CN108456184B - 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用，所述小分子抑制剂的分子式为：C₄₄H₅₄N₄O₆S，分子量为：767，中文名为：1‑{4‑[4‑(2‑羟基‑3‑{4‑[(2Z)‑3‑苯丙‑2‑烯‑1‑基]哌嗪‑1‑基}丙氧基)苯磺酰]苯氧基}‑3‑{4‑[(2Z)‑3‑苯丙‑2‑烯‑1‑基]哌嗪‑1‑基}‑2‑丙醇。所述小分子抑制剂能够有效抑制EGFR及EPS8阳性肿瘤的增殖，能够用于制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，具有开发为抗肿瘤小分子靶向药物的巨大潜力。

Description

一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是一类具有蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性的跨膜糖蛋白受体超家族，包括胞外区、跨膜区和胞内区(分为近膜区、激酶区、C末端等3个亚区)，以胞外区为配体结合部位，而激酶区为其主要的功能区[1,2]。EGFR在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞中过表达，并与肿瘤的发生发展密切相关[3,4,5]。

表皮生长因子受体通路底物8(Epidermal Growth Factor Receptor pathwaysubstrate No.8,EPS8)是EGFR重要的激酶活性底物之一。EPS8最初在鼠科纤维母细胞NIH3T3中被发现，其蛋白全长由822个氨基酸组成，其结构主要包含氨基端的磷酸酪氨酸结合蛋白域(phosphotyrosine binding protein,PTB)，中间的EGFR结合域和Src同源结构域3(Src homology 3,SH3)，以及羧基端的多功能结构域[6]。EGFR结合区为EPS8与EGFR近膜区相结合的部位，其上的特异性核定位序列(NLS)在EPS8活化释放后发挥定位作用，介导EPS8定位到细胞核，促进有丝分裂信号的产生[7]。

EPS8在人体组织中分布广泛，在多种肿瘤细胞中异常表达，与肿瘤的增殖、迁移、耐药以及预后密切相关，是抗肿瘤药物的新靶点[8]。EPS8与EGFR近膜区结合并磷酸化，从而激活一系列EGFR下游信号分子[7,9]。(1)EPS8通过EPS8/Ras/ERK、EPS8/PI3K/AKT等信号通路促进肿瘤细胞增殖。Maa等、Xu等和Ding等研究证实EPS8/Ras/ERK信号通路的存在，EPS8通过激活ERK通路促进细胞增殖以及恶性转变[10]。Wang等和Liu等则分别推测出EPS8通过激活PI3K/AKT下游的EPS8/AKT/FOXM1和EPS8/AKT/mTOR/STAT3信号通路，在多种肿瘤细胞增殖中发挥重要作用[11]。(2)EPS8通过Ras-Rac、EPS8/IRSp53/Cdc42、EPS8/AKT/MMP9等信号通路促进肿瘤细胞迁移[12]。EPS8通过形成EPS8-Abi1-Sos1三聚体传递EGF介导的从Ras-Rac信号传递。EPS8通过肌动蛋白的加帽和捆绑的双重功能，参与板状伪足和丝状伪足的形成，并通过EPS8/IRSp53/Cdc42信号通路介导肿瘤细胞迁[13]。EPS8通过EPS8/AKT/MMP-9途径，介导细胞外基质降解以及生长因子的加工，介导细胞外基质重构从而促进肿瘤细胞的迁移。(3)EPS8通过EPS8/AKT/MDM2信号通路促进肿瘤细胞耐药。Chen等发现，沉默EPS8能够增强宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞对顺铂的敏感性，并提升紫杉醇对这两种细胞的杀伤效率[14]；Yang等和Gorsic等研究证实，EPS8抑制剂(光神霉素A)能够降低多种肿瘤细胞中EPS8表达水平，并且与顺铂联用对肺癌细胞具有协同杀伤作用[15]。Maa等研究表明，EPS8上调会导致AKT的大量磷酸化，推测EPS8可能通过激活PI3K/AKT通路降低p53的含量[16]。进一步Tazzari等报道，渥曼青霉素(一种PI3K抑制剂)通过抑制PI3K/AKT通路降低MDM2(Murine Double Minute 2)的活性，上调p53蛋白水平，进而抑制多药耐药相关蛋白1(Multidrug Resistant Protein 1，MRP1)的表达，从而增强AML细胞对药物的敏感性[17]。

