CN108434526B - 一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法，该类骨膜材料包括：内层膜和外层膜；所述内层膜为I型胶原蛋白和聚吡咯(PPy)纳米粒复合静电纺纤维膜；所述外层膜为亲水改性的聚偏氟乙烯(PVDF)纤维膜。本发明提供的电活性双层类骨膜材料的外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜，具有良好的生物相容性和压电性，能响应外界机械刺激产生电信号；内层膜为静电纺I型胶原/PPy复合膜，具有导电性，可以传导外层膜产生的电信号，从而促进细胞成骨分化并形成骨组织。本发明提供的电活性类骨膜材料具有良好的生物相容性，且其在动态应力载荷下培养细胞有利于细胞成骨分化，是一种潜在的大段骨缺损修复材料。

Description

一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法。
背景技术
骨缺损是临床常见的疾病，其病因包含创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病等，这些疾病发病率高，而且因这些疾病产生的极量骨缺损或大段骨缺损难以自愈合，需要进行骨组织修复手术。临床上主要修复手段有三种，包括自体骨移植、异体骨移植以及人工骨修复。
在目前的骨组织修复中，往往忽略骨膜在骨修复中的重要作用。骨膜存在于骨表面，由内外两层膜组成，含有丰富的血管网和神经，能提供营养和感知作用，对骨的生长和再生十分重要。骨膜参与骨修复，骨膜损伤，影响骨缺损愈合，对外伤患者，在清创时要尽量保留骨膜。临床手术时如果骨膜剥离过多，骨的营养和再生会发生障碍，影响骨愈合，甚至引起骨坏死。由此可见，骨膜在骨缺损修复中至关重要，但自体骨膜存在数量少、取材难，因此构建类骨膜材料对临床治疗大段骨缺损修复具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法，本发明提供的电活性类骨膜材料在移植到骨缺损部位后，可以响应外界机械刺激产生电信号，并传导电信号至周围细胞组织，从而促进细胞的成骨分化，利于骨缺损修复。
本发明提供了一种电活性双层类骨膜材料，包括：内层膜和包裹在所述内层膜一侧的外层膜；
所述内层膜为I型胶原蛋白和PPy纳米粒复合静电纺纤维膜；
所述外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜。
优选的，所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜包括等离子体表面处理的静电纺PVDF纤维膜和覆盖在所述纤维膜表面的聚多巴胺层。
优选的，所述内层膜的厚度为0.05～0.2mm；
所述外层膜的厚度为0.05～0.2mm。
本发明还提供了一种所述电活性双层类骨膜材料的制备方法，包括以下步骤：
a)对静电纺PVDF纤维膜进行亲水改性，得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜；
b)使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上纺丝，得到电活性双层类骨膜材料。
优选的，所述步骤a)具体包括：
静电纺PVDF纤维膜进行等离子体表面处理，将处理后的纤维膜浸泡在盐酸多巴胺溶液中进行反应，得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜。
优选的，所述等离子体表面处理使用的等离子体为O2等离子体；
所述盐酸多巴胺溶液的浓度为0.01～0.05mol/L；所述反应的温度为30～45℃；所述反应的时间为12～48h。
优选的，所述静电纺PVDF纤维膜按照以下方法制备得到：
将聚偏氟乙烯溶解于溶剂中，得到PVDF纺丝液；所述PVDF纺丝液进行静电纺丝，得到静电纺PVDF纤维膜。
优选的，所述静电纺丝的电压为5～30kV；所述静电纺丝的纺丝液流速为0.2～1mL/h。
优选的，步骤b)中，所述I型胶原蛋白和溶剂的质量比为1：(5～15)；
所述PPy纳米粒的质量和所述I型胶原蛋白和溶剂总体积的比为(0.02～0.2)g：10mL。
优选的，所述步骤b)具体包括：
使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上进行静电纺丝，得到电活性双层类骨膜材料；
所述静电纺丝的电压为5～20kV；所述静电纺丝的纺丝液流速为0.2～2mL/h。
