CN108472308A

CN108472308A - 应答指导型hcv疗法

Info

Publication number: CN108472308A
Application number: CN201680074916.9A
Authority: CN
Inventors: 雷蒙德·F·斯基那兹
Original assignee: AMORY UNIV
Current assignee: AMORY UNIV
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2018-08-31
Also published as: US20180311268A1; US20230201237A1; US20200352974A1; WO2017070355A1; CA3000951A1

Abstract

本公开涉及包含抗HCV化合物的固体剂型以及使用此类剂型治疗或预防HCV感染的方法。直接作用性抗病毒剂(DAA)治愈率高，在丙型肝炎病毒(HCV)感染者中有良好的耐受性。然而，更短的疗程可以提高依从性、可负担性，并增加DAA的可及性。在具有快速病毒学应答(RVR)的个体中，向双重NS5A‑NS5B(核苷)抑制剂中加入NS3蛋白酶抑制剂可增强抗病毒功效，并将治疗持续时间缩短至3周(wks)，所述RVR被定义为到治疗第2天血浆HCVRNA<500IU/mL，或<1,000IU/mL。

Description

应答指导型HCV疗法

技术领域

本公开涉及包括三种或更多种活性特异性抗HCV化合物的制剂，其用于组合疗法，使用所述制剂治疗、治愈或预防HCV感染的方法，以及提供应答指导型HCV疗法的方法。

背景技术

近期估计显示全球感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的人数超过1.7亿，其中包括美国的300万人。感染率大约是人体免疫缺陷病毒(HIV)的感染率的4至5倍。而在某些个体中，天然免疫应答能够克服病毒，在大多数情况下，会建立慢性感染，导致发展为肝硬化和肝细胞癌的风险增加。

导致HCV感染的病毒是属于黄病毒(Flaviviridae)科的正链RNA病毒。HCV基因组编码多聚蛋白，在病毒生命周期中该多聚蛋白被切割成十个单独的蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白。六种非结构蛋白，被称为NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，是RNA复制所必需的。特别地，NS5A蛋白似乎在病毒复制以及调节宿主细胞生理中发挥重要作用。抑制NS5A蛋白功能的化合物可用于HCV疗法。

历史上，治疗慢性HCV感染的护理标准包括向患者组合施用聚乙二醇干扰素α(peg-interferon-alpha)和利巴韦林(ribavirin)。治疗过程也很漫长，通常为48周，通常伴有严重的不良副作用，包括抑郁症、流感样症状、疲劳和溶血性贫血，并且在高达50％的患者中是无效的。

然后批准了HCV蛋白酶抑制剂与干扰素和利巴韦林组合使用。治疗过程仍然漫长，并伴有不良副作用。

一种相对较新的疗法包括用核苷氨基磷酸酯前药——Sovaldi(索非布韦(Sofosbuvir))治疗，其抑制丙型肝炎病毒用来复制其RNA的RNA聚合酶。索非布韦通常与利巴韦林一起使用或与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林组合使用。

最近，批准了一种称为Harvoni(索非布韦和雷迪帕韦(Ledipasvir)的组合，一种NS5A抑制剂)的疗法。其作为单一每日药丸施用，含有90mg的雷迪帕韦和400mg的索非布韦。

虽然这些治疗非常成功，但它们的治疗时间相对较长，例如索非布韦为12周，Harvoni为8周。这些治疗的成本过高，而且患者的依从性很困难。

因此，在HCV治疗中，仍然迫切需求花费时间显著少于8或12周、且与患者依从性相关的问题更少的疗法。本发明提供了这样的疗法。

发明内容

在一个实施方案中，本公开涉及使用组合疗法来治疗HCV感染的组合物和方法。所述组合疗法包括至少一种RNA聚合酶抑制剂(也称为NS5B抑制剂)，至少一种NS5A抑制剂，和至少一种NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，非核苷聚合酶抑制剂和NS4A或解旋酶抑制剂。

代表性的治疗剂包括索非布韦、达卡他韦(daclatasvir)、雷迪帕韦、GS-5816、西咪匹韦(Simeprevir)和阿那匹韦(Asunaprevir)。所述方法包括施用这些抗HCV剂中的至少三种，任选地，这些治疗性抗HCV剂中的四种或更多种。

在另一个实施方案中，本公开涉及包括这些试剂中的三种或更多种的固体剂型，其是单剂型或双或多剂型。在该实施方案的一个方面，固体剂型包括所有化合物在单一单位剂型中。

在另一方面，本公开涉及固体剂型，其包括一种或更多种片剂、丸剂或胶囊，其包括(总共)，

(i)以下中的两种或三种：

a)剂量为400-1600mg QD的SOF；

b)剂量为90-180mg QD的LDV或剂量为60-120mg QD的DCV；以及

c)剂量为150-600mg QD的SMV或剂量为100-400mg BID的ASV，

(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。

所述药学上可接受的载体或赋形剂可以包括稳定化聚合物或药学上可接受的稳定化聚合物的组合，其量为第二组合物的重量的至少5％，和/或

(iii)药学上可接受的释放速率改变聚合物或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，其量为第二组合物的重量的至少5％；

其中，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合，和释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合可以相同或不同。

用于治疗需要这种治疗的受试者中的HCV感染的方法包括向受试者施用至少一种如本文所述的剂型，至少每日一次。在该实施方案的一个方面，所述方法包括向受试者施用两种或三种如本文所述的剂型，每日一次或两次。在另一方面，所述方法包括向受试者施用三种或更多种如本文所述的剂型，每日一次或两次，单独施用。

任选地，在不同时间点对患者进行筛选以确定疗法成功的可能性，即，达到持续病毒学应答(“sustained virologic response,SVR”)的可能性。

优选地，根据本文所述方法治疗的患者不具有肝硬化。因此，所述方法可能包括预先筛选患者是否存在肝硬化，对没有肝硬化的患者进行治疗。

确定患者是否具有快速病毒学应答(“rapid virologic response,RVR”)很重要。那些没有RVR的患者可能不适合继续治疗，可以鼓励其进行更常规的治疗。如本文所用，RVR被定义为在治疗的前两天内(第3至7天也可接受，但不是优选的)，例如治疗的约前48小时，血浆HCV RNA计数小于500-1000IU/ml。在这个时间点血浆HCV RNA计数大于1,000IU/ml的患者可能不适合继续治疗，可以鼓励其进行更常规的治疗。

可以继续进行治疗，直至患者的血浆HCV RNA计数小于25IU/ml。理想的治疗需要21天或更短的时间来达到该血浆HCV RNA计数，这表明SVR。可以任选地在整个治疗过程中定期对患者进行评估，以确定他们是否已经达到了这个结果。

也可以任选地在整个治疗过程中定期对患者进行评估，以确定其是否病毒学失败。当在患者的拷贝数低于25IU/ml之后，患者的拷贝数大于25IU/ml时，可能会发生这种情况。此外，在治疗期间的任意时间点连续两次测量，HCV RNA在最低值以上增加高于一个log₁₀单位，表明病毒学失败。这些患者可以进行常规疗法(例如，索非布韦和聚乙二醇干扰素/利巴韦林或Harvoni)或用常规双重疗法(例如，Harvoni或SOF/DAC)治疗更长时间。添加抗炎剂(包括JAK/STAT抑制剂)与抗病毒组合组合，可以更有效和更快地清除病毒。代表性JAK抑制剂描述于美国公开号20140328793中，并且包括鲁索替尼(Ruxolitinib)(Jakafi,Incyte)、巴瑞替尼(Baracitinib)和托法替尼(Tofacitinib)(Pfizer)。

在另一方面，本公开涉及试剂盒，其包括本公开的一种或更多种剂型，以及关于按照适当时间表服用所述剂型、所述剂型是否与食物一起服用、和/或何时评估其血浆HCVRNA拷贝数的适当说明书。

参考以下详细描述将更好地理解本发明。

附图说明

图1是实施例1中描述的临床研究中使用的方案的流程图。在该图中，uRVR意指超快速病毒应答。

图2A-C示出了多尺度模型与来自用DAA组合治疗的18位受试者的数据的拟合，假定V₀在治疗3周的受试者和治疗超过3周的受试者之间分布不同。可量化的HCV RNA载量显示为黑点，而低于定量限(虚线)的病毒载量显示为红点。使用了最佳拟合个体参数的模拟以实线示出，该最佳拟合个体参数由非线性混合效应模型的群体拟合估计而得。

图3中的图示出了对于26名被评估受试者，与模型预测相比平均丙型肝炎病毒载量下降。符号示出了各治疗组的中值log10病毒载量，而黑色实线示出了平均模型预测轨迹，该平均模型预测轨迹是通过使用从混合效应模型推导出的参数分布中随机选择的参数来模拟方程式(1)1000次计算而得。灰色带示出了模拟结果的四分位数内(intraquartile)范围。水平虚线表示定量分析下限。在所有三个治疗组中，病毒下降似乎都有三个阶段。该趋势在治疗组SOF+DCV+SMV(组2)中更明显。三个治疗组之间的病毒下降率没有显著差异。显著性通过Kruskal-Wallis检验进行检验，并通过Dunn's检验进行校正以进行组间多重比较。HCV表示丙型肝炎病毒，SOF＝索非布韦，DCV＝达卡他韦，LDV＝雷迪帕韦，SMV＝西咪匹韦且ASV＝阿那匹韦。实线是由预测的病毒载量计算得到的平均模型轨迹。虚线水平线表示定量分析下限。

图4A和4B中的图示出了多尺度模型与来自用组合DAA(直接作用性抗病毒剂)治疗的26位受试者的数据的拟合。

具体实施方式

本书面描述使用实施例来说明本发明，并且还使任意本领域技术人员能够实践本发明，包括制备和使用任意组合物并进行任意相关方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不与权利要求的字面语言不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质区别的等同结构要素，则这些其他实施例意图在权利要求的范围内。

I.定义

本章节和整个公开中使用的章节标题不是限制性的。

缩写“HCV”是指丙型肝炎病毒。根据HCV分离株之间的遗传差异，丙型肝炎病毒属被分为七种基因型(1-7)，每种基因型有几种亚型(以小写字母表示)。根据其遗传多样性，将亚型进一步分为准种(quasispecies)。在整个基因组上的核苷酸位点，基因型差异30-35％。基因型亚型的基因组组成差异通常为20-25％。亚型1a和1b在全世界范围内都有发现，并引起所有病例的60％。

在确定针对治疗的潜在应答和这种治疗所需的持续时间方面，基因型具有临床重要性。此外，当感染基因型1型或4型时，非洲人后裔不太可能清除感染，并且大部分这种针对治疗的应答缺乏追溯到19号染色体上预测治疗成功的单核苷酸多态性(SNP)。

HCV基因型1型和4型大面积分布在了西非和中非的重叠地区，感染了数百年来携带所述遗传多态性的人群。这促使科学家们提出，HCV基因型1型和4型在非洲人群中的长期持续存在，是针对这些人群免疫发生应答的数个世纪的进化适应。

在列举数字范围时，显然用相同的精确度考虑该范围内的每个中间数字。例如，对于范围6至9，除了6和9以外，还考虑数字7和8，对于范围6.0-7.0，显然还考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。以相同的方式，所有列举的比例还包括落在较宽比例内的所有子比例。

术语“AUC_infin.”是指如通过线性梯形法计算的，从时间0(给药时间)至无穷大(∞)的血浆浓度-时间曲线下面积。

术语“C_max”是指在整个采样周期内观察到的最大血浆浓度。

术语“C₂₄”是指24小时时的血浆浓度。

术语“受试者”是指人类受试者。

术语“T_max”是指观察到的最大血浆浓度(C_max)的时间。

缩写“v/v”是指体积/体积。

缩写“w/v”是指重量/体积。

缩写“w/w”是指重量/重量。

II.抗-HCV化合物

本文公开的制剂包括三种或更多种如下所示的化合物，其在一种或更多种剂型中。通常，三种或更多种化合物包括至少一种HCV RNA聚合酶抑制剂(也称为NS5B抑制剂)、至少一种HCV NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂和至少一种HCV NS4A或NS5A抑制剂。

尽管本文提供了单个化合物的批准剂量，但由于治疗过程显著短于常规治疗，所以可以容忍更高的剂量。因此，在一些实施方案中，对于组合疗法中的任意一种、两种、三种或更多种化合物，可以使用高达目前批准的剂量的400％的剂量。

以下描述了单个化合物。

SOF表示索非布韦(索非布韦,Gilead Sciences)，一种RNA聚合酶抑制剂，其具有下式：

美国食品和药物管理局(US FDA)推荐的成人剂量为400mg片剂，口服，每日一次。

对于感染基因型1型或4型HCV的患者，目前的护理标准是目前的索非布韦加聚乙二醇干扰素α加利巴韦林，持续12周。

对于感染基因型2型HCV的患者，目前的护理标准是索非布韦加利巴韦林，持续12周。

对于感染基因型3型HCV的患者，目前的护理标准是索非布韦加利巴韦林，持续24周。

LDV表示雷迪帕韦(Gilead Sciences)，一种NS5A抑制剂，其具有下式：

其目前在一个称为“Harvoni”的组合疗法中，与索非布韦组合施用，所述Harvoni是含有90mg的雷迪帕韦和400mg的索非布韦的单一每日药丸。

每日服用，持续8-12周，在感染基因型1型(美国和一些欧洲国家最常见的丙型肝炎形式)患者中，其治愈率为94％至99％，无论是否存在肝硬化或之前治疗是否成功。还用其他丙型肝炎基因型对感染的治疗进行了评估，并且在基因型3型和4型中显示出有前景的结果。

