CN108456184A - 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用 - Google Patents

一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108456184A
CN108456184A CN201810266663.6A CN201810266663A CN108456184A CN 108456184 A CN108456184 A CN 108456184A CN 201810266663 A CN201810266663 A CN 201810266663A CN 108456184 A CN108456184 A CN 108456184A
Authority
CN
China
Prior art keywords
eps8
egfr
drug
cell
micromolecular inhibitor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810266663.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108456184B (zh
Inventor
李玉华
李梅芳
贺艳杰
胡宇行
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201810266663.6A priority Critical patent/CN108456184B/zh
Publication of CN108456184A publication Critical patent/CN108456184A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108456184B publication Critical patent/CN108456184B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用，所述小分子抑制剂的分子式为：C44H54N4O6S，分子量为：767，中文名为：1‑{4‑[4‑(2‑羟基‑3‑{4‑[(2Z)‑3‑苯丙‑2‑烯‑1‑基]哌嗪‑1‑基}丙氧基)苯磺酰]苯氧基}‑3‑{4‑[(2Z)‑3‑苯丙‑2‑烯‑1‑基]哌嗪‑1‑基}‑2‑丙醇。所述小分子抑制剂能够有效抑制EGFR及EPS8阳性肿瘤的增殖，能够用于制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，具有开发为抗肿瘤小分子靶向药物的巨大潜力。

Description

一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是一类具有蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性的跨膜糖蛋白受体超家族，包括胞外区、跨膜区和胞内区(分为近膜区、激酶区、C末端等3个亚区)，以胞外区为配体结合部位，而激酶区为其主要的功能区[1,2]。EGFR在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞中过表达，并与肿瘤的发生发展密切相关[3,4,5]。
表皮生长因子受体通路底物8(Epidermal Growth Factor Receptor pathwaysubstrate No.8,EPS8)是EGFR重要的激酶活性底物之一。EPS8最初在鼠科纤维母细胞NIH3T3中被发现，其蛋白全长由822个氨基酸组成，其结构主要包含氨基端的磷酸酪氨酸结合蛋白域(phosphotyrosine binding protein,PTB)，中间的EGFR结合域和Src同源结构域3(Src homology 3,SH3)，以及羧基端的多功能结构域[6]。EGFR结合区为EPS8与EGFR近膜区相结合的部位，其上的特异性核定位序列(NLS)在EPS8活化释放后发挥定位作用，介导EPS8定位到细胞核，促进有丝分裂信号的产生[7]。
EPS8在人体组织中分布广泛，在多种肿瘤细胞中异常表达，与肿瘤的增殖、迁移、耐药以及预后密切相关，是抗肿瘤药物的新靶点[8]。EPS8与EGFR近膜区结合并磷酸化，从而激活一系列EGFR下游信号分子[7,9]。(1)EPS8通过EPS8/Ras/ERK、EPS8/PI3K/AKT等信号通路促进肿瘤细胞增殖。Maa等、Xu等和Ding等研究证实EPS8/Ras/ERK信号通路的存在，EPS8通过激活ERK通路促进细胞增殖以及恶性转变[10]。Wang等和Liu等则分别推测出EPS8通过激活PI3K/AKT下游的EPS8/AKT/FOXM1和EPS8/AKT/mTOR/STAT3信号通路，在多种肿瘤细胞增殖中发挥重要作用[11]。(2)EPS8通过Ras-Rac、EPS8/IRSp53/Cdc42、EPS8/AKT/MMP9等信号通路促进肿瘤细胞迁移[12]。EPS8通过形成EPS8-Abi1-Sos1三聚体传递EGF介导的从Ras-Rac信号传递。EPS8通过肌动蛋白的加帽和捆绑的双重功能，参与板状伪足和丝状伪足的形成，并通过EPS8/IRSp53/Cdc42信号通路介导肿瘤细胞迁[13]。EPS8通过EPS8/AKT/MMP-9途径，介导细胞外基质降解以及生长因子的加工，介导细胞外基质重构从而促进肿瘤细胞的迁移。(3)EPS8通过EPS8/AKT/MDM2信号通路促进肿瘤细胞耐药。Chen等发现，沉默EPS8能够增强宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞对顺铂的敏感性，并提升紫杉醇对这两种细胞的杀伤效率[14]；Yang等和Gorsic等研究证实，EPS8抑制剂(光神霉素A)能够降低多种肿瘤细胞中EPS8表达水平，并且与顺铂联用对肺癌细胞具有协同杀伤作用[15]。Maa等研究表明，EPS8上调会导致AKT的大量磷酸化，推测EPS8可能通过激活PI3K/AKT通路降低p53的含量[16]。进一步Tazzari等报道，渥曼青霉素(一种PI3K抑制剂)通过抑制PI3K/AKT通路降低MDM2(Murine Double Minute 2)的活性，上调p53蛋白水平，进而抑制多药耐药相关蛋白1(Multidrug Resistant Protein 1，MRP1)的表达，从而增强AML细胞对药物的敏感性[17]。