与现有技术相比，本发明提供了一种电活性双层类骨膜材料及其制备方法。本发明提供的双层类骨膜材料包括：内层膜和包裹在所述内层膜一侧的外层膜；所述内层膜为I型胶原蛋白和聚吡咯(PPy)纳米粒复合静电纺纤维膜；所述外层膜为亲水改性的静电纺聚偏氟乙烯(PVDF)纤维膜。本发明提供的双层类骨膜材料的外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜，具有良好的生物相容性和压电性，能响应外界机械刺激产生电信号；内层膜为静电纺I型胶原/PPy复合膜，具有导电性，可以传导类骨膜外层膜产生的电信号，从而促进细胞成骨分化并形成骨组织。本发明提供的类骨膜材料具有良好的生物相容性，且其在动态应力载荷下培养细胞有利于细胞成骨分化，是一种潜在的大段骨缺损修复材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的X射线衍射(XRD)图；
图2是本发明实施例3提供的电流随时间变化的曲线图；
图3是本发明实施例3提供的成骨分化相关蛋白Collagen I表达的免疫荧光染色图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种电活性双层类骨膜材料，包括：内层膜和包裹在所述内层膜一侧的外层膜；
所述内层膜为I型胶原蛋白和PPy纳米粒复合静电纺纤维膜；
所述外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜。
本发明提供的电活性双层类骨膜材料包括内层膜和外层膜。其中，所述内成膜包括I型胶原蛋白和PPy纳米粒；所述PPy纳米粒的粒径优选为80～100nm。在本发明中，所述内层膜优选为I型胶原/PPy复合纤维膜；所述I型胶原/PPy复合纤维膜的纤维直径优选为80～180nm，具体可为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm或180nm；所述I型胶原/PPy复合纤维膜的孔径优选为500～1200nm，具体可为500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm、1050nm、1100nm、1150nm或1200nm。在本发明中，所述内层膜的厚度优选为0.05～0.2mm，具体可为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、0.19mm或0.2mm。
在本发明中，所述外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜，包裹在所述内层膜的一侧。其中，所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜优选包括等离子体表面处理的静电纺PVDF纤维膜和覆盖在所述纤维膜表面的聚多巴胺层。在本发明中，所述等离子体表面处理的静电纺PVDF纤维膜由静电纺PVDF纤维膜原料进行等离子体表面处理后获得；所述静电纺PVDF纤维膜的纤维直径优选为150～300nm，具体可为150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm或300nm；所述静电纺PVDF纤维膜的孔径优选为500～2000nm，具体可为500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000nm、1050nm、1100nm、1150nm、1200nm、1250nm、1300nm、1350nm、1400nm、1450nm、1500nm、1550nm、1600nm、1650nm、1700nm、1750nm、1800nm、1850nm、1900nm、1950nm或2000nm；所述静电纺PVDF纤维膜原料的厚度优选为0.05～0.2mm，具体可为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、0.19mm或0.2mm。在本发明中，所述聚多巴胺层的厚度优选为50～200nm，具体可为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm。在本发明中，所述外层膜的厚度优选为0.05～0.2mm，具体可为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.11mm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、0.19mm或0.2mm。
本发明还提供了一种所述电活性双层类骨膜材料的制备方法，包括以下步骤：