DCV表示达卡他韦(Daklinza,Brisol Myers Squibb)，一种NS5A抑制剂，其具有下式：

DCV被批准用于丙型肝炎基因型3型感染。它被指定与索非布韦一起使用，并且在HCV基因型3型感染的、接受DCV组合索非布韦的肝硬化患者中，持续病毒学应答(SVR)率降低。DCV的推荐剂量为60mg，口服，每日一次，组合索非布韦，持续12周。

可以使用的其他NS5A抑制剂包括Odalasvir(也称为ACH-3102，Achillion制药)、第二代NS5A抑制剂和EDP-239(Enanta制药)。

SMV表示西咪匹韦(和Sovriad，Medivir和Jannsen制药)，一种NS3/4A蛋白酶抑制剂，其具有下式：

SMV的推荐剂量为每日一粒150mg胶囊，与食物一起服用。其通常与索非布韦组合使用。

ASV表示阿那匹韦(Sunvepra,Bristol Myers Squibb)，一种丙型肝炎病毒酶丝氨酸蛋白酶NS3的抑制剂，其具有下式：

用于临床试验的剂量为200mg阿那匹韦，每日两次(Poordad等人，2015年5月5日,Vol 313,No.17(2015年5月))。

Sovaprevir(Achillion制药)，ABT-493(Enanta制药)，一种具有广泛基因型覆盖率的HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂，以及GS-9857(Gilead)是可使用的其他NS3蛋白酶抑制剂。

帕利瑞韦(Paritaprevir)/r(Viekira Pak和Technivie的一个组分，Abbott实验室)是NS3-4A丝氨酸蛋白酶的酰基磺酰胺抑制剂，其具有下式：

其已以两片的剂量用于Viekira Pak，每日一次，剂量为75mg。帕利瑞韦的美国FDA推荐剂量为150mg/天，以两片片剂给药。

奥比塔韦(Ombitasvir)(在产品Viekira Pak中与帕利瑞韦、利托那韦和dasabuvir组合使用来治疗HCV基因型1型，在产品Technitie中与帕利瑞韦和利托那韦组合使用来治疗HCV基因型4型，Abbvie实验室)，一种NS5A抑制剂，其具有下式：

其已以两片的剂量用于Viekira Pak，每日一次，剂量为12.5mg。奥比塔韦的美国FDA推荐剂量为25mg/天，以两片片剂给药(即，每日施用两次)。

Dasabuvir(欧洲Exviera，Abbott实验室，通常在产品Viekira Pak中与奥比塔韦、帕利瑞韦和利托那韦(ritonavir)组合使用)，是一种NS5B抑制剂，其具有下式：

其已用于Viekira Pak，剂量为250mg，每日两次，与食物一起服用。Dasabuvir的美国FDA推荐剂量为500mg/天，以两片片剂给药。

可以使用的其他NS5B抑制剂包括ACH-3422，一种核苷酸NS5B聚合酶抑制剂(Achillion制药)，Beclabuvir(BMS-791325，Bristol Myers Squibb)和MK-3682(以前的IDX21437，Merck)，一种尿苷核苷酸类似物HCV NS5B聚合酶抑制剂。

Faldaprevir和Grazoprevir目前正处于III期。Faldaprevir(Boehringer-Ingelheim)具有下式：

Grazoprevir(Merck)具有下式：

其他批准的NS5A抑制剂包括III期试验中的依巴司韦(Elbasvir)(Merck)，并具有下式：

ACH-806(Achillion制药，New Haven，CT)，其具有以下结构：

Samatasvir(Merck)，其目前处于II期试验，并具有下式：

MK-8408(Merck)和维帕他韦(velpatisvir)(Gilead)，其具有以下结构：

另外的化合物包括CC-31244(Cocrystal Pharma)，一种NS5B的非核苷抑制剂(NNI)，CC-1845(Cocrystal Pharma)，一种泛基因型NS5B抑制剂，CC-2068和CC-2069(Cocrystal Pharma)，所述CC-2068和CC-2069是泛基因型NS5A抑制剂。

其他非核苷抑制剂包括TMC647055，VX-222(VCH-222,Lomibuvir)，Tegobuvir(TGV,GS-9190,Gilead Sciences)和以下所示的NNI：

在本文公开的实施例中，给药剂量如下：SOF 400mg QD；LDV 90mg QD；DCV 60mgQD；SMV 150mg QD和ASV 100mg BID，由于治疗持续时间较短，从而使较大剂量的副作用最小化，因此即使是两倍至四倍的施用剂量也是可以使用的。

在一个实施方案中，三种或更多种化合物的组合包括选自由以下组成的组的三种或更多种化合物：SOF(索非布韦)，DCV(达卡他韦)，LDV(雷迪帕韦)，SMV(西咪匹韦)和ASV(阿那匹韦)。

III.固体剂型

组合疗法治疗包括向需要HCV治疗的患者施用三种或更多种本文所述的化合物，所述三种或更多种本文所述的化合物在一种或多种片剂中。

在一个实施方案中，三种或更多种活性剂以两种单独的剂型提供，第一种片剂包括三种或更多种化合物中的两种，第二种片剂包括第三种化合物，以及任选地一种或多种另外的化合物。

在另一个实施方案中，三种或更多种活性剂以单一片剂提供。

根据具体药物以及来自其他组合疗法的已知给药方案，每种化合物的单独剂量可以为每日给予一次或两次，在一天中的不同时间(即，早晨、中午和/或晚上)，有或没有食物。初步结果表明，本文所述的组合疗法治疗是非常有效的。

制备多药片剂的考虑因素包括：

(a)每日总剂量：化合物的每日总剂量可能非常大(总计750mg或更多)，并且可能必须以几片片剂施用。

(b)剂型大小：当作为单一片剂施用时，组合疗法可能必须是相对较大的剂型(即片剂、丸剂、胶囊剂等)。

(c)载药：载药限制可能影响如何将组合疗法加载到一种或多种口服剂型中。

(d)不同的药物动力学特征：对于每种单独的组分，每日给药方案可能不同，并且可能希望三种或更多种化合物中的每一种均表现出特定的药代动力学特征。

(e)溶解度：本文所述的组合疗法中使用的某些化合物具有低溶解度。由于其弱水溶性和低溶解度，它们可相对于更可溶的化合物，表现出较低的生物利用度和/或较高的生物利用度变异性。

(f)游离酸转化：某些化合物的游离酸形式可表现出良好的渗透性，但在胃肠道中溶解性差。施用这些化合物的盐(如钠盐)而非游离酸形式可能会或可能不会提高胃肠道中的溶解度和摄取量。

(g)区域吸收：化合物吸收的速度和程度在整个胃肠道中有所不同，这使得难以设计与每日两次或三次剂量生物等效的每日一次剂量。

单独地，当将三种或更多种活性成分共同配制在一种或多种合适的固体剂型中时，本领域技术人员可以考虑上述考虑因素。总体而言，这些考虑可以引导本领域技术人员在一种或多种合适的固体剂型中制备合适制剂，而不会不利地影响剂型大小和/或必须每日施用的单位剂型数量，同时达到合适的功效和生物利用度。

A.活性成分

除非另有说明，否则本公开中对本文所述化合物的量的任意引用，意在表示化合物的游离酸或游离碱当量。例如，350mg的活性化合物是指350mg的化合物游离酸或游离碱形式或当量的化合物的盐(例如钠盐)。

本公开部分涉及一种或更多种固体剂型，所述一种或更多种固体剂型包括三种或更多种活性成分，所述三种、四种或更多种活性成分靶向HCV上的三个或更多个靶点(例如，RNA聚合酶(NS5B)、NS3、NS4A和NS5A中的三种或更多种)。

B.非活性成分(赋形剂)

口服剂型可以任选地但优选地包括至少一种添加剂，所述添加剂选自流动调节剂、粘合剂、润滑剂、填充剂、崩解剂和增塑剂。这些添加剂可用于压制固体分散体以形成片剂、丸剂和胶囊剂。可以在压制之前，将这些添加剂与研磨或碾磨后的固体分散体混合。

崩解剂促进压制物在胃内快速崩解，并使释放的颗粒保持相互分离。合适的崩解剂的非限制性实例是交联聚合物，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠(cross-linked sodium carboxymethylcellulose)或可斯卡麦勒斯钠(sodium croscarmellose)。

合适的填充剂(也称为疏松剂)的非限制性实例是乳糖一水合物、磷酸氢钙、微晶纤维素(例如Avicell)、硅酸盐(例如二氧化硅)、氧化镁、滑石粉、马铃薯或玉米淀粉、异麦芽酮糖醇或聚乙烯醇。合适的流动调节剂的非限制性实例包括高度分散的二氧化硅(例如胶体二氧化硅，如Aerosil)和动物或植物脂肪或蜡。合适的润滑剂的非限制性实例包括聚乙二醇(例如分子量为1000-6000)、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠等。

在制备本发明的固体组合物时，还可以使用各种其它添加剂或成分，例如染料如偶氮染料、有机或无机颜料如氧化铝或二氧化钛、或天然来源的染料；稳定剂如抗氧化剂、光稳定剂、自由基清除剂、抗微生物攻击的稳定剂；或其他活性药物成分。

C.用于提供缓释的聚合物

用于提供胶囊剂的缓释的聚合物在本领域中是公知的。如果需要，口服剂型可以包括一种或多种缓释制剂，这种缓释制剂在本领域中是已知的。

当存在时，释放稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合的量，通常为组合物重量的至少5％。药学上可接受的稳定化聚合物、或药学上可接受的稳定化聚合物的组合，通常将包括例如，可压制的稳定化聚合物、或可压制的稳定化聚合物的组合、和非酸性的稳定化聚合物、或非酸性的稳定化聚合物的组合。在一个方面，稳定化聚合物、或药学上可接受的稳定化聚合物的组合，包括可压制的稳定化聚合物、或可压制的稳定化聚合物的组合。在另一方面，稳定化聚合物、或药学上可接受的稳定化聚合物的组合，包括非酸性聚合物、或非酸性的稳定化聚合物的组合。

具体的药学上可接受的稳定化聚合物、或药学上可接受的稳定化聚合物的组合，包括选自由以下组成的组的稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合：共聚维酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物及其组合；其中羟丙基甲基纤维素在20℃温度下在2％溶液(即2％水溶液)中的粘度小于100厘泊。在一个方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合选自由以下组成的组：共聚维酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，及其组合；其中羟丙基甲基纤维素在20℃温度下在2％溶液中的粘度小于100厘泊。在另一方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合选自由以下组成的组：N-乙烯基吡咯烷酮和纤维素酯的均聚物或共聚物。在另一方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合包括共聚维酮。在另一方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合包括聚乙烯吡咯烷酮。在另一方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合包括羟丙基甲基纤维素，所述羟丙基甲基纤维素在20℃温度下在2％溶液中的粘度小于100厘泊。在另一方面，稳定化聚合物、或稳定化聚合物的组合包括聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物在另一方面，剂型包括两种或更多种稳定化聚合物，所述稳定化聚合物选自由以下组成的组：共聚维酮，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，和聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物其中羟丙基甲基纤维素在20℃温度下在2％溶液中的粘度小于100厘泊。

释放速率改变聚合物

当存在时，释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，通常为组合物重量的至少5％。在一个方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为至少10％。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为至少15％。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为至少20％。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为5％至60％百分比。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为10％至50％百分比。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为15％至40％百分比。在另一方面，按重量计，组合物中释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合的量，为15％至30％百分比。

药学上可接受的释放速率改变聚合物、或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，通常将包括例如，可压制的释放速率改变聚合物、或可压制的释放速率改变聚合物的组合、和非酸性的释放速率改变聚合物、或非酸性的释放速率改变聚合物的组合。在一个方面，释放速率改变聚合物、或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，包括可压制的释放速率改变聚合物、或可压制的释放速率改变聚合物的组合。在另一方面，释放速率改变聚合物、或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，包括非酸性的聚合物、或非酸性的释放速率改变聚合物的组合。