以上研究结果提示EPS8是肿瘤增殖、迁移及耐药的重要靶点。然而，目前国内外市场上以EGFR近膜区为靶点，特异性阻断EPS8与EGFR的结合的小分子抑制剂仍空缺。靶向作用于EGFR近膜区的抑制剂特异性强、选择性好，这为研制恶性肿瘤疾病提供新的药物治疗靶向。小分子抑制剂工艺制作简单、成本低、安全性高，可以粉剂、针剂、片剂等各种形式使用及保存；小分子抑制剂的细胞通透性高、生物体内稳定性佳、生物利用度高，具有更好的临床应用性，成为近年来肿瘤靶向治疗研究热点。

参考文献：

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[9].Fazioli,F.,et al.,Eps8,a substrate for the epidermal growthfactor receptor kinase,enhances EGF-dependent mitogenic signals.EMBO J,1993.12(10):p.3799-808.

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[14].Chen,Y.J.,et al.,Eps8 decreases chemosensitivity and affectssurvival of cervical cancer patients.Molecular Cancer Therapeutics,2008.7(6):p.1376-1385.

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[16].Chen,Y.J.,et al.,Eps8 decreases chemosensitivity and affectssurvival of cervical cancer patients.Molecular Cancer Therapeutics,2008.7(6):p.1376-1385.

[17].PL Tazzari,A.C.F.R.,Multidrug resistance-associated protein1expression is under the control of the phosphoinositide 3kinase/Akt signaltransduction network in human acute myelogenous leukemia blasts.NaturePublishing Group,2007(21):p.427-438.

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂，分子式为：C₄₄H₅₄N₄O₆S，分子量为：767，中文名为：1-{4-[4-(2-羟基-3-{4-[(2Z)-3-苯丙-2-烯-1-基]哌嗪-1-基}丙氧基)苯磺酰]苯氧基}-3-{4-[(2Z)-3-苯丙-2-烯-1-基]哌嗪-1-基}-2-丙醇，分子结构式如式I所示：

所述小分子抑制剂EE02阻断体内EPS8与其受体EGFR的相互作用。

本发明一个方面提供了一种靶向EGFR与EPS8结合的化合物或其可药用的盐，其具有如式I所示的结构式。

本发明另一个方面提供了式I所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：

第一步：

先称量

(1.68g,30mmol)和三乙胺(4.55g,45mmol)，溶入到40ml的二氯甲烷中，再缓慢加入MsCl(4.47g,39mmol)，于0℃下搅拌2h。待反应完成后加入HCl(2M)后进行萃取,再用碳酸氢钠洗，再用NaCl洗，再用MgS0₄干燥，最后旋干溶剂得到目标产物(Yield：98％)。

第二步：

先称取1.96g

(10.0mmol)和Cs₂CO₃(4.88g,15.0mmol)in abs DMF(60mL)，然后再缓慢加入哌嗪(1.72g 20.0mmol)，然后在100℃下反应2d。待反应后将反应液旋干，用乙酸乙酯(120ml)溶解，然后再过滤除掉沉淀，再旋干溶剂得到油状液体。最后再通过硅胶柱层析法提纯目标产物，产率为94％。

第三步：

先量取

(1.00g 4.99mmol)，喹啉(250微升)，Lindlar催化剂(5％Pd/CaCO₃/Pb(oAc)₂ 500mg)溶入到25ml的甲醇溶液中，在相应量氢气的条件下氢化，直到1当量的氢气消耗完，反应停止。将反应液用硅藻土过滤，去掉催化剂，然后将溶液旋转浓缩。将浓缩后的产品用乙酸乙酯：甲醇＝1：1的极性过柱子，除掉喹啉。然后用二氯甲烷：甲醇：胺＝25:4.5:0.5的混合液洗涤粗产品。最后再蒸馏，在150-155℃下的到无色液体(0.810g80％)。

第四步：

先将

(50g 0.2mol)和环氧氯丙烷(500g 5.4mol)，TMAB(溴化四甲基铵0.31g0.002mol)放到一个四口瓶中，四口瓶分别插上温度计，真空装置、氮气罐和蠕动泵，在氮气气氛，100℃下反应3h。然后在向反应液中逐渐加入NaoH(8g 0.2mol 50wt％)，最后在60℃下反应3h。待反应完成后，将反应液过滤，去除NaCl，滤液经80℃的热去离子水洗涤三次。将洗涤后的有机相进行旋转蒸发，去除环氧氯丙烷，再在70℃，真空下干燥24h。产率为96％。