以上研究结果提示EPS8是肿瘤增殖、迁移及耐药的重要靶点。然而，目前国内外市场上以EGFR近膜区为靶点，特异性阻断EPS8与EGFR的结合的小分子抑制剂仍空缺。靶向作用于EGFR近膜区的抑制剂特异性强、选择性好，这为研制恶性肿瘤疾病提供新的药物治疗靶向。小分子抑制剂工艺制作简单、成本低、安全性高，可以粉剂、针剂、片剂等各种形式使用及保存；小分子抑制剂的细胞通透性高、生物体内稳定性佳、生物利用度高，具有更好的临床应用性，成为近年来肿瘤靶向治疗研究热点。
参考文献：
[1].Abd Halim,K.B.,H.and M.S.P.Sansom,Interactions of the EGFRjuxtamembrane domain with PIP2-containing lipid bilayers:Insights frommultiscale molecular dynamics simulations.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2015.1850(5):p.1017-1025.
[2].Boran,A.D.W.,The regulatory role of the juxtamembrane region inthe activity of the epidermal growth factor receptor.Biochemical SocietyTransactions,2012.40(1):p.195-199.
[3].Tynan,C.J.,et al.,A tale of the epidermal growth factor receptor:The quest for structural resolution on cells.Methods,2015.
[4].Aislyn D.W.Boran,J.S.V.J.,A Potential Peptide Therapeutic Derivedfrom the Juxtamembrane Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor.PLOSONE,2012.11(7).
[5].He,L.and K.Hristova,Consequences of replacing EGFR juxtamembranedomain with an unstructured sequence.Scientific Reports,2012.2.
[6].Di Fiore,P.P.and G.Scita,Eps8 in the midst of GTPases.Int JBiochem Cell Biol,2002.34(10):p.1178-83.
[7].Castagnino,P.,et al.,Direct binding of eps8 to the juxtamembranedomain of EGFR is phosphotyrosine-and SH2-independent.Oncogene,1995.10(4):p.723-9.
[8].Xu,M.,et al.,Epidermal Growth Factor Receptor Pathway Substrate 8Is Overexpressed in Human Pituitary Tumors:Role in Proliferation andSurvival.Endocrinology,2009.150(5):p.2064-2071.
[9].Fazioli,F.,et al.,Eps8,a substrate for the epidermal growthfactor receptor kinase,enhances EGF-dependent mitogenic signals.EMBO J,1993.12(10):p.3799-808.
[10].Maa MC,Hsieh CY,Leu TH.Overexpression of p97Eps8 leads tocellular transformation:implication of pleckstrin homology domain in p97Eps8-mediated ERK activation.Oncogene.2001 Jan 4；20(1):106-12.
[11].Wang,H.,et al.,EPS8 upregulates FOXM1 expression,enhancing cellgrowth and motility.Carcinogenesis,2010.31(6):p.1132-1141.
[12].Giorgio Scita,J.N.R.C.,EPS8 and E3B1 transduce signals from Rasto Rac.Letters to Nature,1999:p.290-293.
[13].Disanza,A.,et al.,Regulation of cell shape by Cdc42 is mediatedby the synergic actin-bundling activity of the Eps8–IRSp53 complex.NatureCell Biology,2006.8(12):p.1337-1347.
[14].Chen,Y.J.,et al.,Eps8 decreases chemosensitivity and affectssurvival of cervical cancer patients.Molecular Cancer Therapeutics,2008.7(6):p.1376-1385.