具体的药学上可接受的释放速率改变聚合物、或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，包括选自由以下组成的组的释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合：聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素聚合物，共聚维酮，聚醋酸乙烯酯，甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸游离酸共聚物，聚乙二醇，聚环氧乙烷和泊洛沙姆。在一个方面，释放速率改变聚合物、或药学上可接受的释放速率改变聚合物的组合，选自由以下组成的组：聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K17，PVP K25，PVP K30和PVP K90)；羟丙基甲基纤维素(如羟丙基甲基纤维素(HPMC)E3，HPMC E5，HPMC E6，HPMC E15，HPMC E4M，HPMCE10M，HPMC K3，HPMC A4，HPMC A15，HPMC 乙酸琥珀酸酯(AS)LF，HPMC AS MF，HPMC AS HF，HPMC AS LG，HPMC AS MG，HPMC AS HG，HPMC邻苯二甲酸酯(P)50，和HPMC P550；乙基纤维素聚合物(例如乙基纤维素4，乙基纤维素7，乙基纤维素10，乙基纤维素14，和乙基纤维素20)；共聚维酮(乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物60/40)，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(SOLUPLUS.RTM.)，甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸游离酸共聚物(如Ethocel L100-55，Ethocel L100，和Ethocel S100)；聚乙二醇(例如聚乙二醇(PEG)400，PEG 600，PEG 1450，PEG 3350，PEG 4000，PEG 6000和PEG 8000)；和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆124，泊洛沙姆188，泊洛沙姆237，泊洛沙姆338，泊洛沙姆407)。在另一方面，释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合，选自由以下组成的组：共聚维酮，聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。在另一方面，释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合，包括羟丙基甲基纤维素。在另一方面，释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合，包括羟丙基甲基纤维素，所述羟丙基甲基纤维素在20℃的水中在2％重量下表观粘度为80厘泊至120,000厘泊。在另一方面，释放速率改变聚合物、或释放速率改变聚合物的组合，包括选自由以下组成的组的羟丙基甲基纤维素：K100，K4M，K15M和K100M羟丙基甲基纤维素。

在本公开的剂型的一个实施方案中，稳定化聚合物包括共聚维酮，并且释放速率改变聚合物包括羟丙基甲基纤维素。

控释制剂

本部分中引用的关于控释制剂的所有美国专利其整体通过引用并入。

自1966年Kulkarni等人("Polylactic acid for surgical implants,"Arch.Surg.,93:839)报道了聚乳酸的合成和生物降解性以来，生物可降解聚合物领域迅速发展。被报道可作为基质材料来递送装置的其他聚合物的实例包括聚酸酐，聚酯，例如聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯，聚氨基酸如聚赖氨酸，聚环氧乙烷的聚合物和共聚物，丙烯酸封端的聚环氧乙烷，聚酰胺，聚氨酯，聚原酸酯，聚丙烯腈和聚磷腈。参见，例如，授予Langer的美国专利号4,891,225和4,906,474(聚酐)，授予Hutchinson的美国专利号4,767,628(聚丙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯酸)，授予Tice等人的美国专利号4,530,840(聚丙交酯、聚乙交酯和共聚物)。另参见，授予Hubbell等人的美国专利号5,626,863，其描述了可光聚合可生物降解水凝胶作为组织接触材料和控释载体(聚合和交联大分子的水凝胶，其包括具有生物可降解单体或低聚物延伸的亲水性低聚物，其是能够聚合和交联的封端单体或低聚物)；和由Focal公司提交的PCT WO9705185，其涉及多嵌段生物可降解水凝胶用作控释剂用于药物递送和组织治疗剂。

生物来源的可降解材料是众所周知的，例如交联明胶。已经对透明质酸进行交联，并将其用作可降解溶胀聚合物用于生物医学应用(授予Della Valle等人的美国专利号4,957,744；(1991)"Surface modification of polymeric biomaterials for reducedthrombogenicity,"Polym.Mater.Sci.Eng.,62:731 7351)。

目前许多分散系统被用作或正在被探索用作物质的载体，特别是生物活性化合物的载体。用于药物和化妆品制剂的分散系统可以分为悬浮液或乳液。悬浮液被定义为大小范围自几个纳米到几百微米的固体颗粒，其使用悬浮剂而分散在液体介质中。固体颗粒包括微球体、微胶囊和纳米球体。乳液被定义为一种液体在另一种液体中的分散体，其通过乳化剂如表面活性剂和脂质的界面膜而稳定。乳剂制剂包括油包水和水包油乳剂、多重乳剂、微乳剂、微滴和脂质体。微滴是单层磷脂囊泡，其由内部具有油相的球形脂质层组成，如授予Haynes的美国专利号4,622,219和4,725,442中所定义的。脂质体是通过将水不溶性极性脂质与水溶液混合而制备的磷脂囊泡。将不溶性脂质混入水中造成的不利熵产生了磷脂与封闭的水溶液的同心封闭膜的高度有序的组装。

授予Dunn等人的美国专利号4,938,763公开了一种原位形成植入物的方法，通过以下步骤形成：将非反应性水不溶性热塑性聚合物溶解在生物相容性水溶性溶剂中形成液体，将液体置于体内，并使溶剂消散以产生固体植入物。可以通过注射器将聚合物溶液置于体内。植入物可以呈现其周围空腔的形状。在一个替代实施方案中，植入物由反应性液体低聚聚合物形成，该聚合物不含溶剂并且通常在添加固化催化剂的情况下原位固化形成固体。

许多专利公开了可用于施用胸苷和非胸苷核苷抗病毒剂、或其前药的组合的药物递送系统。美国专利号5,749,847公开了一种通过电穿孔将核苷酸递送到生物体内的方法。美国专利号5,718,921公开了微球体，所述微球体包括聚合物和分散在其中的药物。美国专利号5,629,009公开了用于控制释放生物活性因子的递送系统。美国专利号5,578,325公开了非线性亲水疏水多嵌段共聚物的纳米粒和微粒。美国专利号5,545,409公开了用于控制释放生物活性因子的递送系统。美国专利号5,494,682公开了离子交联的聚合物微胶囊。

授予Andrx制药公司的美国专利号5,728,402描述了一种控释制剂，其包括内相和外相，所述内相包含与水凝胶形成剂混合的活性药物、其盐或前药，所述外相包含在胃中抵抗溶解的涂层。授予Andrx制药公司的美国专利号5,736,159号和5,558,879公开了用于水溶性很小的药物的控释制剂，其中原位形成了通路。授予Andrx制药公司的美国专利号5,567,441号公开了一种每日一次的控释制剂。美国专利号5,508,040公开了一种多颗粒脉动药物递送系统。美国专利号5,472,708公开了一种基于脉动颗粒的药物递送系统。美国专利号5,458,888描述了一种控释片剂，其可以使用一种共混物来制备，所述共混物具有含药内相和含有聚乙二醇聚合物的外相，所述聚乙二醇聚合物的重均分子量为3,000至10,000。美国专利号5,419,917公开了用于改变药物从水凝胶中释放速率的方法，其基于使用有效量的药学上可接受的可离子化化合物，该化合物能够提供药物从水凝胶中基本上零级的释放速率。美国专利号5,458,888公开了一种控释片剂。

授予Elan有限公司的美国专利号5,641,745公开了一种控释药物制剂，其包括生物可降解聚合物中的活性药物以形成微球体或纳米球体。可生物降解的聚合物适宜为聚-D,L-丙交酯或聚-D,L-丙交酯和聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯的共混物。授予Elan有限公司的美国专利号5,616,345描述了一种控制吸收制剂，用于每日一次施用，其包括与有机酸结合的活性化合物，和围绕该芯的多层膜，并且所述多层膜包含大部分的药学上可接受的成膜、水不溶性合成聚合物和少部分的药学上可接受的成膜水溶性合成聚合物。美国专利号5,641,515公开了一种基于生物可降解纳米粒的控释制剂。美国专利号5,637,320公开了一种每日施用一次的控制吸收制剂。美国专利号5,580,580和5,540,938涉及制剂及其在治疗神经疾病中的用途。美国专利号5,533,995涉及具有可控药物递送的被动透皮装置。美国专利号5,505,962描述了一种控释药物制剂。

C.治疗剂量和方案

本发明的剂型根据每日给药方案施用，该每日给药方案向受试者口服递送治疗量的化合物。这种每日给药方案通常递送下述范围内的一定量的化合物：

SOF 400-1600mg QD；

LDV 90-180mg QD；

DCV 60-120mg QD；

SMV 150-600mg QD

ASV 100-400mg BID。

由于药物加载限制和剂型大小限制，为了向受试者递送必要的每日治疗剂量，通常需要施用本发明的两种或更多种剂型。在一个方面，每日施用两种剂型将向受试者提供必要的每日治疗剂量。在另一方面，每日施用三种剂型将向受试者提供必要的每日治疗剂量。然而，如果需要，可以采用每日施用四种或更多种剂型以向受试者提供必要的每日治疗剂量。

IV.治疗方法

如果患者a)在治疗开始时其血液中的丙型肝炎病毒水平较低，并且b)在治疗开始时肝损伤量较低，则本文所述的组合抗病毒疗法更有可能会有效。

如图1所示，使用各种组合疗法进行了临床试验。在实施例1中更详细地描述了临床试验。然而，图1还示出了如何实践治疗方法的一个实施方案。

可以任选地评估患者肝硬化的存在。尽管可以治疗所有HCV亚型，并且可以治疗肝硬化患者，但在一个实施方案中，患者是具有慢性基因型1b型(GT1b)或GT1a丙型肝炎但不患有肝硬化的患者。

可以向患者施用这样的组合疗法：该组合疗法包括HCV RNA聚合酶抑制剂(例如索非布韦)、NS5A抑制剂(例如雷迪帕韦或达卡他韦(Daclastavir))和蛋白酶抑制剂(例如阿那匹韦或西咪匹韦)。本文描述的对相同靶标具有活性的其它活性剂，可以代替这些试剂中的一种或多种。

在一个实施方案中，组合疗法包括索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的组合，以本文所述的剂量。

在另一个实施方案中，组合疗法包括索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦的组合，以本文所述的剂量。

在第三个实施方案中，组合疗法包括索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦，以本文所述的剂量。

在第四个实施方案中，组合疗法包括索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦，以本文所述的剂量。

为了确定哪些患者可以在相对较短的时间内得到治疗，确定哪些患者表现出快速病毒学应答(RVR)可能是很重要的。这可以通过例如使用已知的方法测量总HCV RNA拷贝数(IU/ml)来完成。

在治疗开始后大约36-72小时，优选大约42-54小时，更优选大约48小时的时间点，可任选地检查受试者的血浆HCV RNA拷贝数(IU/ml)。该时间段可以任选地但不太优选地延长至治疗开始后七天。这表明患者是否具有快速病毒学应答(RVR)。如果需要，检查可以更早发生，但在较短时间范围内的阴性结果不一定表示患者不能继续治疗(尽管阳性结果表示患者可以继续治疗)。

如果患者的血浆HCV RNA拷贝数高于1,000，(理想情况下低于500IU/ml)那么他们没有RVR，因此不能使用该组合进行进一步治疗，并向其提供标准疗法，持续标准治疗时间。

血浆HCV RNA拷贝数低于1,000，优选低于500IU/ml的患者显示出RVR，可以继续进行治疗。这些患者可以治疗大约三周的时间，此时可以再次测量血浆HCV RNA拷贝数。

那些拷贝数小于25IU/ml的患者可以被认为是“治愈”的，或者具有持续的病毒学应答(SVR)。那些拷贝数大于25IU/ml的患者可以被描述为“病毒学失败”，并使其接受常规疗法(如索非布韦和聚乙二醇干扰素/利巴韦林或Harvoni)。

任选地但优选地，在另外的时间点测量血浆HCV RNA拷贝数。病毒学失败的另一个迹象是在拷贝数低于25IU/ml后拷贝数大于25IU/ml。此外，在治疗期间的任意时间点连续两次测量，HCV RNA在最低值以上增加高于一个log₁₀单位，表明病毒学失败。这些患者可以接受常规疗法(如索非布韦和聚乙二醇干扰素/利巴韦林或Harvoni)。

VI.制备制剂的方法

本公开还涉及用于制备本说明书中描述的固体剂型的方法，包括以下实施例中描述的那些方法。

在一个实施方案中，本公开涉及用于制备单一无定形固体分散体的方法，所述单一无定形固体分散体包含一种、两种或三种本文所述的化合物，所述单一无定形固体分散体可用于剂型的制备。无定形固体分散体可以通过多种技术制备，例如但不限于熔融挤出、喷雾干燥、共沉淀、冷冻干燥或其它溶剂蒸发技术，其中优选熔融挤出和喷雾干燥。

在另一个实施方案中，所述方法通常包括例如：(1)制备一种熔体，所述熔体包含一种、两种或三种本文所述的化合物，药学上可接受的亲水聚合物，和药学上可接受的表面活性剂；以及(2)固化所述熔体。固化的熔体可以包括本文描述或考虑的任意无定形固体分散体。所述方法可以进一步包括碾磨固化的熔体，随后将碾磨后的产品与一种或多种其他赋形剂或成分进行压制以形成片芯。这些其他赋形剂或成分可以包括例如，着色剂、调味剂、润滑剂或防腐剂。

熔融挤出法通常包括以下步骤：制备包括活性成分(即一种、两种或三种本文所述的化合物)、亲水性聚合物和任选的表面活性剂的熔体，然后冷却熔体直至凝固。“熔融”是指转换至液态或橡胶态，其中一种组分可以嵌入其中，例如均匀嵌入在其他一种或多种组分中。在许多情况下，聚合物组分将熔融，其他组分，包括活性成分和表面活性剂，将溶解在熔体中，从而形成溶液。熔融通常涉及加热到聚合物软化点以上。熔体的制备可以以各种方式进行。组分的混合可以在形成熔体之前、期间或之后进行。例如，可以先将组分混合然后熔融或同时混合和熔融。也可以使熔体均质化，以有效地分散活性成分。另外，首先熔融聚合物然后混合并均质化活性成分可能是方便的。在一个实例中，将除表面活性剂以外的所有材料共混并供给到挤出机中，同时使表面活性剂在外部熔融并在挤出过程中泵入。