a)对静电纺PVDF纤维膜进行亲水改性，得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜；
b)使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上纺丝，得到电活性双层类骨膜材料。
在本发明提供的制备方法中，首先提供静电纺PVDF纤维膜，所述静电纺PVDF纤维膜优选按照以下方法制备得到：
聚偏氟乙烯和溶剂混合，得到PVDF纺丝液；所述PVDF纺丝液进行静电纺丝，得到静电纺PVDF纤维膜。
在本发明提供的上述静电纺PVDF纤维膜的制备方法中，所述聚偏氟乙烯优选为聚偏氟乙烯粉末；所述聚偏氟乙烯的数均分子量优选为10000～100000，具体可为10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或100000；所述溶剂优选包括丙酮和/或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；所述丙酮和DMF的体积比优选为(5～7)：(5～3)，具体可为5:5、6:4或7:3；所述PVDF纺丝液中PVDF的含量优选为5～25wt％，具体可为10wt％、15wt％或20wt％；所述聚偏氟乙烯和溶剂混合的温度优选为50～70℃，具体可为60℃；所述静电纺丝的电压优选为5～30kV，具体可为10kV、15kV或20kV；所述静电纺丝的纺丝液流速优选为0.2～1mL/h，具体可为0.3mL/h、0.5mL/h或0.7mL/h。在本发明中，所述静电纺丝的具体操作可以为：将PVDF纺丝液加入注射器内，对注射器加正电压，调节纺丝液流速，接收装置接地，在接收装置上获得静电纺PVDF纤维膜。
获得静电纺PVDF纤维膜后，对静电纺PVDF纤维膜进行亲水改性。其中，所述亲水改性的具体方式优选包括：
先对所述静电纺PVDF纤维膜进行等离子体表面处理，将处理后的纤维膜浸泡在盐酸多巴胺溶液中进行反应，得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜。
在本发明提供的上述改性方法中，所述等离子体表面处理使用的等离子体优选为O2等离子体；所述等离子体表面处理的时间优选为1～20min，具体可为2min、5min或10min；所述等离子体表面处理的氧气流量优选为50～200mL/min，具体可为50mL/min、100mL/min、150mL/min或200mL/min；所述等离子体表面处理的射频功率优选为100～500W，具体可为100W、200W、300W、400W或500W；所述盐酸多巴胺溶液的浓度优选为0.01～0.05mol/L，具体可为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L或0.05mol/L；所述反应的温度优选为30～45℃，具体可为35℃、37℃或40℃；所述反应的时间为12～48h，具体可为16h、24h或36h。反应结束后，将改性后的静电纺PVDF纤维膜从盐酸多巴胺溶液中取出，优选用去离子水冲洗除去纤维膜上多余的团聚颗粒，然后在去离子水中浸泡2h，取出晾干待用。
得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜后，使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上纺丝。在本发明中，所述PPy纳米粒优选采用以下方法制备得到：吡咯单体、盐酸和过硫酸铵在水中混合反应，得到PPy纳米粒。其中，所述盐酸在混合体系中的含量优选为0.05～0.2mol/L，更优选为0.08～0.15mol/L，具体可为0.1mol/L；所述吡咯单体在混合体系中的含量优选为0.1～0.3mol/L，更优选为0.15～0.25mol/L，具体可为0.2mol/L；所述过硫酸铵在混合体系中的含量优选为0.5～2wt％，更优选为0.8～1.5wt％，具体可为1wt％；所述混合反应的具体混合次序优选为将吡咯单体、盐酸和水混合，再将过硫酸铵加入到混合体系中；所述反应的温度优选为15～35℃，具体可选择室温；所述反应的时间优选为1～5h，具体可为2～3h。反应结束后，将黑色的反应产物取出，依次进行清洗和干燥后，保存备用。在本发明中，所述溶剂包括但不限于六氟异丙醇。在本发明中，所述纺丝液的具体配制过程优选包括：先将I型胶原蛋白和溶剂混合，得到I型胶原溶液；之后将所述I型胶原溶液和PPy纳米粒混合，得到纺丝液。其中，所述I型胶原蛋白和溶剂的质量比优选为1：(5～15)，具体可为1:9；所述PPy纳米粒和所述I型胶原溶液的用量比优选为(0.02～0.2)g：10mL，具体可为0.05g：10mL或0.1g：10mL；所述I型胶原溶液和PPy纳米粒混合后优选进行超声分散，以使其混合的更为均匀。