[15].Yang,T.,et al.,Mithramycin inhibits human epithelial carcinomacell proliferation and migration involving downregulation of Eps8expression.Chemico-Biological Interactions,2010.183(1):p.181-186.
[16].Chen,Y.J.,et al.,Eps8 decreases chemosensitivity and affectssurvival of cervical cancer patients.Molecular Cancer Therapeutics,2008.7(6):p.1376-1385.
[17].PL Tazzari,A.C.F.R.,Multidrug resistance-associated protein 1expression is under the control of the phosphoinositide 3kinase/Akt signaltransduction network in human acute myelogenous leukemia blasts.NaturePublishing Group,2007(21):p.427-438.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂，分子式为：C44H54N4O6S，分子量为：767，中文名为：1-{4-[4-(2-羟基-3-{4-[(2Z)-3-苯丙-2-烯-1-基]哌嗪-1-基}丙氧基)苯磺酰]苯氧基}-3-{4-[(2Z)-3-苯丙-2-烯-1-基]哌嗪-1-基}-2-丙醇，分子结构式如式I所示：
所述小分子抑制剂EE02阻断体内EPS8与其受体EGFR的相互作用。
本发明一个方面提供了一种靶向EGFR与EPS8结合的化合物或其可药用的盐，其具有如式I所示的结构式。
本发明另一个方面提供了式I所示化合物的制备方法，其包括如下步骤：
第一步：
先称量(1.68g,30mmol)和三乙胺(4.55g,45mmol)，溶入到40ml的二氯甲烷中，再缓慢加入MsCl(4.47g,39mmol)，于0℃下搅拌2h。待反应完成后加入HCl(2M)后进行萃取,再用碳酸氢钠洗，再用NaCl洗，再用MgS04干燥，最后旋干溶剂得到目标产物(Yield：98％)。
第二步：
先称取1.96g(10.0mmol)和Cs2CO3(4.88g,15.0mmol)in abs DMF(60mL)，然后再缓慢加入哌嗪(1.72g 20.0mmol)，然后在100℃下反应2d。待反应后将反应液旋干，用乙酸乙酯(120ml)溶解，然后再过滤除掉沉淀，再旋干溶剂得到油状液体。最后再通过硅胶柱层析法提纯目标产物，产率为94％。
第三步：
先量取(1.00g 4.99mmol)，喹啉(250微升)，Lindlar催化剂(5％Pd/CaCO3/Pb(oAc)2 500mg)溶入到25ml的甲醇溶液中，在相应量氢气的条件下氢化，直到1当量的氢气消耗完，反应停止。将反应液用硅藻土过滤，去掉催化剂，然后将溶液旋转浓缩。将浓缩后的产品用乙酸乙酯：甲醇＝1：1的极性过柱子，除掉喹啉。然后用二氯甲烷：甲醇：胺＝25:4.5:0.5的混合液洗涤粗产品。最后再蒸馏，在150-155℃下的到无色液体(0.810g80％)。
第四步：
先将(50g 0.2mol)和环氧氯丙烷(500g 5.4mol)，TMAB(溴化四甲基铵0.31g 0.002mol)放到一个四口瓶中，四口瓶分别插上温度计，真空装置、氮气罐和蠕动泵，在氮气气氛，100℃下反应3h。然后在向反应液中逐渐加入NaoH(8g0.2mol 50wt％)，最后在60℃下反应3h。待反应完成后，将反应液过滤，去除NaCl，滤液经80℃的热去离子水洗涤三次。将洗涤后的有机相进行旋转蒸发，去除环氧氯丙烷，再在70℃，真空下干燥24h。产率为96％。
第五步：
将(9.4g 26mmol)和(11.6g 59mmol)置于60ml无水乙醇中回流3h。待反应完成后，将反应液进行旋干，得到固体。然后用正己烷/乙醚，m.p.93-95℃条件下重结晶，产率为50％。
一种用于治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，所述药物至少包含式I所示化合物或其可药用的盐。
优选地，所述药物还包含药用辅料。所述药用辅料指药学领域常规的药物载体，例如：缓释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，所述药物中还可以加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。
优选地，所述药物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
本发明另一个方面提供了式I所示化合物或其可药用的盐在制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。
本发明另一个方面提供了治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的方法，具体包括给予受试者式I所示化合物或其可药用的盐。
所述EGFR及EPS8阳性肿瘤为EGFR及EPS8为阳性的肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病或混合系白血病。