第五步：

将

(9.4g 26mmol)和(11.6g59mmol)置于60ml无水乙醇中回流3h。待反应完成后，将反应液进行旋干，得到固体。然后用正己烷/乙醚，m.p.93-95℃条件下重结晶，产率为50％。

一种用于治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，所述药物至少包含式I所示化合物或其可药用的盐。

优选地，所述药物还包含药用辅料。所述药用辅料指药学领域常规的药物载体，例如：缓释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，所述药物中还可以加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。

优选地，所述药物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

本发明另一个方面提供了式I所示化合物或其可药用的盐在制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。

本发明另一个方面提供了治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的方法，具体包括给予受试者式I所示化合物或其可药用的盐。

所述EGFR及EPS8阳性肿瘤为EGFR及EPS8为阳性的肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病或混合系白血病。

发明人通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design，CADD)技术，利用SYBYL软件对接筛选出一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子化合物，命名为EE02，发现其完全对接于EGFR近膜区及近膜区与激酶区交界的凹槽处(图2，S⁶⁷¹-R⁸⁰⁷)。因此，发明人合成了小分子抑制剂EE02，通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8高表达人肺癌细胞株A549、H460和人乳腺癌细胞株MDA-MB-468的增殖抑制活性；同时还检测了小分子抑制剂EE02对EGFR低表达或不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性，并初步获得了A549、H460、MDA-MB-468、MCF-7细胞的抑制活性结果(图4)。然后，为检测小分子抑制剂EE02对正常细胞对否具有明显毒副作用，通过分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)，利用CCK8法检测小分子抑制剂EE02对正常细胞增殖的影响，已初步获得5名健康志愿者PBMC的增殖抑制活性结果(图5)。接着通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对肺癌细胞A549、H460、H1975和乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-468、MCF-7的细胞增殖抑制72h IC50值，并已获得上述6种肿瘤细胞的72h IC50值及曲线(图6)。最后通过裸鼠皮下成瘤实验检测小分子抑制剂EE02对体内肿瘤生长的影响，并初步获得了体内抑制肿瘤细胞生长的结果(图7)。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的小分子抑制剂EE02(即式I所示化合物)能够有效抑制EGFR及EPS8阳性肿瘤的增殖，具有开发为抗肿瘤小分子靶向药的巨大潜力；

(2)本发明的小分子抑制剂EE02靶向EPS8，作用于EGFR的近膜区，特异性强、选择性好；

(3)本发明的小分子抑制剂EE02作为小分子化合物类抑制剂，相对于肽类抑制剂来讲，具有工艺制作简单、成本低、安全性高，可以粉剂、针剂、片剂等各种形式使用及保存；具有细胞通透性高、生物体内稳定性佳、生物利用度高，具有更好的临床应用性等优势。

附图说明

图1为本发明小分子抑制剂EE02的分子结构图。

图2为本发明小分子抑制剂EE02与EGFR的分子对接三维结构图(A)、构象示意图(B)及氢键形成构象图(C)。其中，黄色箭头指示部分为EGFR构象，红色箭头指示部分为本发明小分子抑制剂EE02构象，蓝色箭头指示部分为小分子抑制剂EE02与EGFR肽链上的氨基酸互相作用形成的氢键。

图3为本发明小分子抑制剂EE02的氢谱图。

图4为本发明实施例2中小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8同时高表达的肺癌细胞株A549、H460、乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EPS8高表达但EGFR低/不表达的乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖抑制活性柱状图。

图5为本发明实施例3中小分子抑制剂EE02对健康志愿者PBMC细胞增殖抑制活性柱状图。

图6为本发明实施例4中小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8同时高表达的肺癌细胞株A549、H460、H1975、乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468和EPS8高表达但EGFR低/不表达的乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖抑制活性72hIC50曲线图。

图7为本发明实施例5中小分子抑制剂EE02抑制裸鼠体内肿瘤生长的结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。这些实施例只是为了说明目的，而不是用来限制本发明的范围。本发明中使用实验方法、试剂等为现有技术，在此不再一一赘述。