在本发明中，所述纺丝的方式优选为静电纺丝；所述静电纺丝的电压优选为5～20kV，具体可为10kV或15kV；所述静电纺丝的纺丝液流速为0.2～2mL/h，具体可为0.3mL/h、0.5mL/h、0.7mL/h、1mL/h或1.5mL/h。在本发明中，所述静电纺丝的具体操作可以为：将包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液加入注射器内，对注射器加正电压，调节纺丝液流速，将所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜置于接收装置上，接收装置接地，在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜上接收I型胶原/PPy复合纤维膜，得到本发明提供的电活性双层类骨膜材料。
本发明提供的双层类骨膜材料的外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜，具有良好的生物相容性和压电性，能响应外界机械刺激产生电信号；内层膜为静电纺I型胶原/PPy复合膜，具有导电性，可以传导外层膜产生的电信号，从而促进细胞成骨分化并形成骨组织。本发明提供的类骨膜材料具有良好的生物相容性，且其在动态应力载荷下培养细胞有利于细胞成骨分化，是一种潜在的大段骨缺损修复材料。
具体的，本发明提供的技术方案或优选技术方案至少具有如下优势：
(1)本发明提供的双层类骨膜具有内外双层的仿生结构，具有较好的促成骨能力；
(2)本发明提供的类骨膜材料的外层膜具有压电性，模仿骨的压电效应，能响应机械应力产生电信号，无需电源构成体内的一个电学微环境；
(3)本发明提供的类骨膜材料的内层膜具有导电性，类似于电极，能够传导外层膜产生的电信号，对周围细胞组织产生电刺激，有利于促进骨的生长和重建。
(4)在本发明提供的优选技术方案中，外层膜经过O2等离子体的处理及表面沉积聚多巴胺膜改性，提高了膜表面亲水性及与内层膜之间的相容性，双层类骨膜结合紧密，不易剥落。
(5)本发明提供的类骨膜材料具有电信号响应特性类骨膜能够响应机械应力产生并传导电信号，形成电学微环境刺激诱导体内细胞的生物作用，促进细胞成血管、成神经、成骨分化，从而有利于骨缺损修复。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
下述实施例中，涉及的PPy纳米颗粒的粒径为80-100nm，来源为自制，具体制备过程为：25mL 0.1M盐酸溶液中，加入0.35mL吡咯单体配成0.2M溶液，再按1wt％逐渐加入过硫酸铵，磁力搅拌3h，取出黑色物质，超声洗涤三次，40℃真空干燥24h，保存待用。
实施例1
外层膜纺丝液的制备：
将一定量PVDF粉末(牌号FR904，数均分子量50000，内蒙古三爱富万豪氟化工有限公司)与按体积比5:5混合的丙酮和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂混合，60℃搅拌到完全溶解，得到10wt％的PVDF纺丝液。
内层膜纺丝液的制备：
将0.05g PPy纳米颗粒加入到10mLⅠ型胶原溶液(溶剂：六氟异丙醇，Ⅰ型胶原蛋白含量10wt％)中，超声分散，得到内层膜纺丝液。
PVDF纳米纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将外层膜PVDF纺丝液加入注射器内，加10kV正高压，调节液体流速为0.5mL/h，接收装置接地，获得厚度为0.1mm的压电PVDF纳米纤维膜，纳米纤维直径为250±50nm，纤维膜孔径为650±150nm。
PVDF纳米纤维膜的亲水改性：
将PVDF纳米纤维膜置于O2等离子体处理仪中处理2分钟，氧气流量为100mL/min，射频功率为200W，然后浸泡在新配制的盐酸多巴胺水溶液0.01mol/L中，37℃、100r/min条件下反应，反应过程中盐酸多巴胺在PVDF纳米纤维膜表面聚合，形成聚多巴胺层，反应24h后取出，用去离子水冲洗除去多余的团聚颗粒，然后在去离子水中浸泡2h，取出晾干待用，晾干后亲水改性PVDF纳米纤维膜的整体厚度为0.1±0.01mm，表面聚多巴胺层厚度50±25nm。
I型胶原/PPy复合纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将内层膜纺丝液加入注射器中，调节电压10kV，液体流速0.5mL/h，在上述改性处理后的PVDF纳米纤维膜上接收注射出的内层膜纺丝液，在改性处理后的PVDF纳米纤维膜上形成I型胶原/PPy复合纤维膜，纤维直径为120±20nm，纤维膜孔径为800±100nm，最终得到总厚度为0.2mm的双层类骨膜材料。