发明人通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design，CADD)技术，利用SYBYL软件对接筛选出一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子化合物，命名为EE02，发现其完全对接于EGFR近膜区及近膜区与激酶区交界的凹槽处(图2，S671-R807)。因此，发明人合成了小分子抑制剂EE02，通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8高表达人肺癌细胞株A549、H460和人乳腺癌细胞株MDA-MB-468的增殖抑制活性；同时还检测了小分子抑制剂EE02对EGFR低表达或不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性，并初步获得了A549、H460、MDA-MB-468、MCF-7细胞的抑制活性结果(图4)。然后，为检测小分子抑制剂EE02对正常细胞对否具有明显毒副作用，通过分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)，利用CCK8法检测小分子抑制剂EE02对正常细胞增殖的影响，已初步获得5名健康志愿者PBMC的增殖抑制活性结果(图5)。接着通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对肺癌细胞A549、H460、H1975和乳腺癌细胞BT549、MDA-MB-468、MCF-7的细胞增殖抑制72h IC50值，并已获得上述6种肿瘤细胞的72h IC50值及曲线(图6)。最后通过裸鼠皮下成瘤实验检测小分子抑制剂EE02对体内肿瘤生长的影响，并初步获得了体内抑制肿瘤细胞生长的结果(图7)。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的小分子抑制剂EE02(即式I所示化合物)能够有效抑制EGFR及EPS8阳性肿瘤的增殖，具有开发为抗肿瘤小分子靶向药的巨大潜力；
(2)本发明的小分子抑制剂EE02靶向EPS8，作用于EGFR的近膜区，特异性强、选择性好；
(3)本发明的小分子抑制剂EE02作为小分子化合物类抑制剂，相对于肽类抑制剂来讲，具有工艺制作简单、成本低、安全性高，可以粉剂、针剂、片剂等各种形式使用及保存；具有细胞通透性高、生物体内稳定性佳、生物利用度高，具有更好的临床应用性等优势。
附图说明
图1为本发明小分子抑制剂EE02的分子结构图。
图2为本发明小分子抑制剂EE02与EGFR的分子对接三维结构图(A)、构象示意图(B)及氢键形成构象图(C)。其中，黄色箭头指示部分为EGFR构象，红色箭头指示部分为本发明小分子抑制剂EE02构象，蓝色箭头指示部分为小分子抑制剂EE02与EGFR肽链上的氨基酸互相作用形成的氢键。
图3为本发明小分子抑制剂EE02的氢谱图。
图4为本发明实施例2中小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8同时高表达的肺癌细胞株A549、H460、乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EPS8高表达但EGFR低/不表达的乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖抑制活性柱状图。
图5为本发明实施例3中小分子抑制剂EE02对健康志愿者PBMC细胞增殖抑制活性柱状图。
图6为本发明实施例4中小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8同时高表达的肺癌细胞株A549、H460、H1975、乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468和EPS8高表达但EGFR低/不表达的乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖抑制活性72h IC50曲线图。
图7为本发明实施例5中小分子抑制剂EE02抑制裸鼠体内肿瘤生长的结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。这些实施例只是为了说明目的，而不是用来限制本发明的范围。本发明中使用实验方法、试剂等为现有技术，在此不再一一赘述。
实施例1小分子抑制剂EE02的合成
通过计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design，CADD)技术，利用SYBYL软件虚拟对接筛选出一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂，命名为EE02。所述小分子抑制剂EE02的分子式为：C44H54N4O6S，分子量为：767，英文名为：1-{4-[4-(2-hydroxy-3-{4-[(2Z)-3-phenylprop-2-en-1-yl]piperazin-1-yl}propoxy)benzenesulfo nyl]phenoxy}-3-{4-[(2Z)-3-phenylprop-2-en-1-yl]piperazin-1-yl}propan-2-ol，分子结构式如图1所示。通过构象分析发现，EE02完全对接于EGFR近膜区及近膜区与激酶区交界的凹槽处，并与EGFR肽链的第671位Ser、676位Asn和第807位Arg各生成1个氢键，共3个氢键(图2，R662-R807)，符合文献报的EPS8与EGFR近膜区的结合是不依赖磷酸酪氨酸残基和SH2区域，而是一种物理的直接结合，可能与氢键形成及静电相互作用有关。(Paola Castagnino，Direct binding of eps8to the juxtamembrane domain of EGFR isphosphotyrosine-and SH2-independent.Oncogene，1995,10,723-729；Fazioli Fet al.Eps8,a substratefor the epidermal growth factor receptor kinase,enhancesEGF-dependentmitogenic signals.EMBO J,1993,12(10):3799-3808.)。