在熔融挤出过程中，活性成分可以以其固体形式被使用，例如它们各自的结晶形式。活性成分也可以作为合适液体溶剂中的溶液或分散体被使用，所述合适液体溶剂例如醇、脂族烃、酯或在某些情况下为液体二氧化碳。溶剂可以被除去，例如，在制备熔体时蒸发。

熔体中还可以包括各种添加剂，例如流动调节剂(例如胶体二氧化硅)，粘合剂，润滑剂，填充剂，崩解剂，增塑剂，着色剂或稳定剂(例如抗氧化剂，光稳定剂，自由基清除剂和抗微生物攻击的稳定剂)。

熔融和/或混合可以在常用于该目的的设备中进行，例如挤出机或捏合机。合适的挤出机可以包括单螺杆挤出机，啮合螺杆挤出机或多螺杆挤出机，例如双螺杆挤出机，其可以是共旋转或反旋转的，并且任选地配备有捏合盘。应该理解的是，工作温度将由挤出机的种类或所使用的挤出机内的构造类型来确定。挤出机中材料的摩擦和剪切可以为混合物提供大量的能量并有助于形成组分的均匀熔体。然而，使挤出机中的组分熔融、混合和溶解所需的部分能量可以通过加热元件提供。

熔体的稠度范围可以从薄到糊状到粘稠。挤出物的成型可以通过具有两个反向旋转辊的压光机很方便地进行，所述两个反向旋转辊在其表面上具有相互匹配的凹陷。可以使挤出物冷却并使其固化。也可以在凝固之前将挤出物切成片(热切割)或在凝固之后将挤出物切成片(冷切割)。

可以将固化的挤出产品进一步碾磨、研磨或以其他方式缩小成颗粒。固化的挤出物，以及所产生的各颗粒，包括活性成分在基质中的固体分散体，如固体溶液，所述基质由亲水性聚合物和药学上可接受的表面活性剂组成。也可以在碾磨或研磨成颗粒之前，将挤出产物与其他活性成分和/或添加剂共混。该颗粒可以进一步加工成合适的固体口服剂型。

或者，可以使用溶剂蒸发的方法，通过喷雾干燥，来制备无定形固体分散体，其优点是允许在较低温度下处理，如果需要，还允许对该方法进行其他修改以进一步改善粉末性质。如果需要，可以进一步配制喷雾干燥的粉末，并且对于是否需要胶囊、片剂或任意其他固体剂型，最终药物产品是灵活的。

示例性喷雾干燥方法和喷雾干燥设备在K.Masters的喷雾干燥手册(HalsteadPress,New York,4.sup.th ed.,1985)中进行了描述。适用于本发明的喷雾干燥装置的非限制性实例包括由Niro公司或GEA Process Engineering公司、Buchi Labortechnik AG和Spray Drying Systems公司制造的喷雾干燥器。喷雾干燥方法通常涉及使液体混合物分散成小液滴并在容器(喷雾干燥设备)中快速去除液滴中的溶剂，在所述容器有一个强驱动力使溶剂从液滴中蒸发。雾化技术包括，例如，双流体或压力喷嘴、或旋转雾化器。例如，通过将喷雾干燥设备中的溶剂的分压保持在远低于干燥液滴的温度下溶剂的蒸气压，可以提供用于溶剂蒸发的强大驱动力。这可以通过(1)将喷雾干燥设备中的压力保持在部分真空下；(2)将液滴与温热的干燥气体(例如加热的氮气)混合；或(3)两者来完成。

可以对干燥气体的温度和流速，以及喷雾干燥器设计进行选择，使得当液滴到达设备壁时足够干燥从而基本上固化并形成细粉以避免粘在设备壁上。喷雾干燥的产品可以通过手动、气动、机械或其他合适的方式去除材料来收集。达到所需干燥程度的实际时间长短取决于液滴的大小、配方和喷雾干燥器操作。在固化之后，固体粉末可以在喷雾干燥室中停留额外的时间(例如5秒至60秒)以进一步从固体粉末中蒸发溶剂。固体分散体在离开干燥器时的最终溶剂含量通常处于足够低的水平以提高最终产品的稳定性。例如，按重量计，喷雾干燥粉末的残余溶剂含量可以小于2％。残留溶剂含量可能在国际协调会议(International Conference on Harmonization,ICH)指南规定的限度内。另外，将喷雾干燥的组合物进一步干燥以将残余溶剂降低至更低水平可能是有用的。进一步降低溶剂水平的方法包括但不限于，流化床干燥、红外干燥、滚筒干燥、真空干燥以及这些和其他合适的工艺的组合。

与上述固体挤出物类似，喷雾干燥产物含有活性成分在基质中的固体分散体，如固体溶液，所述基质由亲水性聚合物和药学上可接受的表面活性剂组成。

在进入喷雾干燥器之前，可将活性成分、亲水性聚合物以及其它赋形剂如药学上可接受的表面活性剂，溶于溶剂中。合适的溶剂包括但不限于，链烷醇(例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或其混合物)，丙酮，丙酮/水，链烷醇/水混合物(例如，乙醇/水混合物)，或其组合。溶液在送入喷雾干燥器之前也可以预热。

通过熔融挤出、喷雾干燥或其他技术生产的固体分散体可以制备成任意合适的固体口服剂型。在一个实施方案中，可以将通过熔融挤出、喷雾干燥或其他技术制备的固体分散体(例如，挤出物或喷雾干燥的粉末)压制成片剂。固体分散体可以被直接压制，或者在压制之前碾磨或研磨成颗粒或粉末。压制可以在压片机中进行，例如在两个移动的冲头之间的钢模中进行。

选自流动调节剂，粘合剂，润滑剂，填充剂，崩解剂或增塑剂中的至少一种添加剂可用于压制固体分散体。可以在压制之前，将这些添加剂与碾磨或研磨后的固体分散体混合。崩解剂促进压制片在胃内快速崩解，并使释放的颗粒保持相互分离。合适的崩解剂的非限制性实例是交联聚合物，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠或可斯卡麦勒斯钠。合适的填充剂(也称为疏松剂)的非限制性实例是乳糖一水合物、磷酸氢钙、微晶纤维素(例如Avicell)、硅酸盐(例如二氧化硅)、氧化镁、滑石粉、马铃薯或玉米淀粉、异麦芽酮糖醇或聚乙烯醇。合适的流动调节剂的非限制性实例包括高度分散的二氧化硅(例如胶体二氧化硅，如Aerosil)和动物或植物脂肪或蜡。合适的润滑剂的非限制性实例包括聚乙二醇(例如分子量为1000-6000)、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠等。

参考以下非限制性实施例将更好地理解本发明。

实施例

实施例1：针对慢性丙型肝炎感染的3周应答指导型三重直接作用性抗病毒疗法的功效和安全性：2期、开放标签、概念验证性研究

概述：

在丙型肝炎病毒(HCV)感染者中，DAA具有高治愈率和良好的耐受性。然而，更短的疗程可以改善依从性(adherence)、可负担性并增加DAA可及性。我们推测，向NS5A-NS5B(核苷)双抑制剂中添加NS3蛋白酶抑制剂可提高在快速病毒学应答(RVR)个体中的抗病毒功效，并将治疗持续时间缩短至3周(wks)，所述快速病毒学应答(RVR)被定义为第二天血浆HCV RNA<500IU/ml。因此，该研究的目的是检查用NS3蛋白酶抑制剂和双重NS5A抑制剂-NS5B核苷酸类似物进行的3周应答指导型疗法的抗病毒功效和安全性，从而缩短用于慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的直接作用性抗病毒剂的疗程。

在该试验性、应答指导型疗法(RGT)、开放标签IIa期、单中心研究中，具有GT 1b型慢性丙型肝炎的26名非肝硬化中国受试者[平均年龄＝34岁(21-66岁)，男性＝6，中位BMI＝21.7(15.9-32.1)，基线平均HCV RNA log10IU/ml＝6.55(4.09-7.34)]用计算机程序随机分组，以接受以下批准剂量：索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦(组1，n＝12)，索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦(组2，n＝6)或索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦(组3，n＝8)，直到每组中的6名患者(1：1：1)达到超快速病毒学反应(到第2天血浆HCV RNA<500IU/ml，通过COBASTaqMan HCV测试2.0版测量)。

具有超快速病毒学应答的患者接受3周的治疗。没有达到超快速应答的患者转为索非布韦和雷迪帕韦治疗8周或12周。主要终点是在意向治疗人群中进行分析，治疗完成后在12周具有持续病毒学应答(SVR12)的患者的比例。所有达到超快速病毒学应答的患者均纳入安全性分析。该试验在ClinicalTrials.gov上注册，编号为NCT02470858。

结果：

18例(66.7％)受试者达到RVR(组1、2、3分别有6/12，6/6，6/8，p＝0.06)。所有接受三周三重疗法的具有超快速病毒学应答的患者均达到SVR12。

与无RVR患者相比，RVR患者的基础病毒载量较低(log10IU/ml 5.96vs.7.00，ρ<0.0001)。与组3相比，组1中达到血浆HCV RNA<25IU/ml(检测限)的中位时间较短(p＝0.01)。所有18名患有RVR和3周DAA的受试者均达到SVR12。

没有中断或重大不良事件报告。最常见的不良事件是疲劳(六例接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的患者中有一例[17％]；六例接受索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦的患者中有一例[17％]；六例接受索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦的患者中有两例[33％])和头痛(每组均有一例患者[17％])。没有患者经历任何严重的不良事件。

结论：该概念验证性SODAPI研究(ClinicalTrials.gov编号NCT02470858)对RGT进行了探索以缩短HCV疗法的持续时间。结果强烈表明，在三分之二的非肝硬化HCV GT 1b感染受试者中，施用含有NS3、NS5A和NS5B HCV抑制剂的有效三重方案在2天内导致RVR(血浆HCV RNA<500IU/ml)。100％的具有RVR并治疗3周的患者达到SVR12，具有良好的依从性和耐受性。

因此，所有患有慢性HCV但无肝硬化的、到第2天针对三重直接作用性抗病毒方案达到超快速病毒学应答并接受3周治疗的患者，均被治愈，并具有良好的依从性和耐受性。通过将治疗持续时间从目前推荐的12周缩短至3周，可以显著降低治疗成本和不良事件的发生率。

背景

在患有慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的人中，直接作用性抗病毒剂(DAA)的较短疗程可以改善依从性和可负担性。我们推测，在应答指导型疗法临床研究中，向NS5A-NS5B双核苷类似物中加入NS3蛋白酶抑制剂可增强抗病毒功效并缩短治疗持续时间。

引言

全世界范围内丙型肝炎病毒(HCV)的发病率日益增加，1990至2005年期间，感染人数从2.3％增加到2.8％(>1.22亿至1.85亿人)(AASLD–IDSA HCV GuidancePanel.Hepatitis C guidance:AASLD–IDSA recommendations for testing,managing,and treating adults infected with hepatitis C virus.Hepatology 2015；62:932–54)。

据估计，中国、中国香港、中国台湾和韩国的HCV感染人数约为5000万(EuropeanAssociation for the Study of the Liver.EASL recommendations on treatment ofhepatitis C 2015.J Hepatol 2015；63:199–236；Afdhal等人，Ledipasvir andSofosbuvir for untreated HCV genotype 1 infection.N Engl J Med 2014；370:1889–98)，并且最普遍的基因型是1b型(Afdhal等人，Ledipasvir and sofosbuvir forpreviously treated HCV genotype 1 infection.N Engl J Med 2014；370:1483–93)。这些患者中的高达五分之一会发展为肝硬化，其中四分之一会进展为终末期肝病或肝细胞癌(Kowdley等人，Ledipasvir and sofosbuvir for 8 or 12weeks for chronic HCVwithout cirrhosis.N Engl J Med 2014；370:1879–88；Sulkowski等人，Daclatasvirplus sofosbuvir for previously treated or untreated chronic HCV infection.NEngl J Med 2014；370:211–21)。

随着直接作用性抗病毒剂的出现，丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗进入了一个新时代。DAA耐受性良好，安全，可口服，可在8至24周的治疗内治愈几乎所有HCV患者。截止到2015年，美国食品和药物管理局(FDA)和欧盟批准了三种新型直接作用性抗病毒药物——索非布韦、西咪匹韦和达卡他韦——作为组合方案的一部分用于治疗HCV感染(AASLD–IDSAHCV Guidance Panel.Hepatitis C guidance:AASLD–IDSA recommendations fortesting,managing,and treating adults infected with hepatitis Cvirus.Hepatology 2015；62:932–54；European Association for the Study of theLiver.EASL recommendations on treatment of hepatitis C 2015.J Hepatol 2015；63:199–236)

91-100％的感染了HCV基因型1型的个体用索非布韦和雷迪帕韦治疗8-12周，每日一次(Afdhal等人，Ledipasvir and sofosbuvir for untreated HCV genotype 1infection.N Engl J Med 2014；370:1889–98；Afdhal等人，Ledipasvir and sofosbuvirfor previously treated HCV genotype 1 infection.N Engl J Med 2014；370:1483–93；Kowdley等人，Ledipasvir and sofosbuvir for 8 or 12 weeks for chronic HCVwithout cirrhosis.N Engl J Med 2014；370:1879–88)。