实施例2
外层膜纺丝液的制备：
将一定量PVDF粉末(牌号FR904，数均分子量50000，内蒙古三爱富万豪氟化工有限公司)与按体积比6:4混合的丙酮和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂混合，60℃搅拌到完全溶解，得到15wt％的PVDF纺丝液。
内层膜纺丝液的制备：
将0.1g PPy纳米颗粒加入到10mLⅠ型胶原溶液(溶剂：六氟异丙醇，Ⅰ型胶原蛋白含量10wt％)中，超声分散，得到内层膜纺丝液。
PVDF纳米纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将外层膜PVDF纺丝液加入注射器内，加15kV正高压，调节液体流速为0.5mL/h，接收装置接地，获得厚度为0.1mm的压电PVDF纳米纤维膜，纤维直径为200±50nm，纤维膜孔径为1000±200nm。
PVDF纳米纤维膜的亲水改性：
将PVDF纳米纤维膜置于O2等离子体处理仪中处理5分钟，氧气流量为100mL/min，射频功率为100W，然后浸泡在新配制的盐酸多巴胺水溶液0.01mol/L中，37℃、100r/min条件下反应，反应过程中盐酸多巴胺在PVDF纳米纤维膜表面聚合，形成聚多巴胺层，反应24h后取出，用去离子水冲洗除去多余的团聚颗粒，然后在去离子水中浸泡2h，取出晾干待用，晾干后亲水改性PVDF纳米纤维膜的整体厚度0.1±0.01mm，表面聚多巴胺层厚度50±30nm。
I型胶原/PPy复合纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将内层膜纺丝液加入注射器中，调节电压10kV，液体流速1.0mL/h，在上述改性处理后的PVDF纳米纤维膜上接收注射出的内层膜纺丝液，在改性处理后的PVDF纳米纤维膜上形成I型胶原/PPy复合纤维膜纤维直径为150±30nm，纤维膜孔径为600±100nm，最终得到总厚度为0.2mm的双层类骨膜材料。
对本实施例制备的双层类骨膜材料的内层膜进行XRD分析，结果如图1所示，图1是本发明实施例2提供的XRD图。通过图1可以看出，本方法制备的双层类骨膜中外层PVDF膜的主要晶型为β相，类骨膜具有压电性。
实施例3
外层膜纺丝液的制备：
将一定量PVDF粉末(牌号FR904，数均分子量50000，内蒙古三爱富万豪氟化工有限公司)与按体积比7:3混合的丙酮和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂混合，60℃搅拌到完全溶解，得到15wt％的PVDF纺丝液。
内层膜纺丝液的制备：
将0.05g PPy纳米颗粒加入到10mLⅠ型胶原溶液(溶剂：六氟异丙醇，Ⅰ型胶原蛋白含量10wt％)中，超声分散，得到内层膜纺丝液。
PVDF纳米纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将外层膜PVDF纺丝液加入注射器内，加20kV正高压，调节液体流速为0.5mL/h，接收装置接地，获得厚度为0.1mm的压电PVDF纳米纤维膜，纤维直径为180±30nm，纤维膜孔径为1500±500nm。
PVDF纳米纤维膜的亲水改性：
将PVDF纳米纤维膜置于O2等离子体处理仪中处理5分钟氧气流量为150mL/min，射频功率为500W，然后浸泡在新配制的盐酸多巴胺水溶液0.05mol/L中，37℃、100r/min条件下反应，反应过程中盐酸多巴胺在PVDF纳米纤维膜表面聚合，形成聚多巴胺层，反应24h后取出，用去离子水冲洗除去多余的团聚颗粒，然后在去离子水中浸泡2h，取出晾干待用，晾干后亲水改性PVDF纳米纤维膜的整体厚度为0.1±0.05mm，表面聚多巴胺层厚度150±50nm。
I型胶原/PPy复合纤维膜的制备：
采用静电纺丝装置，将内层膜纺丝液加入注射器中，调节电压15kV，液体流速0.5mL/h，在上述改性处理后的PVDF纳米纤维膜上接收注射出的内层膜纺丝液，在改性处理后的PVDF纳米纤维膜上形成I型胶原/PPy复合纤维膜，纤维直径为100±10nm，纤维膜孔径为1000±150nm，最终得到总厚度为0.2mm的双层类骨膜材料。
利用皮安计检测本实施例制备的双层类骨膜材料在动态应力加载下产生的电流随时间的变化，结果如图2所示，图2是本发明实施例3提供的电流随时间变化的曲线图。通过图2可以看出，本方法制备的双层类骨膜材料在动态应力加载下可以产生达100pA的电流。
研究本实施例制备的双层类骨膜材料在加载动态应力载荷条件下对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化作用，具体为：双层类骨膜样品内层膜表面接种密度为1.5×104cell/mL的BMSCs，细胞培养基中不含有成骨诱导液，在每天加载1小时、5N大小动态应力载荷条件下培养10天后，按1：100稀释一抗Anti-Collagen I抗体，按1：100稀释二抗FITC标记羊抗兔IgG和1mg/mL DAPI染色。激光共聚焦观察双层类骨膜材料表面BMSCs成骨分化相关蛋白Collagen I的表达，结果如图3所示，图3是本发明实施例3提供的成骨分化相关蛋白Collagen I表达的免疫荧光染色图，图中，施加动态应力下培养细胞为动态培养(Dynamic culture)，不施加应力下静置培养细胞为静态培养(Static culture)。通过图3可以看出，动态培养下，本方法制备的类骨膜材料更有利于细胞成骨分化基因的表达。
实施例4
生物相容性测试
使用实施例1、2、3所得到双层类骨膜材料对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行12小时细胞粘附实验。接种的BMSCs到各个材料内层膜表面，密度2.0×104cell/mL，培养12小时后多聚甲醛固定，用1:100稀释的Actin-Tracker Green染色液和1mg/mL DAPI溶液染色。激光共聚焦观察双层类骨膜材料表面BMSCs粘附良好，说明本发明提供双层类骨膜材料生物相容性良好，均有利于细胞的粘附铺展。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种电活性双层类骨膜材料，包括：内层膜和包裹在所述内层膜一侧的外层膜；
所述内层膜为I型胶原蛋白和PPy纳米粒复合静电纺纤维膜，纤维膜中的PPy纳米粒的粒径为80~100nm，纤维膜的纤维直径为80~180nm，纤维膜的孔径为500~1200nm；
所述外层膜为亲水改性的静电纺PVDF纤维膜，所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜包括等离子体表面处理的静电纺PVDF纤维膜和覆盖在纤维膜表面的聚多巴胺层，纤维膜的纤维直径为150~300nm，纤维膜的孔径为500~2000nm。
2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于，所述内层膜的厚度为0.05~0.2 mm；
所述外层膜的厚度为0.05~0.2 mm。
3.一种权利要求1所述电活性双层类骨膜材料的制备方法，包括以下步骤：
a）对静电纺PVDF纤维膜进行等离子体表面处理，将处理后的纤维膜浸泡在盐酸多巴胺溶液中进行反应，得到亲水改性的静电纺PVDF纤维膜；
b）使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上纺丝，得到电活性双层类骨膜材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述等离子体表面处理使用的等离子体为O2等离子体；
所述盐酸多巴胺溶液的浓度为0.01~0.05 mol/L；所述反应的温度为30~45 ℃；所述反应的时间为12~48 h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺PVDF纤维膜按照以下方法制备得到：
将聚偏氟乙烯溶解于溶剂中，得到PVDF纺丝液；所述PVDF纺丝液进行静电纺丝，得到静电纺PVDF纤维膜。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝的电压为5~30 kV；所述静电纺丝的纺丝液流速为0.2~1 mL/h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b）中，所述I型胶原蛋白和溶剂的质量比为1：（5~15）；
所述PPy纳米粒的质量和所述I型胶原蛋白和溶剂总体积的比为（0.02~0.2）g：10 mL。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b）具体包括：
使用包括I型胶原蛋白、PPy纳米粒和溶剂的纺丝液在所述亲水改性的静电纺PVDF纤维膜的一侧上进行静电纺丝，得到电活性双层类骨膜材料；
所述静电纺丝的电压为5~20 kV；所述静电纺丝的纺丝液流速为0.2~2 mL/h。
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