因此，将小分子抑制剂EE02委托美国TargetMol公司合成，合成步骤如下：
第一步：
先称量(1.68g,30mmol)和三乙胺(4.55g,45mmol)，溶入到40ml的二氯甲烷中，再缓慢加入MsCl(4.47g,39mmol)，于0℃下搅拌2h。待反应完成后加入HCl(2M)后进行萃取,再用碳酸氢钠洗，再用NaCl洗，再用MgS04干燥，最后旋干溶剂得到目标产物(Yield：98％)。
第二步：
先称取1.96g(10.0mmol)和Cs2CO3(4.88g,15.0mmol)in abs DMF(60mL)，然后再缓慢加入哌嗪(1.72g 20.0mmol)，然后在100℃下反应2d。待反应后将反应液旋干，用乙酸乙酯(120ml)溶解，然后再过滤除掉沉淀，再旋干溶剂得到油状液体。最后再通过硅胶柱层析法提纯目标产物，产率为94％。
第三步：
先量取(1.00g 4.99mmol)，喹啉(250微升)，Lindlar催化剂(5％Pd/CaCO3/Pb(oAc)2 500mg)溶入到25ml的甲醇溶液中，在相应量氢气的条件下氢化，直到1当量的氢气消耗完，反应停止。将反应液用硅藻土过滤，去掉催化剂，然后将溶液旋转浓缩。将浓缩后的产品用乙酸乙酯：甲醇＝1：1的极性过柱子，除掉喹啉。然后用二氯甲烷：甲醇：胺＝25:4.5:0.5的混合液洗涤粗产品。最后再蒸馏，在150-155℃下的到无色液体(0.810g80％)。
第四步：
先将(50g 0.2mol)和环氧氯丙烷(500g 5.4mol)，TMAB(溴化四甲基铵0.31g 0.002mol)放到一个四口瓶中，四口瓶分别插上温度计，真空装置、氮气罐和蠕动泵，在氮气气氛，100℃下反应3h。然后在向反应液中逐渐加入NaoH(8g 0.2mol 50wt％)，最后在60℃下反应3h。待反应完成后，将反应液过滤，去除NaCl，滤液经80℃的热去离子水洗涤三次。将洗涤后的有机相进行旋转蒸发，去除环氧氯丙烷，再在70℃，真空下干燥24h。产率为96％。
第五步：
将(9.4g 26mmol)和(11.6g 59mmol)置于60ml无水乙醇中回流3h。待反应完成后，将反应液进行旋干，得到固体。然后用正己烷/乙醚，m.p.93-95℃条件下重结晶，产率为50％。
采用氢谱核磁共振(H-NMR)法对小分子抑制剂EE02进行鉴定和分子量测定(编码0884-0022)。氢谱见图3，通过质谱检测分子量为767，与理论值相符，纯度＞99.9％。
所得小分子抑制剂用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成储备液，置温度-80℃保存，使用前用完全培养基稀释。
实施例2小分子抑制剂EE02对EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、人乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的增殖抑制活性。
选择EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、人乳腺癌细胞株MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7(细胞株均购自美国菌种保藏中心ATCC)。取对数生长期细胞，以5000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基；过夜贴壁后，加入终浓度分别为0、1、2.5、5.0、7.5、10μmol/L的小分子抑制剂EE02，置于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。
抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD实验组-OD空白组)]/[(OD阴性组-OD空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对A549、H460、MDA-MB-468、MCF-7各细胞增殖的抑制活性数据见图4。
由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在EGFR及EPS8同时高表达的的肿瘤细胞A549、H460和MDA-MB-468中表现出较好的细胞增殖抑制活性，且随着药物浓度的增高抑制作用明显增强，在10μmol/L浓度时，其对A549、H460、MDA-MB-468细胞的抑制率分别为89.22％、96.76％和97.11％。而对于EGFR低/不表达、EPS8高表达的细胞株MCF-7则表现出较差的细胞抑制活性，在10μmol/L浓度时，其对MCF-7细胞的抑制率仅为62.75％。说明小分子抑制剂EE02针对EGFR及EPS8双阳的肿瘤细胞具有很好的细胞增殖抑制作用，而非双阳的细胞的抑制活性则相对较差，靶向性较高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
实施例3小分子抑制剂EE02对健康志愿者外周血单个核细胞增殖抑制活性
采集5名健康志愿者外周血，利用Ficol密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，用培养基重悬后，计数，铺板。将细胞以20000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的RMPI-1640完全培养基；过夜后，加入终浓度分别为加入终浓度分别为0、1、2.5、5.0、7.5、10μmol/L的小分子抑制剂EE02，置于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。
抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD实验组-OD空白组)]/[(OD阴性组-OD空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对5名健康志愿者PBMC的各细胞增殖的抑制活性数据见图5。