98-100％的接受了12-24周、每日一次的索非布韦和达卡他韦的患者在12周达到持续病毒学应答(SVR12)(Sulkowski等人，Daclatasvir plus sofosbuvir forpreviously treated or untreated chronic HCV infection.N Engl J Med 2014；370:211–21)。

这种方案的费用繁重，并且这种方案对治疗准入和药物依从性(compliance)造成了不利影响，并且鼓励了药物仿造(McCarthy M.Fake medicines are underminingglobal efforts to combat infectious disease,says US journal.BMJ 2015；350:h2137；Attaran A.Stopping murder by medicine:introducing the Model Law onMedicine Crime.Am J Trop Med Hyg 2015；92(6suppl):127–32)。

一个主要的挑战是通过缩短治疗持续时间来降低治疗费用而不影响功效(Hagan,LM,Sulkowski MS,Schinazi RF.Cost analysis of sofosbuvir/ribavirin versussofosbuvir/simeprevir for genotype 1 hepatitis C virus in interferon-ineligible/intolerant individuals.Hepatology 2014；60:37–45；Hill等人，Minimumcosts for producing hepatitis C direct-acting antivirals for use in large-scale treatment access programs in developing countries.Clin Infect Dis 2014；58:928–36)。

试图通过向索非布韦和雷迪帕韦中添加利巴韦林来将治疗持续时间缩短至6周，这导致许多患者在治疗后复发(Gane等人，Efficacy of nucleotide polymeraseinhibitor sofosbuvir plus the NS5A inhibitor ledipasvir or the NS5B non-nucleoside inhibitor GS-9669 against HCV genotype 1infection.Gastroenterology 2014；146:736–43)。添加实验性NS3/4A蛋白酶抑制剂(GS-9451)或实验性非核苷聚合酶抑制剂(GS-9669)在95％的患者中产生SVR12(Kohli等人，Virological response after 6 week triple-drug regimens for hepatitis C:aproof-of-concept phase 2A cohort study.Lancet 2015；385:1107–13)。

尽管该研究相对较小，但其显示使用3周三重直接作用性抗病毒疗法具有高的12周持续病毒应答率，这为本文描述的发明提供了体内支持，即可对某些感染了HCV的患者有效的超短治疗方案。

该研究表明，在感染了慢性HCV基因型1b型且具有超快速病毒学应答的非-肝硬化中国患者中，施用包含NS5B、NS3和NS5A抑制剂的三重直接作用性抗病毒疗法，全口口服型(pan-oral)直接作用性抗病毒剂疗法的持续时间可以从目前推荐的12周显著缩短至仅3周。这具有显著的治疗、公共健康和经济影响，因为基因型1b型是亚洲人群中的主要菌株，而不是1a型(在约5000万感染者中估计)。虽然不希望受到特定理论的束缚，但相信这种治疗方法也可以用于不同的HCV基因型，以及肝硬化患者。

治疗期间HCV RNA变化的数学模型表明，第二阶段病毒更快速下降应使得能够实现更短的治疗持续时间(Perelson AS,Guedj J.Modelling hepatitis Ctherapy—predicting effects of treatment.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2015；12:437–45)。核苷类似物抑制剂不会产生如HCV蛋白酶抑制剂那样快速的第二阶段下降(Guedj等人，Hepatitis C viral kinetics with the nucleoside polymerase inhibitormericitabine(RG7128).Hepatolgy 2012；55:1030–37；Guedj等人，Analysis ofhepatitis C viral kinetics during administration of two nucleotide analogues:sofosbuvir(GS-7977)and GS-0938.Antivir Ther 2014；19:211–20；以及Guedj和Perelson.Second-phase hepatitis C virus RNA decline during telaprevir-basedtherapy increases with drug effectiveness:implications for treatmentduration.Hepatology 2011；53:1801–08)。

因此，我们推测，向索非布韦和雷迪帕韦或达卡他韦中添加批准的蛋白酶抑制剂，例如西咪匹韦或阿那匹韦，可能导致更快速的第二阶段HCV RNA下降，从而缩短治疗时间。因此，我们进行了概念验证性、应答指导型疗法的临床研究，以研究3周三重直接作用性抗病毒疗法(含有NS5B，NS3和NS5A抑制剂)，在具有慢性HCV基因型1b型感染但不具有肝硬化的中国患者中的功效和安全性，所述中国患者达到了超快速初始病毒应答(uRVR)，由给药前2天内血清HCV RNA低于500IU/ml定义。我们专注于感染基因型1b型的患者，因为这是亚洲人群中的主要菌株(在约5000万感染者中估计)，尽管这种基因型也可存在于在其他人群中(Messina等人，Global distribution and prevalence of hepatitis C virusgenotypes.Hepatology 2015；61:77–87；Liu和Kao.Nanomedicines in the treatment ofhepatitis C virus infection in Asian patients:optimizing use of peginterferonalfa.Int J Nanomed 2014；9:2051–67)。

方法

研究设计和参与者

这是一个在单一中心(中国香港特别行政区人类与健康医疗中心)开展的开放标签、概念验证性、2a期研究。使用北京解放军302医院香港人类与健康医疗集团丙肝诊断和治疗中心数据库对参与者进行确认，截止至该研究时，该数据库记录了503名感染HCV的患者。满足所有纳入和排除标准并同意的人连续入组。关键的纳入标准为：18岁以上；记录慢性HCV基因型1b型感染超过6个月；基线血浆HCV RNA浓度为10⁴-10⁷IU/ml；并且通过肝活检评估不存在肝硬化，或通过肝硬度测量低于12.5kPa。关键的排除标准为：乙型肝炎病毒(HBV)或HIV感染；非HCV病原体的慢性肝病；肝细胞癌或其他恶性肿瘤；滥用药物或酒精；孕妇或哺乳期妇女；已知对本研究中使用的药物产品过敏；以及可能干扰研究的任意其他医学病症或临床病况(例如，重大心肺、神经病学、肾、血液、自身免病症和任意恶性肿瘤)。接受过治疗的患者曾接受了基于干扰素的治疗。

所有患者均获得书面知情同意书。

随机化和掩蔽

通过计算机系统，将所有符合条件的患者随机分配到三个治疗组中的一个(索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦；索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦；或索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦)，直到各组中有6名患者达到uRVR。计算机序列由生物统计学家(JC)生成，该生物统计学家将这些序列分配给试验组，但不参与试验的其余部分。

该试验是开放标签的；患者和调查人员都知道小组任务。该开放标签的2a期研究包括具有慢性HCV基因型1b型感染的26名非肝硬化中国受试者的探索性队列(cohort)。我们随机分配受试者接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦(组1；N＝12)，索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦(组2；N＝6)或索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦(组3；N＝8)。

患者接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦；索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦；或索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦。剂量如下：索非布韦400mg每日一次；雷迪帕韦90mg每日一次；达卡他韦60mg每日一次；西咪匹韦150mg每日一次，以及阿那匹韦100mg每日两次。uRVR患者接受3周的治疗。未达到uRVR的患者转为索非布韦和雷迪帕韦治疗8周或12周，并随访(尽管未纳入随后的研究)。选择到第2天血浆HCV RNA阈值低于500IU/ml是因为在中国这是最常用的初始筛选标准，尽管可以使用更灵敏的分析。此外，我们的初步数据(未显示)表明，在第48h时使用该阈值是用3周全口口服直接作用性抗病毒疗法达到SVR12的替代，不考虑先前的以干扰素为基础的治疗应答。

主要终点为治疗完成后12周持续病毒学应答(SVR12)的受试者的比例，由HCV RNA低于定量下限(25IU/ml)定义。主要的安全性终点为不良事件的频率和严重程度。次要终点为：在治疗期间的特定时间点(第2天、第4天、第7天、第2周和第3周)和治疗后的特定时间点(第4周和第12周)检测不到HCV病毒载量的患者的比例；HCV RNA自基线循环的动力学；具有不良事件的患者的比例；与不良事件有关的停药率；安全实验室变化；和HCV耐药性突变的发生。测量第0、1、2、4、8和24小时以及第2、4、7、14和21天时的血浆HCV RNA水平用于病毒动力学建模。

结果

18例(66.7％)患者获得RVR(对于组1、组2、组3分别为6/12、6/6、6/8，为p＝0.06)。与无RVR的患者相比，具有RVR的患者的基础病毒载量(V₀)显著较低(log10V₀ 5.81对7.23，ρ<0.0001)。所有具有RVR的18例RVR受试者均接受三周的三重疗法，达到SVR12，无明显不良反应。

结论

在该概念验证性研究中，所有到第2天针对含有NS3、NS5A和NS5B抑制剂的三个有效的三重DAA方案达到了RVR，并共接受了三周治疗的慢性HCV基因型1b型非肝硬化中国受试者均被治愈，并具有优异的耐受性。(ClinicalTrials.gov编号NCT02470858)。

方法

参与者

在一项探索性队列研究中，共筛查了27名个体，其中纳入了26名个体以评估安全性和功效。受试者在中国的一个中心(香港特区人类与健康医疗中心)被纳入。关键的纳入标准是：男性和女性，>18岁；记录慢性HCV基因型1b型感染超过6个月；基线血浆HCV RNA浓度在10⁴和10⁷IU/ml之间；如肝活检或评估不存在肝硬化。所有受试者均获得书面知情同意书。

研究监督

这项研究获得了研究中心的独立伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)、优良临床试验规范(Good Clinical Practice)指南和当地法规要求进行。该研究由合作者/调查员设计并进行(G.Lau，Y.Benhamou和R.F.Schinazi)。研究人员收集数据，监测研究并进行统计分析。独立数据和安全监督委员会审查了研究的进展。调查人员和参与机构同意对数据保密。所有作者都可以访问数据，并为所报告数据的完整性(integrity and completeness)承担责任。完整的协议包括在附录中。

研究设计

这是一个在单中心进行的开放标签、概念验证性、2a期研究。26名合格受试者随机接受SOF、LDV和ASV(组1；N＝12)，SOF、DCV和SMV(组2；N＝6)，或SOF、DCV和ASV(组3；N＝8)。施用剂量如下：SOF 400mg QD；LDV 90mg QD；DCV 60mg QD；SMV 150mg QD和ASV 100mgBID。到第2天达到治疗时(on treatment)血浆HCV RNA<500IU/ml的18名受试者(三个治疗组中每个治疗组有6名)，对其共治疗3周。到第2天未能达到血浆HCV RNA<500IU/ml的受试者在第3天转换为SOF和LDV，总共持续8或12周(图1)。选择血浆HCV RNA<500IU/ml是因为在现实世界中，这是使用的检测下限。此外，我们的初步数据(未显示)表明，使用该水平作为48小时的阈值解释为用三周全口口服DAA治疗达到SVR12。

功效和安全性评估

筛查评估包括使用TaqMan基因分型测定(Applied Biosystems)对rs12979860单核苷酸多态性和IFNL4(rs368234815)基因分型和标准实验室测试测量血浆HCV RNA水平，IL28B基因型。测量基线(0小时)、初始给药后1、2、4、8、24小时和治疗的第2、4、7、14和21天或结束时的血浆HCV RNA浓度。治疗结束后，所有受试者均以4周为间隔测量血浆HCV RNA，直至第12周。通过COBAS TaqMan 48分析仪2.0版(Roche Molecular Systems)测量血浆HCVRNA浓度，其中定量下限为25IU/ml，检测下限为6IU/ml。使用Versant HCV GenotypeINNOLiPA 2.0测定法(Siemens Healthcare Diagnostics)筛选确定HCV基因型和亚型。在基线时对所有受试者的HCV RNA的NS5A和NS5B区域进行深度测序，并且对于病毒学失败的受试者再次在失败时进行深度测序(Kai等人，Emergence of hepatitis C virus NS5AL31V plus Y93H variant upon treatment failure of daclatasvir and asunapreviris relatively resistant to ledipasvir and NS5B polymerase nucleotideinhibitor GS-558093 in human hepatocyte chimeric mice.J Gastroenterol 2015；50:1145–51)。

导致研究药物停用的病毒学失败定义为：在治疗的3周内未能达到血浆HCV RNA浓度低于25IU/ml；在治疗时HCV RNA浓度低于25IU/ml的患者中，在任意时间点连续两次测量证实HCV RNA浓度为25IU/ml或更高；或在治疗期间的任意时间点连续两次测量确认HCVRNA在最低值以上增加>1log₁₀IU/ml。根据制造商的说明，用FibroScan(Echosens,Paris,France)测量肝硬度。

比较所得序列以检测在治疗期间出现的耐药性相关的变异。本文报道了在多于1％的序列读数中存在的耐药性相关的变异。

根据艾滋病毒性表NIAID分部(版本1.0)，记录基线、治疗期间的D2、D4、D7、第2周和第3周，然后结束后第4周和第12周的生命体征和症状指向的身体检查和不良事件。在筛选时、基线时、治疗期间的D2、D4、D7、第2周和第3周，然后在治疗结束后第4周和第12周采集血液用于血液学和化学分析。在筛选时、基线时、治疗期间的第2周和第3周，然后在治疗结束后第4周和第12周进行12导联心电图。