实施例1小分子抑制剂EE02的合成

通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design，CADD)技术，利用SYBYL软件虚拟对接筛选出一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂，命名为EE02。所述小分子抑制剂EE02的分子式为：C₄₄H₅₄N₄O₆S，分子量为：767，英文名为：1-{4-[4-(2-hydroxy-3-{4-[(2Z)-3-phenylprop-2-en-1-yl]piperazin-1-yl}propoxy)benzenesulfonyl]phenoxy}-3-{4-[(2Z)-3-phenylprop-2-en-1-yl]piperazin-1-yl}propan-2-ol，分子结构式如图1所示。通过构象分析发现，EE02完全对接于EGFR近膜区及近膜区与激酶区交界的凹槽处，并与EGFR肽链的第671位Ser、676位Asn和第807位Arg各生成1个氢键，共3个氢键(图2，R⁶⁶²-R⁸⁰⁷)，符合文献报的EPS8与EGFR近膜区的结合是不依赖磷酸酪氨酸残基和SH2区域，而是一种物理的直接结合，可能与氢键形成及静电相互作用有关。(Paola Castagnino，Directbinding of eps8 to the juxtamembrane domain of EGFR isphosphotyrosine-andSH2-independent.Oncogene，1995,10,723-729；Fazioli Fet al.Eps8,a substrate forthe epidermal growth factor receptor kinase,enhancesEGF-dependent mitogenicsignals.EMBO J,1993,12(10):3799-3808.)。

因此，将小分子抑制剂EE02委托美国TargetMol公司合成，合成步骤如下：

第一步：

先称量

(1.68g,30mmol)和三乙胺(4.55g,45mmol)，溶入到40ml的二氯甲烷中，再缓慢加入MsCl(4.47g,39mmol)，于0℃下搅拌2h。待反应完成后加入HCl(2M)后进行萃取,再用碳酸氢钠洗，再用NaCl洗，再用MgS0₄干燥，最后旋干溶剂得到目标产物(Yield：98％)。

第二步：

先称取1.96g

(10.0mmol)和Cs₂CO₃(4.88g,15.0mmol)in abs DMF(60mL)，然后再缓慢加入哌嗪(1.72g 20.0mmol)，然后在100℃下反应2d。待反应后将反应液旋干，用乙酸乙酯(120ml)溶解，然后再过滤除掉沉淀，再旋干溶剂得到油状液体。最后再通过硅胶柱层析法提纯目标产物，产率为94％。

第三步：

先量取

(1.00g 4.99mmol)，喹啉(250微升)，Lindlar催化剂(5％Pd/CaCO₃/Pb(oAc)₂ 500mg)溶入到25ml的甲醇溶液中，在相应量氢气的条件下氢化，直到1当量的氢气消耗完，反应停止。将反应液用硅藻土过滤，去掉催化剂，然后将溶液旋转浓缩。将浓缩后的产品用乙酸乙酯：甲醇＝1：1的极性过柱子，除掉喹啉。然后用二氯甲烷：甲醇：胺＝25:4.5:0.5的混合液洗涤粗产品。最后再蒸馏，在150-155℃下的到无色液体(0.810g80％)。

第四步：

先将(50g 0.2mol)和环氧氯丙烷(500g 5.4mol)，TMAB(溴化四甲基铵0.31g 0.002mol)放到一个四口瓶中，四口瓶分别插上温度计，真空装置、氮气罐和蠕动泵，在氮气气氛，100℃下反应3h。然后在向反应液中逐渐加入NaoH(8g 0.2mol 50wt％)，最后在60℃下反应3h。待反应完成后，将反应液过滤，去除NaCl，滤液经80℃的热去离子水洗涤三次。将洗涤后的有机相进行旋转蒸发，去除环氧氯丙烷，再在70℃，真空下干燥24h。产率为96％。

第五步：

将

(9.4g 26mmol)和

(11.6g59mmol)置于60ml无水乙醇中回流3h。待反应完成后，将反应液进行旋干，得到固体。然后用正己烷/乙醚，m.p.93-95℃条件下重结晶，产率为50％。

采用氢谱核磁共振(H-NMR)法对小分子抑制剂EE02进行鉴定和分子量测定(编码0884-0022)。氢谱见图3，通过质谱检测分子量为767，与理论值相符，纯度＞99.9％。