由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在低浓度时对健康志愿者PBMC无明显的细胞抑制活性，随着药物浓度的增加，则表现出极低的细胞抑制活性，当药物浓度达到10μmol/L浓度时，其对上述5名健康志愿者PBMC细胞的抑制率仅为19.00％～29.53％，其抑制率明显低于肿瘤细胞株，仅为肿瘤细胞H460的1/5～1/4。说明小分子抑制剂EE02对正产细胞毒副作用小，安全性高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
实施例4小分子抑制剂EE02作用人肺癌细胞株A549、H460、H1975及乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468、MCF-7的72h IC50值
选择EGFR及EPS8高表达的人肺癌细胞株A549、H460、H1975、人乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468和EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7(细胞株均购自美国菌种保藏中心ATCC)。取对数生长期细胞，以5000个/孔接种在96孔培养板内，每孔90μL，培养基用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基；过夜贴壁后，加入终浓度分别为A549：0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μmol/L；H460：0、1、1.15、1.3、1.45、1.6、1.75、1.9、2.05μmol/L；H1975：0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5μmol/L；BT549：0、1、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75μmol/L；MDA-MB-468：0、1、1.15、1.3、1.45、1.6、1.75、1.9、2.05μmol/L；MCF-7：2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5μmol/L，置于37℃、5％CO2孵箱中培养72h后，每孔加入10μl cck8试剂，反应3h，于450nm波长处测OD值，计算抑制率。
抑制率计算公式：细胞存活率＝[(OD实验组-OD空白组)]/[(OD阴性组-OD空白组)]×100％。小分子抑制剂EE02对A549、H460、H1975、BT549、MDA-MB-468、MCF-7各细胞增殖抑制的72hIC50值分别为：3.70±0.24、1.79±0.05、4.95±0.15、3.02±0.13、1.85±0.04和4.54±0.42μmol/L(图6)。
由上述结果可知，小分子抑制剂EE02在EGFR及EPS8同时高表达的的肿瘤细胞A549、H460、H1975、BT549和MDA-MB-468中表现出明显的细胞抑制活性，其72h IC50值介于1.79～4.95μmol/L之间，而EGFR低/不表达、EPS8高表达细胞株MCF-7的72h IC50是上述细胞株H460、MDA-MB-468的2倍。该结果进一步验证了实施例2中所得出的结果，说明小分子抑制剂EE02针对EGFR及EPS8双阳的肿瘤细胞具有很好的细胞增殖抑制作用，而非双阳的细胞则表现出较差的抑制活性，靶向性较高，具有较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物的前景。
实施例5小分子抑制剂EE02对裸鼠皮下肿瘤生长的影响
购买4-5周龄的SPF级BALB/C雄性裸鼠分笼饲养(SPF级、自然光照、动物房内温度23±2℃、相对湿度40％～60％)，饲料、饮用水及垫料均高压灭菌处理。饲养1周后，随机分成4组，分别为阴性对照组(DMSO)、实验组1(EE02：5mg/kg)、实验组2(EE02：10mg/kg)和阳性对照组(厄洛替尼：10mg/kg)，每组6只。取对数生长期的H460细胞，胰酶消化制备成单细胞悬液，无血清培养基洗涤3遍，细胞计数后用无血清高糖DMEM培养调整细胞密度为2.5×107个/ml；在裸鼠皮下注射接种，每只裸鼠注射200μl细胞悬液，即5×106个/只；隔天开始小鼠称重并用游标卡尺测量肿瘤体积，隔天测量一次；可触及明显肿瘤包块时予以腹腔给药(约皮下种瘤后1周)，连续给药20天后，脱颈处死裸鼠，分离肿瘤组织，测量体积大小。
肿瘤体积V＝(长×宽2)/2。给药后第20天，阴性对照组(DMSO)、实验组1(EE02：5mg/kg)、实验组2(EE02：10mg/kg)和阳性对照组(Erlotinib：10mg/kg)的肿瘤体积分别为：(764.52±164.46)mm3、(488.05±61.83)mm3、(273.68±89.35)mm3和(217.75±61.63)mm3。通过单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间差异显著，差异具有统计学意义(F＝34.626，P＜0.001)；方差齐性，采用LSD进行多重比较，结果显示：实验组1、2及阳性对照组的肿瘤体积均较阴性对照组明显减小(P均＜0.05)，实验组2和阳性对照组肿瘤体积较实验组1明显减小(P均＜0.05)，实验组2肿瘤体积与阳性对照组相比较，差异不显著，无统计学意义(P＞0.0.5)。
由上述结果可知，小分子抑制剂EE02能够在体内有效抑制肿瘤细胞的生长和增殖，且随着剂量的增加，其抑瘤作用也明显增强；与目前临床上使用的EGFR激酶区靶向药物厄洛替尼相比较，剂量相同时，其抑瘤作用相当，差异无统计学意义，表明小分子抑制剂EE02具有研发为临床用药的巨大前景，为后续临床试验奠定基础，为临床治疗提供新的思路与方法。