将来自感染HCV的患者的血浆样品以等分试样储存在-80℃直至进一步处理。提取病毒RNA，并如前所述使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析仪对基因组进行测序²¹。使用ABL-DeepChek-HCV 1.4软件(ABL SA,Luxembourg,Luxembourg)分析数据。为了确认依从性，开发了液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法来检测并定量从各患者收集的血浆中的抗-HCV药物浓度。简言之，在开始治疗后8h、24h和48h从25名患者收集血液样品。用3mL含有阿巴卡韦的乙酸乙酯(作为内标)提取50μL血浆。收集上清液，空气干燥，然后在含有75％甲醇的2mmol/L乙酸铵溶液中重构。通过LC-MS/MS在多反应监测模式下同时监测并定量五种目标化合物，包括索非布韦(m/z 530.2/243.2)、达卡他韦(m/z 739.5/339.3)、雷迪帕韦(m/z889.4/637.3)、阿那匹韦(m/z 748.4/648.4)和西美瑞韦(m/z 750.4/315.2)。使用与ABSCIEX API5000三重四极质谱仪(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)偶联的Dionex Ultimate3000HPLC系统(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行分析。

病毒学失败、病毒突破和耐药性监测

根据方案，导致研究药物停用的病毒学失败定义为：(1)2天未能达到血浆HCV RNA<25IU/ml，或者(2)在治疗时HCV RNA<25IU/ml的受试者中，在任意时间点连续两次确认HCVRNA≥25IU/ml，或者(3)在治疗期间的任意时间点连续两次测量HCV RNA在最低值以上增加>1log₁₀IU/ml。

终点

主要的功效终点为治疗完成后具有12周SVR的个体的比例，由HCV RNA低于定量下限(25IU/ml)定义。主要的安全性终点为不良事件的频率和严重程度。次要终点为：(1)在治疗期间和治疗后的特定时间点检测不到HCV病毒载量的受试者的比例；(2)具有不良事件的患者的比例；(3)与不良事件有关的停药率；(4)安全实验室变化；(5)HCV RNA自基线循环的动力学；以及(6)和HCV耐药突变的发生。

统计学分析

至少需要14位患者来推动这一概念验证性临床研究，并因此指导比较后期临床研究的决定。为了满足动力计算要求，选择了18名患者的样本量，每个治疗组中有6名患者。假设每组SVR12率至少比文献增加1％¹³，每组样本量为6，检测到这种增加的能力在α水平为0.05时从78％到99％不等，取决于增加的幅度。

使用Kruskal-Wallis检验(用于连续结果)和Fisher精确检验(用于二元结果)比较组间的基线特征。使用Kruskal-Wallis检验来比较组间HCV病毒载量下降的差异，并通过Dunn's检验校正用于组间多重比较。

使用Wilcoxon符号秩检验对各组治疗前、治疗结束时和治疗后12周的HCV RNA浓度和肝硬度进行比较。统计分析基于意向治疗原则。由于这是一个2a期、概念验证性研究，所以小样本量不允许使用多变量模型分析uRVR的预测因子。

显著性水平设为ρ<0.05。统计分析使用Stata(版本13；StataCorp)完成。使用多尺度模型对所有26名参与者进行病毒动力学建模(Guedj J,Dahari H,Rong L等人，Modelingshows that the NS5A inhibitor daclatasvir has two modes of action and yieldsa shorter estimate of the hepatitis C virus half-life.Proc Natl Acad Sci U SA 2013；110:3991–96；Rong等人，Analysis of hepatitis C virus decline duringtreatment with the protease inhibitor danoprevir using a multiscalemodel.PLoS Comput Biol 2013；9:e1002959)(附录第12页)。

结果

受试者

在2015年2月15日至2015年3月12日期间，对27名慢性丙型肝炎患者进行了资格评估。一名肝硬化受试者被排除在外，26名受试者被随机分入三个治疗组(图1)。接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的12名患者中的6名(50％，95％CI 25-75)，接受索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦的6名患者中的6名(100％，61-100)，接受索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦的8名患者中的6名(75％，41-95)，到第2天达到血浆HCV RNA浓度低于500IU/ml，随后接受3周的三重直接作用性抗病毒疗法(ρ＝0.10)。表1示出了登记人员的基线特征。

表1：达到超快速病毒学应答的患者的基线人口统计和临床特征

除非另有说明，否则数据是平均值(SD)或n(％)。BMI＝体重指数。HCV丙型肝炎病毒。*数据表示对最新的在先方案的应答。复发者是这样的患者：其接受了至少36周的聚乙二醇干扰素和利巴韦林，在治疗结束时具有检测不到的HCV DNA，但在随访52周内检测到HCV DNA。部分应答者是这样的患者：其接受了至少20周的聚乙二醇干扰素和利巴韦林，并且在第12周时HCV RNA降低达到≥2log₁₀IU/ml，但是在治疗结束时未能达到HCV RNA无法检测。无应答者是这样的患者：其接受了至少12周的聚乙二醇干扰素和利巴韦林，并且在第12周时HCV RNA降低未能达到2log₁₀IU/ml。肝硬度由Fibroscan确定；该研究中没有患者患有肝硬化(纤维化评分>12.5kPa)。

除非另有说明，否则数据是平均值(SD)或n(％)。

*正负值是平均值±标准偏差。Kruskal-Wallis检验和Fisher精确检验分别用于检验治疗组之间连续变量和分类变量的差异。除BMI(p＝0.047)外，所有变量在治疗组间无显著差异。HCV表示丙型肝炎病毒，SOF表示索非布韦，DCV表示达卡他韦，LDV表示雷迪帕韦，SMV表示西咪匹韦，ASV表示阿那匹韦。

^#体重指数(BMI)是以千克为单位的重量除以以米为单位的身高的平方。

^&数据表示对最新的基于PR的方案的应答。

复发者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少36周的pegIFN/RBV，并且在治疗结束时检测不到HCV RNA，但在治疗随访52周内检测到HCV RNA。

部分应答者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少20周的pegIFN/RBV，并且在第12周时HCV RNA降低达到≥2log₁₀IU/ml，但是在治疗结束时未能达到HCV RNA无法检测。

无应答者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少12周的pegIFN/RBV，并且在第12周时HCV RNA降低未能达到2log₁₀IU/ml。

^$肝硬度由Fibroscan(Echosens,France)确定。该研究中没有患者患有肝硬化(纤维化评分>12.5kPa)。

所有参与者均为中国人，6名(33％)为男性，7名(39％)具有IL28非CC基因型，8名(44％)的基线HCV RNA低于800 000IU/ml。4名(22％)患者患有2期肝纤维化。除了体重指数之外，3周治疗组中每一组中的患者均匹配良好。未达到uRVR的8名患者在第3天转为索非布韦和雷迪帕韦并随访，但未纳入后续研究，因此可选择8周(n＝4)或12周(n＝4)的治疗持续时间。与无uRVR患者相比，uRVR患者的平均基线HCV RNA显著较低(7.0log₁₀IU/mL[95％CI6.8–7.2]对6.0log₁₀IU/mL[5.6–6.3]，ρ<0.0001；附录第2页)。没有uRVR的8名患者在功效和安全性分析中未被考虑。然而，他们都没有3-4级不良事件，并且所有这些患者都达到了SVR12。

除了基线HCV RNA水平外，到第2天血浆HCVRNA≥500IU/ml和<500IU/ml的受试者之间，关于基线处的人口统计学、生物学和病毒学，没有观察到差异(表1)。

功效

在第3周，不论所分配的直接作用性抗病毒治疗方案，所有18位达到了uRVR的患者均都检测不到血浆HCV RNA。接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的患者达到血浆HCV RNA少于25IU/ml的中位时间短于接受索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦的患者(4天[IQR 0]对14天[7]；ρ＝0.01)。直至治疗完成后第12个月，血浆HCV RNA仍低于定量限(表2)。达到uRVR的患者达到血浆HCV RNA低于25IU/ml的中位时间(7天[IQR 10])显著短于未达到此阈值的患者(17.5天[10.5]；ρ＝0.003；表2)。

表2 HCV RNA水平低于定量限的受试者的比例*

治疗后期间

*Roche COBAS Taqman检测的血浆HCV RNA定量限为25IU/ml。

对于HCV RNA水平达到低于定量限的中位时间在SOF+LDV+ASV和SOF+DCV+ASV之间的差异，ρ＝0.01。通过Kruskal-Wallis检验来检验显著性，并通过Dunn's检验校正用于组间多重比较。

肝硬化的事后分析显示，在接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦(6.1kPa对4.9kPa，ρ＝0.028)以及接受索非布韦、达卡他韦和西咪匹韦(5.8kPa对5.1kPa，ρ＝0.046)的患者中，自基线至治疗后12周肝硬化显著下降，而在接受索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦(5.5kPa对5.4kPa，ρ＝0.53)的患者中则无此现象。

通过考虑该方案在抑制HCV RNA合成(ε_α)和病毒体分泌或输出(ε_s)中的有效性，来估计整体治疗对HCV清除的效果，其中ε＝1是100％有效的并且增强细胞内HCV RNA下降(由一个因子κ)。该模型很好地拟合了个体患者数据，如附录(第9页)所示。HCV RNA动力学表现出三阶段病毒下降，第一阶段快，中间阶段期间中度下降，然后第三阶段较慢。平均(图2)和中位丙型肝炎病毒载量的下降率在三个治疗组之间没有显著差异(附录第8页)。基于18例uRVR患者，治疗的估计平均有效性为εα＝0.9962和εs＝0.9987(附录第7页)。病毒清除的平均估计率为29.7/天，直接作用性抗病毒疗法在增强细胞内HCVRNA降解中的平均有效性κ为1.49，与先前的估计一致²²。使用来自所有26名治疗患者的数据，参数值在uRVR患者和无uRVR患者中分布不均(数据未显示)。然而，uRVR患者的估计基线病毒载量(V0)显著低于无uRVR者(log₁₀V0 5.81对7.23，ρ<0.0001；附录第11页)。

在基线处进行耐药性相关的变异分析以阐明天然存在的耐药性特征。由于在治疗过程中所有患者都达到了快速病毒清除，因此很难在其他时间点进行耐药性相关的变异分析。NS3/4A、NS5A和NS5B的测序在所有26个基线样本中均成功。在26个基线样本中的23个(88％)中在NS3/4A中鉴定出了五种天然存在的蛋白酶抑制剂耐药性相关的变异(V36L、T54S、S122R、I132V或D168H/N/Y)。在所有23个样品中均发现了I132V变异，其中5个具有一个另外的突变(两个D168H/N/Y，一个S122R，一个T54S，和一个V36L)。在26个样品中的23个(88％)中鉴定出了四种与达拉他韦或雷迪帕韦耐药性相关的NS5A变异体(Q30R、L31F/V、H54N或Y93H)。在所有23个样本中均发现了Q30R变异体，并且五个具有一个或两个另外的突变(附录第13页)。其他次要突变总结于附录中(第13页)。没有与索非布韦耐药性相关的282T突变。

血浆药物浓度提供了研究期间药物递送和患者依从性的确认(附录第14、15页)。患者服用的药物与他们的治疗方案一致，只有少数例外，其中血浆药物浓度低于可以通过HPLC-MS定量的限度。

达到第2天HCV RNA<500IU/ml的受试者中达到血浆HCV RNA<25IU/ml的中位时间显著短于未达到此阈值的受试者(p＝0.003，表3)。

表3：HCV RNA水平低于定量限的个体的比例*

*Roche COBAS Taqman测试的血浆HCV RNA的定量限为25IU/ml。

对于HCV RNA水平达到低于定量限的中位时间在这两组之间的差异，ρ＝0.003。Wilcoxon-Mann-Whitney检验检验了显著性。na＝不适用

病毒动力学研究

之前的体外研究和体内建模数据表明NS5A和HCV蛋白酶抑制剂都能抑制HCV RNA复制和病毒体组装、成熟或分泌^26,27,28,29。使用我们的模型，通过考虑该方案在抑制HCV RNA合成和病毒体分泌/输出(分别为ε_α和ε_s)以及增强细胞内HCV RNA下降(κ)中的有效性，估计了整体治疗对HCV清除的效果。该模型很好地拟合了个体患者数据，如图2和3所示。

在图3中，符号示出了每个治疗组的平均log10病毒载量，而实线示出了平均模型预测轨迹，其使用表7中给出的组中各患者的估计参数由预测病毒载量，方程式(1)计算而得，然后取平均值。水平虚线表示测定的定量下限。在所有三个治疗组中，病毒下降似乎有三个阶段。该趋势在治疗组SOF+DCV+SMV(组2)中更明显。注意，在计算数据的平均值时，定量下限用于低于该限值的数据，因此水平线上的数据符号表示治疗组中所有6名个体的数据在哪一点具有不可量化的HCV RNA。

图3绘制了中位病毒载量的下降，并避免了低于定量限的数据引入的偏差。表现出不同病毒下降动力学(见插图)的三个组的基线病毒载量不同，尽管在这三个治疗组间病毒下降率没有显著差异。HCV表示丙型肝炎病毒，SOF表示索非布韦，DCV表示达卡他韦，LDV表示雷迪帕韦，SMV表示西咪匹韦，ASV表示阿那匹韦。

HCV RNA动力学表现出三阶段病毒下降，第一阶段快，中间阶段期间中度下降，然后第三阶段较慢。平均(图2)和中位丙型肝炎病毒载量的下降率在三个治疗组之间没有显著差异(图3)。基于18例RVR患者，治疗的估计平均功效为ε_α＝0.9962，ε_s＝0.9987(表5和6)。病毒清除的平均估计率为29.7/天，DAA在增强细胞内HCV RNA降解中的平均有效性κ为1.49，与先前的估计一致²⁶。使用来自所有26名治疗受试者的数据，没有发现参数值在RVR患者和无RVR患者中分布不同。然而，与无RVR患者相比，RVR患者的基线病毒载量(V₀)显著较低(log₁₀V₀ 5.81对7.23，ρ<0.0001，表8和9)。

安全性

18名完成治疗的患者中，最常见的不良事件是头痛和疲劳(表3)，所有不良事件均为轻度至中度。两名患者出现3级实验室异常：一人患有由月经过多引起的贫血，与子宫肌瘤相关，另一人患有暂时性高胆红素血症。暂时性高胆红素血症的原因尚不清楚。先前，在达卡他韦加阿那匹韦的临床研究中也报道了这种不良事件。在本研究中，这仅在接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的六名患者中的一名中有记录。未报告4级实验室异常。

表4：治疗期间的不良事件和实验室异常

没有因不良事件导致的死亡或中断。所有不良事件和严重不良事件均从签署同意书之时起记录至治疗停止后14天。由研究者来确定不良事件与治疗方案的相关性(可能的)；受试者可能有不止一个不良事件。

研究治疗没有因任何不良事件而中断或停止。两名受试者出现3级实验室异常——一人患有由月经过多引起的贫血，与子宫肌瘤相关，另一名具有未知原因的暂时性高胆红素血症。未报告4级实验室异常。

讨论

在该慢性基因型1b型HCV中国患者的探索性队列研究中，其中这些患者无肝硬化并且针对三重直接作用性抗病毒治疗方案具有uRVR，我们证明这些方案的耐受性良好，治愈率达到100％。本研究报告了用于慢性HCV感染患者的全口口服直接作用性抗病毒剂的最短治疗时间。与有关全口口服直接作用性抗病毒剂的其他报道研究相比，不良事件发生率较低，这可能与疗法持续时间较短有关。患者接受了随访，自试验结束后约10个月未记录到复发或不良事件。

目前向无肝硬化基因型1b型患者的推荐包括：用雷替泊韦和索非布韦治疗8-12周；或用帕利瑞韦和利托那韦加奥比塔韦和达沙布韦、或索非布韦加西咪匹韦、或索非布韦加达卡他韦、或grazoprevir(MK-5172)和依巴司韦(MK-8742)治疗12周，在95％以上的接受者中产生SVR12(Omata等人，APASL consensus statements and recommendation ontreatment of hepatitis C.Hepatol Intl 2016；published online April 29.DOI:10.1007/s12072-016-9717-6)。

限制直接作用性抗病毒剂对HCV患者广泛使用的主要因素是治疗成本高，每日约200-1200美元，即使在打折时。设计了若干临床试验以将治疗持续时间缩短至6-8周，成功率超过80-90％(Kohli等人，Virological response after 6 week triple-drugregimens for hepatitis C:a proof-of-concept phase 2A cohort study.Lancet2015；385:1107–13；Sulkowski等人，Efficacy and safety of 8 weeks versus 12 weeksof treatment with grazoprevir(MK-5172)and Elbasvir(MK-8742)with or withoutribavirin in patients with hepatitis C virus genotype 1 mono-infection andHIV/hepatitis C virus co infection(C-WORTHY):a randomised,open-label phase 2trial.Lancet 2015；385:1087–97)。

迄今为止，试图进一步将治疗缩短至4周仍然是失败的。在C-SWIFT基因型1型研究中(Poordad等人，C-swift:grazoprevir/elbasvir+Sofosbuvir in cirrhotic andnoncirrhotic,treatment-naive patients with hepatitis C virus genotype 1infection,for durations of 4,6 or 8 weeks and genotype 3 infection fordurations of 8 or 12 weeks.J Hepatol 2015；62:S192–93)，在用4周固定剂量的grazoprevir(MK-5172)、依巴司韦(MK-8742)和索非布韦组合治疗(400mg，每日一次)后，5名无肝硬化的基因型1b型慢性丙型肝炎患者中，仅有3例在治疗结束后第4周或第8周达到了SVR。类似地，在用雷迪帕韦和索非布韦加GS-9451和GS 9669治疗的早期F0-F2纤维化患者的NIH/UMD协同试验(Kattakuzhy等人，J Hepatol 2015；62:S669)中，25例中仅有5例(20％)达到了SVR12，而使用雷迪帕韦和索非布韦加GS-9451治疗的另一队列研究中的25例患者中有10例(40％)达到了SVR12。

在使用NS5A抑制剂，例如达卡他韦(Guedj等人，Proc Natl Acad Sci USA 2013；110:3991–96)或雷迪帕韦(Lawitz等人，J Hepatol 2012；57:24–31)的方案中，抗-HCV药物治疗期间的HCV RNA动力学模型预测第一阶段更快，使用蛋白酶抑制剂(Guedj和Perelson,Hepatology 2011；53:1801–08)第二阶段更快。本发明人认为这一发现与索非布韦的使用一起可以缩短治疗持续时间。本研究强烈表明，将3种不同的经批准的口服抗HCV药物组合在一起，导致所有在治疗的头2天内血浆HCV RNA降低至低于500IU/ml的无肝硬化基因型1b型HCV患者3周内完全治愈(SVR12)。第2日应答和SVR12在使用的三种药物组合之间没有观察到差异。

尽管如此，接受索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦的患者比接受索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦的患者获得抗病毒功效的时间更短；原因不明。这两组之间最明显的区别是包括雷迪帕韦(索非布韦、雷迪帕韦和阿那匹韦)与达卡他韦(索非布韦、达卡他韦和阿那匹韦)。回顾科学文献，仅发现了一个比较，用于日本患者丙型肝炎基因型1型的达卡他韦加阿那匹韦与索非布韦和雷迪帕韦，但这是间接比较(Swallow等人，J Comp Eff Res 2016；5:273–79)。尚没有直接对雷迪帕韦和达卡他韦进行过比较。

相当比例的入选个体(26例中有18例(69％))血浆HCV RNA达到了非常快速的大幅度下降。这种快速病毒下降可能受基线NS5A耐药性相关的变异的存在的影响(附录第13页)。天然存在的耐药性相关的变体的原因仍然未知。然而，在我们的研究中，基线耐药性相关的变体不影响患者的SVR12，无论其是否具有uRVR。即使对于没有uRVR的患者，基线耐药性相关的变体也不会影响治疗超过3周(即，8周或12周)的患者的SVR12。

据我们所知，这项研究首次采用应答指导型疗法的原则，采用全直接作用性抗病毒方案，缩短治疗时间，高比例的患者达到了SVR12。该治疗可以大大缩短疗法的持续时间，从而降低依从性和成本，并改善直接作用性抗病毒药物的可及性和可负担性，特别是在中等收入和低收入国家。此外，该治疗方案可以减少耐药性的产生，副作用的发生，并有助于减少一些国家使用假冒的直接作用性抗病毒剂，这可能是有害的。

我们的发现与如下观点不一致：治愈对应于治疗结束时细胞外体液(即15L)中的病毒载量低于小于一个病毒粒子的治愈边界，其对应于浓度约10^-4IU/mL^13,14,31(Guedj等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2013；110:3991–96；Kohli等人，Lancet 2015；385:1107–13；Perelson和Guedj,Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2015；12:437–45)。

多尺度模型预测，18位治疗患者中没有一位会达到治愈边界(附录第9页)。这一发现促使人们重新考虑是否有必要将病毒量减少至少于一个病毒粒子以实现治愈。

这与SYNERGY和PILOT试验的结果一致，其中一些在治疗结束时具有可检测的血浆HCV RNA水平的受试者具有SVR12(Kohli等人，Lancet 2015；385:1107-13.；Svarovskaia等人，Clin Infect Dis 2014；59:1666-74)。

目前，尚没有关于这些研究中治疗结束时具有可检测的HCV RNA的患者中病毒反弹的缺乏，做出经证明的解释。然而，存在两种可能性：第一，免疫系统控制病毒，导致功能性治愈，正如在停止治疗的HIV感染者的罕见情况中所报道的(Kohli等人，Lancet 2015；385:1107-13.；Yukl等人，PLoS Pathog 2013；9:e1003347；Saez-Cirion等人，ANRSVISCONTI Study.PLoS Pathog 2013；9:e1003211；Conway和Perelson,Proc Natl AcadSci USA 2015；112:5467-72)或第二，由高灵敏度检测检测到的HCV RNA不具有感染性。

鉴于免疫系统在控制病毒感染方面的潜在重要性，可以测量免疫学数据，例如抗-HCV抗体水平和细胞因子水平，如CXC基序趋化因子10(也称为干扰素γ-诱导的蛋白10)水平，看看它们是否可以帮助提高SVR预测。(Lin等人，J Infect Dis 2014；210:1881-5；Rehermann,Nat Med 2013；19:859-68)。

直接作用性抗病毒介导的HCV清除与由IFN-α引起的肝内免疫活化的丧失有关，其由CXCL10和CXCL11的水平降低以及NK细胞表型和功能的正常化指示(Rehermann,Nat Med2013；19:859-68)。有趣的是，HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂也可以恢复感染细胞内的先天免疫应答，这些应答可以促使细胞内病毒RNA快速损失。实际上，已经表明，HCV NS3/4A蛋白酶可以有效地裂解并灭活感觉通路中的两个重要信号传导分子，这两个重要信号传导分子作用于HCV病原体相关分子模式(PAMP)以诱导IFN，即，线粒体抗病毒信号传导蛋白(MAVS)和含有Toll-IL-1受体结构域的接头诱导型IFN-β(TRIF)⁴¹。这可以解释使用HCV蛋白酶抑制剂特拉匹韦(telaprevir)³⁴所观察到的第二阶段下降比使用HCV聚合酶抑制剂索非布韦(单独或与利巴韦林或另一种核苷酸类似物组合)(Guedj等人，Antivir Ther 2014；19:211-20)更快。

各组个体数量少限制了不同直接作用性抗病毒方案的比较，而且直接比较可能有待进一步研究。此外，患者是患有基因型1b型HCV感染且无肝硬化的中国人，其中高达85％具有IL28B CC基因型。IL28B CC基因型和基因型1b型HCV感染是SVR的预测因素，有些人可能认为双重直接作用性抗病毒疗法可以在该人群中获得良好的应答。已报道，用直接作用性抗病毒剂治疗增加了先前患有HCV相关性肝细胞癌患者中肝细胞癌复发的风险(Reig等人，J Hepatol April 12,2016)。然而，据我们所知，这项研究首次报道了在3周的直接作用性抗病毒治疗后可以实现SVR12。正常情况下，基于干扰素的治疗可以在44-79％的HCV基因型1型感染患者中在24周达到SVR(Nguyen and Nguyen,Aliment Pharmacol Ther 2013；37:921–36)，但是仍然需要超过48周的治疗。有限的数据支持使用双重直接作用性抗病毒治疗来缩短治疗持续时间。由于核苷类似物抑制剂不会产生如HCV蛋白酶抑制剂一样快的第二阶段下降，因此向索非布韦和雷迪帕韦或达卡他韦中添加蛋白酶抑制剂能够缩短治疗持续时间，这由本文提供的数据支持。

在这项研究中，大部分患者是基线HCV病毒载量低的年轻女性。尽管不希望受到特定理论的束缚，但这些特征可能与对低于6周的短期全口口服直接作用性抗病毒疗法的有利应答有关。尽管如此，据估计，中国至少有400万人具有这种特征(Wei等人，Hepatology2011；54:563A–64)，并且我们相信这些发现可以使更多具有相同背景的全球慢性丙型肝炎患者受益。这种应答指导型治疗方法可以应用于具有不同种族背景、不同基因型和具有肝硬化的患者，根据个体情况进行适当的修改，可以由治疗医生很容易地确定。

该研究包括相对较少的受试者数。然而，它确实倾向于表明使用治疗时应答可以减少HCV疗法的持续时间。

受试者为中国人、非肝硬化并感染了HCV基因型1b型。它们不代表整个HCV感染人群。然而，根据信息和信念，结果可合理推断至具有不同基因型和肝硬化的其他民族/种族。

总之，基于本研究中的高SVR12率，有可能提供合理治愈率，治疗持续时间较常用的常规治疗(索非布韦或Harvoni)相对更短。这可以显著降低DAA方案的成本，并使治愈性治疗方案更易于获得并且价格合理。另外，本文所述的组合疗法可以减少耐药性和副作用的出现。组合疗法还可以帮助减少大量使用假药，大量使用假药可能是有害的。

可以通过对具有高效力、对受试者和病毒的特定特征具有特定的非重叠耐药性特征的DAA的使用进行研究，来获得其他药物动力学和免疫学数据，从而显著缩短治疗持续时间而不损害功效。

建立来自SODAPI研究的受试者中的病毒动力学模型

数据和2组分析

使用用DAA疗法治疗3-12周的26位受试者的病毒载量数据。用SOF+LDV+ASV(n＝12)，SOF+DCV+SMV(n＝6)和SOF+DCV+ASV(n＝8)治疗这26名受试者。用三重疗法治疗到第2天病毒载量<500IU/ml的受试者(n＝18)治疗3周。到第2天未能达到血浆HCV RNA<500IU/ml的受试者在第3天从三重DAA转为SOF和LDV，共持续8或12周。