所得小分子抑制剂用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成储备液，置温度-80℃保存，使用前用完全培养基稀释。

实施例2小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、人乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性。

选择EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、人乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7(细胞株均购自美国菌种保藏中心ATCC)。取对数生长期细胞，以5000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基；过夜贴壁后，加入终浓度分别为0、1、2.5、5.0、7.5、10μmol/L的小分子抑制剂EE02，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。

抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD_实验组-OD_空白组)]/[(OD_阴性组-OD_空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对A549、H460、MDA-MB-468、MCF-7各细胞增殖的抑制活性数据见图4。

由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在EGFR及EPS8同时高表达的的肿瘤细胞A549、H460和MDA-MB-468中表现出较好的细胞增殖抑制活性，且随着药物浓度的增高抑制作用明显增强，在10μmol/L浓度时，其对A549、H460、MDA-MB-468细胞的抑制率分别为89.22％、96.76％和97.11％。而对于EGFR低/不表达、EPS8高表达的细胞株MCF-7则表现出较差的细胞抑制活性，在10μmol/L浓度时，其对MCF-7细胞的抑制率仅为62.75％。说明小分子抑制剂EE02针对EGFR及EPS8双阳的肿瘤细胞具有很好的细胞增殖抑制作用，而非双阳的细胞的抑制活性则相对较差，靶向性较高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。

实施例3小分子抑制剂EE02对健康志愿者外周血单个核细胞增殖抑制活性

采集5名健康志愿者外周血，利用Ficol密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用培养基重悬后，计数，铺板。将细胞以20000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的RMPI-1640完全培养基；过夜后，加入终浓度分别为加入终浓度分别为0、1、2.5、5.0、7.5、10μmol/L的小分子抑制剂EE02，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。

抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD_实验组-OD_空白组)]/[(OD_阴性组-OD_空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对5名健康志愿者PBMC的各细胞增殖的抑制活性数据见图5。

由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在低浓度时对健康志愿者PBMC无明显的细胞抑制活性，随着药物浓度的增加，则表现出极低的细胞抑制活性，当药物浓度达到10μmol/L浓度时，其对上述5名健康志愿者PBMC细胞的抑制率仅为19.00％～29.53％，其抑制率明显低于肿瘤细胞株，仅为肿瘤细胞H460的1/5～1/4。说明小分子抑制剂EE02对正产细胞毒副作用小，安全性高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。

实施例4小分子抑制剂EE02作用人肺癌细胞株A549、H460、H1975及乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468、MCF-7的72h IC50值

选择EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、H1975、人乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7(细胞株均购自美国菌种保藏中心ATCC)。取对数生长期细胞，以5000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基；过夜贴壁后，加入终浓度分别为A549：0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μmol/L；H460：0、1、1.15、1.3、1.45、1.6、1.75、1.9、2.05μmol/L；H1975：0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5μmol/L；BT549：0、1、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75μmol/L；MDA-MB-468：0、1、1.15、1.3、1.45、1.6、1.75、1.9、2.05μmol/L；MCF-7：2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5μmol/L，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养72h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。

抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD_实验组-OD_空白组)]/[(OD_阴性组-OD_空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对A549、H460、H1975、BT549、MDA-MB-468、MCF-7各细胞增殖抑制的72hIC50值分别为：3.70±0.24、1.79±0.05、4.95±0.15、3.02±0.13、1.85±0.04和4.54±0.42μmol/L(图6)。

由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在EGFR及EPS8同时高表达的的肿瘤细胞A549、H460、H1975、BT549和MDA-MB-468中表现出明显的细胞抑制活性，其72h IC50值介于1.79～4.95μmol/L之间，而EGFR低/不表达、EPS8高表达细胞株MCF-7的72h IC50是上述细胞株H460、MDA-MB-468的2倍。该结果进一步验证了实施例2中所得出的结果，说明小分子抑制剂EE02针对EGFR及EPS8双阳的肿瘤细胞具有很好的细胞增殖抑制作用，而非双阳的细胞则表现出较差的抑制活性，靶向性较高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。