基于上述实验结果，可得出以下结论：本申请虚拟筛选并设计合成的靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02，通过CCK8法检测小分子抑制剂对EGFR及EPS8同时高表达人肺癌细胞株A549、H460、H1975、人乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468，72h IC50值分别为：3.70±0.24、1.79±0.05、4.95±0.15、3.02±0.13和1.85±0.04；而对EGFR低/不表达，但EPS8高表达的乳腺癌细胞株MCF-7的72h IC50则是上述细胞H460、MDA-MB-468的2倍。此外，通过CCK8法检测小分子抑制剂EE02对健康者PBMC的细胞增殖抑制活性，发现其在低浓度时对健康者PBMC无细胞增殖抑制作用，高度浓度时表现出极低的细胞增殖抑制作用。动物体内实验也表明，小分子抑制剂EE02具有良好的抑瘤作用。综上，小分子抑制剂EE02具有靶向性、安全性高，毒副作用小等优点，具备较好的研发为治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤疾病的前景。本申请靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂EE02可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，通过阻断体内EPS8与其受体相互作用，在治疗与体内EGFR及EPS8阳性肿瘤疾病方面的应用前景鼓舞人心，具有开发为抗肿瘤小分子靶向抑制剂药物的巨大潜力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干结构优化和改造，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂化合物，其特征在于，分子结构式如式I所示：
2.根据权利要求1所述的小分子抑制剂化合物，其特征在于，所述小分子抑制剂EE02阻断体内EPS8与其受体EGFR的相互作用。
3.一种用于治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1所述的小分子抑制剂化合物。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药用辅料。
5.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、控释或缓释剂或纳米制剂。
6.权利要求1所述的小分子抑制剂化合物在制备治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述EGFR及EPS8阳性肿瘤为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病或混合系白血病。
8.一种式I所示的化合物在制备靶向EGFR与EPS8结合的小分子抑制剂的用途。
9.权利要求1所述的小分子抑制剂化合物在治疗EGFR及EPS8阳性肿瘤中的应用。
CN201810266663.6A 2018-03-28 2018-03-28 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用 Active CN108456184B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810266663.6A CN108456184B (zh) 2018-03-28 2018-03-28 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810266663.6A CN108456184B (zh) 2018-03-28 2018-03-28 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108456184A true CN108456184A (zh) 2018-08-28
CN108456184B CN108456184B (zh) 2020-02-07

Family

ID=63236954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810266663.6A Active CN108456184B (zh) 2018-03-28 2018-03-28 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108456184B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005070020A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 The Regents Of The University Of Colorado Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
EP1802633B1 (en) * 2004-10-15 2011-08-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Benzothieno[2,3-d]pyrimidine compounds as inhibitors of tyrosine kinase activities of the epidermal growth factor receptors (egfrs) for the treatment of hyperproliferative diseases
CN105968181A (zh) * 2016-05-05 2016-09-28 南方医科大学 一种基于Eps8-SH3结构域的双重抗肿瘤多肽