最近开发了一种用于HCV动态变化的多尺度模型(Guedj等人，2013)，以及用于同时拟合来自多个受试者的数据的非线性混合效应建模方法，使用了该多尺度模型和非线性混合效应建模方法。对2组数据进行参数估计。第一组数据包括18名受试者的亚组，该18名受试者用三重疗法治疗了3周。第二组数据包括所有26名受试者。

模型和分析方法

使用以下由Guedj等人(2013)推导的针对多尺度HCV模型方案的分析粗略估算。

其中

方程中使用的符号描述于下表7中。

表5.方程式1中使用的符号的描述和值。

使用了非线性混合效应建模方法，其中该模型同时拟合来自多个受试者的数据，假定参数在受试者群体中遵循给定的分布。该方法的一个优点是它能够有效地处理缺失的数据，以便使我们的研究中取样密度较小的那些个体可以包括在拟合中。使用该非线性混合效应建模框架，对使用不同DAA组合处理的组之间参数值是否显著不同进行了评估。使用Monolix 4.3.0(www.lixoft.com)中实施的算法进行参数估计。Monolix中低于检测限的数据点被归类为截尾数据。

结果——18位受试者(接受3周治疗)

多尺度模型(方程式1)拟合18位治疗了3周的受试者的数据。在拟合中，假设参数V₀和t₀在受试者中遵循对数正态分布，参数c遵循正态分布，并且log₁₀(1-ε_α)和log₁₀(1-ε_s)的值正常分布。进一步假定参数c不具有随机效应，即，其值对于所有受试者都是相同的。估计的群体参数、个体参数和拟合结果示于下表5和6以及图2A-2C中。对于18名受试者，治疗在抑制HCV RNA合成和病毒粒子分泌/输出方面的估计平均功效分别为ε_α＝0.9962，ε_s＝0.9987。平均估计log₁₀基线病毒载量为5.93(log₁₀IU/ml)。平均估计病毒清除率c为29.7/天。DAA在增强细胞内HCV RNA降解中的平均有效性κ为1.49，与之前的估计一致(Guedj等，2013)。我们还测试了用不同组合治疗的受试者之间参数值分布是否显著不同。(参数ε_α除外，因为对于用SOF+LDV+ASV治疗的个体不能可靠地估计该参数)。我们发现参数分布没有显著差异。我们还测试了任意估计的参数是否与身体质量指数显著相关。也没有显著的关联。

表6示出了使用非线性混合效应模型拟合推导的治疗3周的18位受试者的估计群体参数值。

表6

*ε_α和ε_s的相应值分别为0.9962和0.9987。

表7示出了使用非线性混合效应模型拟合推导的治疗3周的18位受试者的估计个体参数。

图2A-C示出了多尺度模型与来自治疗了3周的18位受试者的数据的拟合图。图4A和4B示出了多尺度模型与来自26位受试者的数据的拟合图。可量化的HCV RNA载量显示为黑点，而低于定量限的病毒载量(虚线)显示为红点。使用了最佳拟合个体参数的模拟以实线示出，该最佳拟合个体参数由非线性混合效应模型的群体拟合估计而得。

在48小时未达到HCV RNA<500IU/ml的受试者的数目在组I中为6，在组2中为0，在组3中为2。

符号示出了各治疗组的中位log₁₀病毒载量，而黑色实线示出了平均模型预测轨迹，该平均模型预测轨迹是通过使用从混合效应模型推导出的参数分布中随机选择的参数来模拟方程式(1)1000次计算而得。灰色带示出了模拟结果的四分位数内范围。水平虚线表示测定的定量下限。在所有三个治疗组中，病毒下降似乎都有三个阶段。该趋势在治疗组SOF+DCV+SMV(组2)中更明显。三个治疗组之间的病毒下降率没有显著差异。显著性通过Kruskal-Wallis检验进行检验，并通过Dunn's检验进行校正以进行多组间比较。HCV表示丙型肝炎病毒，SOF表示索非布韦，DCV表示达卡他韦，LDV表示雷迪帕韦，SMV表示西咪匹韦且ASV表示阿那匹韦。

结果-26名受试者

然后用多尺度模型(方程1)拟合来自所有26名受试者的数据。假设随机效应参数遵循如上所假设的相同类型的分布。使用非线性效应建模方法，我们首先测试了使用不同组合治疗的受试者之间参数值分布是否显著不同。在头2天有额外的6名受试者用SOF+LDV+ASV治疗，因此我们能够估计用这种组合治疗的受试者的参数ε_α的分布，从而能够测试用不同组合治疗的受试者的ε_α分布的差异。我们发现参数分布没有显著差异。

其次，通过将治疗持续时间设定为分类协变量，我们测试了治疗3周(“短期”治疗)的18名受试者和用Harvoni治疗超过3周(“长期”治疗)的8名受试者之间的参数分布是否不同。我们发现，在对多次测试进行Bonferroni纠正后，治疗3周的受试者和治疗超过3周的受试者之间参数V₀分布显著不同(参见表9和10以及图3中的估计群体参数、个体参数和拟合结果)。治疗3周的受试者的估计基线病毒载量比治疗超过3周的受试者低(log₁₀V₀的群体平均值分别为5.81和7.23，p值：1.5×10^-6)。治疗在抑制HCV RNA合成和病毒粒子分泌/输出方面的估计平均功效分别为ε_α＝0.9983，ε_s＝0.9993，类似于上文使用来自18位受试者的数据的结果。DAA在影响细胞内HCV RNA降解中的平均有效性κ为0.68。估计平均病毒清除率和估计平均药理学延迟分别为23.9/天和0.5小时，与之前的估计一致(Guedj等人，2013)。

表8示出了使用非线性混合效应模型拟合推导的用DAA组合治疗的26位受试者的估计群体参数值

表8

我们假设参数V₀在治疗3周('短'持续时间)和治疗超过3周('长'持续时间)的受试者之间分布不同。

*log₁₀V_0,短和log₁₀V_0,长的分布之间的差异的p值为1.5X10^-6。

**ε_α和ε_s的相应值分别为0.9983和0.9993。

表9示出了使用非线性混合效应模型拟合推导的用DAA组合治疗的26位受试者的估计个体参数

我们假设参数V₀在治疗3周的受试者和治疗超过3周的受试者之间分布不同。

图2A-C示出了多尺度模型与来自用DAA组合治疗的26位受试者的数据的拟合图，假定V₀在治疗3周的受试者和治疗超过3周的受试者之间分布不同。可量化的HCV RNA载量显示为黑点，而低于定量限(虚线)的病毒载量显示为红点。使用了最佳拟合个体参数的模拟以实线示出，该最佳拟合个体参数由非线性混合效应模型的群体拟合估计而得。

表10示出了26名受试者的基线HCV NS3/4A、NS5A和NS5B耐药性相关的变体(RAV)。

表10

使用如下引物序列(5'-3'方向)对NS5B区域进行部分扩增：1-fwd：GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA和2-revTGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)或ExoSAP It试剂盒(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)纯化后，由GENEWIZ公司(South Plainfield,NJ)使用Applied Biosystems BigDye3.1版进行引物延伸测序。然后在Applied Biosystem的3730xl DNA分析仪上进行反应。

检测到与非利布韦或洛美布韦(VX222)耐药性相关的一个(4.2％)NS5B RAV(R422K)。有趣的是，我们没有发现基线多态性L320F，L320F与另一种突变(L159F)组合可以赋予对NS5B抑制剂的耐药性(表S6)。8名无RVR受试者中的3名和18名RVR受试者中的2名具有NS5A RAV，无RVR中的Y93H(n＝2)或L31F(n＝1)，和RVR中的H54N(n＝1)或L31V加Y93H(n＝1)(p＝0.08)。

表11示出了用DAA组合治疗的受试者中抗-HCV药物的血浆浓度(ng/mL)

表11

表11(续)

-表示低于LOQ

用3mL含有阿巴卡韦(作为内标)的乙酸乙酯提取50μL血浆。收集上清液，空气干燥，然后在含有75％甲醇的2mM乙酸铵溶液中重构。通过LC-MS/MS在多反应监测(MRM)模式下同时监测并定量五种目标化合物，包括索非布韦(m/z 530.2à243.2)、达卡他韦(m/z739.5à339.3)、雷迪帕韦(m/z 889.4à637.3)、阿那匹韦(m/z 748.4à648.4)和西咪匹韦(m/z 750.4à315.2)。测量的SOF浓度范围很宽，从BLOQ到3,174ng/mL；LDV和DCV的范围为BLOQ到469ng/mL和101到3045ng/mL；ASV和SMV的范围分别为BLOQ至626ng/mL和30.6至693ng/mL。这些结果表示了受试者在第一次治疗后8、24和48小时的药物水平。

补充文件

下面介绍其他实验数据。表12示出了基线时快速应答者和慢速应答者的人口统计学和临床特征*

表l2

*正负值是平均值+/-SD。分别使用Kruskal-Wallis检验和Fisher精确检验来检验治疗组之间连续变量和分类变量的差异。

Π体重指数(BMI)是以千克为单位的重量除以以米为单位的身高的平方。

&数据表示对最新的基于PR的方案的应答。复发者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少36周的pegIFN/RBV，并且在治疗结束时检测不到HCV RNA，但在治疗随访52周内检测到HCV RNA。部分应答者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少20周的pegIFN/RBV，并且在第12周时HCV RNA降低达到≥2log₁₀IU/ml，但是在治疗结束时未能达到HCV RNA无法检测。无应答者是这样的受试者：其为了治疗HCV，接受了至少12周的pegIFN/RBV，并且在第12周时HCV RNA降低未能达到2log₁₀IU/ml。

$肝硬度由Fibroscan(Echosens,France)确定。该研究中没有患者患有肝硬化(纤维化评分>14.7kPa)。

表13示出了HCV RNA水平低于定量限的个体比例*

表13

*Roche COBAS Taqman检验的血浆HCV RNA定量限为25IU/ml。对于HCV RNA水平达到低于定量限的中位时间在两组间的差异，ρ＝0.003。显著性通过Wilcoxon-Mann-Whitney检验的检验。Na＝不适用。

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应当理解，上述实施方式和实施例是以举例说明的方式，而非限制方式给出的。根据本说明书，本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

以上引用的所有参考文献(专利和非专利)通过引用并入本专利公开中。这些参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者的论断。不承认任何参考文献(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术(或者根本不存在现有技术)。申请人保留质疑所引用参考文献的准确性和针对性的权利。

Claims

1.一种用于治疗丙型肝炎病毒感染的制剂，其包括

(i)

a)剂量为400-1600mg QD的索非布韦；

b)剂量为90-360mg QD的雷迪帕韦或剂量为60-120mg QD的达卡他韦；以及

c)剂量为150-600mg QD的西咪匹韦或剂量为100-400mg BID的阿那匹韦，以及

(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。

2.权利要求1所述的制剂，其中三种组分中的两种存在于用于口服施用的第一单位剂型中，三种组分中的一种存在于用于口服施用的第二单位剂型中。

3.权利要求1所述的制剂，其包括另外的抗HCV化合物。

4.权利要求1所述的制剂，其中抗HCV化合物的组合包括剂量为400-1600mg QD的索非布韦、剂量为90-360mg QD的雷迪帕韦和剂量为150-600mg QD的西咪匹韦。

5.权利要求1所述的制剂，其中抗HCV化合物的组合包括剂量为400-1600mg QD的索非布韦、剂量为90-360mg QD的雷迪帕韦和剂量为100-400mg BID的阿那匹韦。

6.权利要求1所述的制剂，其中抗HCV化合物的组合包括剂量为400-1600mg QD的索非布韦、剂量为60-240mg QD的达卡他韦和剂量为150-600mg QD的西咪匹韦。

7.权利要求1所述的制剂，其中抗HCV化合物的组合包括剂量为400-1600mg QD的索非布韦、剂量为60-240mg QD的达卡他韦和剂量为100-400mg BID的阿那匹韦。

8.权利要求1所述的制剂，其进一步包括JAK抑制剂。

9.权利要求9所述的制剂，其中所述JAK抑制剂是鲁索替尼、巴瑞替尼或托法替尼。

10.一种用于治疗丙型肝炎病毒感染的方法，其包括：

a)施用权利要求1-9中任一项的制剂持续2天，或者，停止使用权利要求1-9中任一项的制剂进行治疗，改为施用传统抗HCV疗法，

b)测量血浆HCV RNA拷贝数，如果患者表现出快速病毒学应答，所述快速病毒学应答被定义为血浆HBV RNA拷贝小于500IU/ml，则继续治疗至3周，直到患者的血浆HBV RNA拷贝小于25IU/ml，如果在治疗的三周内，未达到血浆HBV RNA拷贝小于25IU/ml的限值，则停止使用权利要求1-7中任一项的制剂进行治疗，改为施用常规抗HCV疗法。

11.权利要求10所述的方法，其进一步包括筛选HCV阳性患者以确定以下中的一种或两种：其HCV基础病毒载量和开始治疗前其是否患有肝硬化。

12.权利要求10所述的方法，其中所述HCV是HCV亚型1a或1b。

13.权利要求12所述的方法，其中所述HCV是HCV亚型1b。