实施例5小分子抑制剂EE02对裸鼠皮下肿瘤生长的影响

购买4-5周龄的SPF级BALB/C雄性裸鼠分笼饲养(SPF级、自然光照、动物房内温度23±2℃、相对湿度40％～60％)，饲料、饮用水及垫料均高压灭菌处理。饲养1周后，随机分成4组，分别为阴性对照组(DMSO)、实验组1(EE02：5mg/kg)、实验组2(EE02：10mg/kg)和阳性对照组(厄洛替尼：10mg/kg)，每组6只。取对数生长期的H460细胞，胰酶消化制备成单细胞悬液，无血清培养基洗涤3遍，细胞计数后用无血清高糖DMEM培养调整细胞密度为2.5×10⁷个/ml；在裸鼠皮下注射接种，每只裸鼠注射200μl细胞悬液，即5×10⁶个/只；隔天开始小鼠称重并用游标卡尺测量肿瘤体积，隔天测量一次；可触及明显肿瘤包块时予以腹腔给药(约皮下种瘤后1周)，连续给药20天后，脱颈处死裸鼠，分离肿瘤组织，测量体积大小。

肿瘤体积V＝(长×宽²)/2。给药后第20天，阴性对照组(DMSO)、实验组1(EE02：5mg/kg)、实验组2(EE02：10mg/kg)和阳性对照组(Erlotinib：10mg/kg)的肿瘤体积分别为：(764.52±164.46)mm³、(488.05±61.83)mm³、(273.68±89.35)mm³和(217.75±61.63)mm³。通过单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异显著，差异具有统计学意义(F＝34.626，P＜0.001)；方差齐性，采用LSD进行多重比较，结果显示：实验组1、2及阳性对照组的肿瘤体积均较阴性对照组明显减小(P均＜0.05)，实验组2和阳性对照组肿瘤体积较实验组1明显减小(P均＜0.05)，实验组2肿瘤体积与阳性对照组相比较，差异不显著，无统计学意义(P＞0.0.5)。

由上述结果可知，小分子抑制剂EE02能够在体内有效抑制肿瘤细胞的生长和增殖，且随着剂量的增加，其抑瘤作用也明显增强；与目前临床上使用的EGFR激酶区靶向药物厄洛替尼相比较，剂量相同时，其抑瘤作用相当，差异无统计学意义，表明小分子抑制剂EE02具有研发为临床用药的巨大前景，为后续临床试验奠定基础，为临床治疗提供新的思路与方法。

基于上述实验结果，可得出以下结论：本申请虚拟筛选并设计合成的靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02，通过CCK8法检测小分子抑制剂对EGFR及EPS8同时高表达人肺癌细胞株A549、H460、H1975、人乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468，72h IC₅₀值分别为：3.70±0.24、1.79±0.05、4.95±0.15、3.02±0.13和1.85±0.04；而对EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的72h IC₅₀则是上述细胞H460、MDA-MB-468的2倍。此外，通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对健康者PBMC的细胞增殖抑制活性，发现其在低浓度时对健康者PBMC无细胞增殖抑制作用，高度浓度时表现出极低的细胞增殖抑制作用。动物体内实验也表明，小分子抑制剂EE02具有良好的抑瘤作用。综上，小分子抑制剂EE02具有靶向性、安全性高，毒副作用小等优点，具备较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤疾病的前景。本申请靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，通过阻断体内EPS8与其受体相互作用，在治疗与体内EGFR及EPS8阳性肿瘤疾病方面的应用前景鼓舞人心，具有开发为抗肿瘤小分子靶向抑制剂药物的巨大潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干结构优化和改造，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种用于制备由下式I表示的靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂化合物的方法，

其特征在于，包括如下步骤：

第一步：

将

与MsCl反应得到

第二步：

将

与哌嗪反应得到

第三步：

将

在Lindlar催化剂Pd/CaCO₃/Pb(oAc)₂的条件下进行氢化得到

第四步：

将

与环氧氯丙烷反应得到

第五步：

将

与反应即得式I所示化合物。

2.根据权利要求1所述的小分子抑制剂化合物的制备方法，其特征在于，所述小分子抑制剂EE02阻断体内EPS8与其受体EGFR的相互作用。

3.一种用于治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1中式I所示的小分子抑制剂化合物。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药用辅料。

5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

6.权利要求1中式I所示的小分子抑制剂化合物在制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述EGFR及EPS8阳性肿瘤为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病或混合系白血病。

8.一种权利要求1中式I所示的化合物在制备靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂的用途。

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