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005070020A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 The Regents Of The University Of Colorado Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
EP1802633B1 (en) * 2004-10-15 2011-08-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Benzothieno[2,3-d]pyrimidine compounds as inhibitors of tyrosine kinase activities of the epidermal growth factor receptors (egfrs) for the treatment of hyperproliferative diseases
CN105968181A (zh) * 2016-05-05 2016-09-28 南方医科大学 一种基于Eps8-SH3结构域的双重抗肿瘤多肽

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS: "Ambinter SARL 提供的产品目录", 《数据库REGISTRY（在线）》 *
姜春俊 等: "Eps8 抗原改造表位HLA-A* 0201 限制性抗肿瘤能力观察", 《山东医药》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108456184B (zh) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105209456B (zh) 表皮生长因子受体的活化突变形式的喹唑啉抑制剂
US10793543B2 (en) Selective C-KIT kinase inhibitor
CN105189456B (zh) Kras g12c的共价抑制剂
CN110036007A (zh) 吡啶化合物
AU2014312919A1 (en) Pharmaceutical composition having pyrimidine compound as active ingredient
CN104725362A (zh) 吡唑基喹喔啉激酶抑制剂
CN109153669B (zh) 苯甲酰胺类化合物的新晶型
CN103992382B (zh) 一种靶向eps8与egfr结合的短肽及其应用
CN108976172B (zh) 一类4-嘧啶二胺类小分子有机化合物及其衍生物及其应用
CN105025898A (zh) 组胺h4受体的苯并咪唑-2-基嘧啶调节剂
Freitag et al. Development of first lead structures for phosphoinositide 3-kinase-C2γ inhibitors
Wang et al. Design, synthesis and biological evaluation of novel 2-(4-(1H-indazol-6-yl)-1H-pyrazol-1-yl) acetamide derivatives as potent VEGFR-2 inhibitors
CN109456331A (zh) 一种取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物及其药物组合物及用途
Zhang et al. Discovery of highly potent and selective CRBN-recruiting EGFRL858R/T790M degraders in vivo
CN114920704B (zh) 一种苯基哌嗪喹唑啉类化合物或其药学上可接受的盐、制法与用途
TW201249836A (en) 4-phenylamino-6-butenamide-7-alkyloxy quinazoline derivatives, preparative method and use thereof
Hu et al. Discovery of potent and selective HER2 PROTAC degrader based Tucatinib with improved efficacy against HER2 positive cancers
Li et al. The role and therapeutic implication of endoplasmic reticulum stress in inflammatory cancer transformation
CN117024413B (zh) 3-氨基吡嗪-2-甲酰胺类靶向蛋白水解嵌合体及其制备方法、药物组合物和应用
CN108676009A (zh) 作为her2酪氨酸激酶抑制剂的嘧啶衍生物及其应用
CN112876458B (zh) 细胞程序性死亡-配体-1拮抗剂化合物
CN107383019A (zh) 吡唑并[4,3‑h]喹唑啉类化合物及其用途
Wu et al. Development and structure-activity relationship of tacrine derivatives as highly potent CDK2/9 inhibitors for the treatment of cancer
CN108456184A (zh) 一种靶向egfr与eps8结合的小分子抑制剂及其应用
WO2005102981A1 (ja) 新規化合物及びその医薬用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant