将5×105个细胞与如下所述的3μM化合物一起或者与单独的缓冲液一起于室温下温育，于450rpm振荡1小时。
用3×200μL的PBS+0.1％BSA洗涤细胞，然后加入50μL在PBS+0.1％BSA中的32μg/mL抗-α-半乳糖基IgM抗体，于4℃温育1小时。抗-α-半乳糖基IgM抗体为常规设计制备的人IgM抗体，该抗体采用了从Absolute Antibody获得的M86抗-α-半乳糖基抗体，其具有以下可变区氨基酸序列：
VH:
EVKLDETGGGLVQPGRSMKLSCVASGFIFSDYWMNWVRQSPEKGLEWIAQIRTNPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMKNLRSEDMGIYYCTWSHYALDNWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:8)；
VL:
DVLVTQNPLSLSVSLGDQASISCRSSQNLVHNDGNTYLHWYL
QKPGQSPKLLIHRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED
LGVYFCSQSTHIPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:9)。
用3×200μL的PBS+0.1％BSA进一步洗涤细胞，然后采用100μL的1:40稀释的抗-人IgM-FITC(Biolegend 314506)于4℃处理1小时。最后用3×200μL的PBS+0.1％BSA洗涤后，将细胞重新悬浮于200μL的PBS+0.1％BSA中，采用流式细胞仪(FC500Beckman Coulter)评估。所有样品的数据在Kaluza软件包(Beckman Coulter)中进行分析。
图6显示使用实施例22(图6A)、实施例23(图6B)和实施例24(图6C)将抗-α-半乳糖基IgM抗体捕获到细胞表面。由于分子各端的结合事件，荧光强度(FITC)发生改变。
Figure IDA0001687660870000011
Figure IDA0001687660870000021
Figure IDA0001687660870000031
Figure IDA0001687660870000041

Claims (13)

1.式(I)化合物或其可药用的盐：
Figure FDA0004092149950000011
其中：
L代表选自下列的核酸适体：SEQ ID NO:1的核酸适体、SEQ ID NO:2的核酸适体和SEQID NO:3的核酸适体；
S1代表选自-(CH2)6-、-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-和-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)5-CONH-(CH2)6-的间隔基团；
S2代表选自-(CH2)3-NHCO-CH2-和-(CH2)3-NHCO-(CH2CH2O)4-(CH2)2-NHCO-CH2-的间隔基团；
X1代表-O-；
Y1代表-C(O)NH-；
Y2代表-O-；
F代表
Figure FDA0004092149950000012
其中S2是指与S2基团的连接点；
m代表选自1-4的整数；并且
Cy代表苯基、联苯基或三苯基，从而使得当Cy代表联苯基或三苯基时，所述-Y1-S1-X1-L基团可以存在于任何所述苯基环上，所述[F-S2-Y2]m-基团可以存在于任何所述苯基环上。
2.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其中m代表选自3或4的整数。
3.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其中m代表选自1-3的整数。
4.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其中m代表选自2或3的整数。
5.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其中m代表选自1或2的整数。
6.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其中m代表整数1。
7.权利要求1所定义的化合物或其可药用的盐，其选自：
Figure FDA0004092149950000021
/>
Figure FDA0004092149950000031
/>
Figure FDA0004092149950000041
8.药用组合物，该药用组合物包含权利要求1-7中任一项所定义的化合物或其可药用的盐。
9.权利要求1-7中任一项所定义的化合物或其可药用的盐，用于治疗。
10.权利要求1-7中任一项所定义的化合物或其可药用的盐，用于治疗癌症或由感染物介导的疾病。
11.权利要求1-7中任一项所定义的式(I)化合物或其可药用的盐在生产药物中的用途，该药物用于治疗癌症或由感染物介导的疾病。
12.权利要求1所定义的式(I)化合物的制备方法，该方法包括：
(a)通过使得式(II)化合物与式(III)化合物反应制备式(I)化合物，其中Y1代表-CONH-，所述式(I)化合物相应于式(IA)化合物：
Figure FDA0004092149950000051
其中S2、Y2、m、Cy、S1、X1、L和F如权利要求1所定义；或者
(b)通过使得式(IV)化合物与式(V)化合物反应制备式(I)化合物，其中S2代表-(CH2)3-NHCO-CH2-并且Y2代表-O-，所述式(I)化合物相应于式(IB)化合物：
Figure FDA0004092149950000052
其中Y2、m、Cy、Y1、S1、X1、L和F如权利要求1所定义；或者
(g)通过使得式(IIA)化合物与式(III)化合物反应制备式(I)化合物，其中Y1代表-CONH-并且S1包含-CONH-基团，所述式(I)化合物相应于式(IG)化合物：
Figure FDA0004092149950000053
其中F、S2、Y2、m、Cy、S1、X1、L和F如权利要求1所定义。
13.权利要求12所定义的式(II)、(IIA)、(V)化合物。
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