CN108424969B - 一种生物标志物、诊断或预估死亡风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物标志物及诊断或预估死亡风险的方法，所述生物标志物至少包括以下一组特征性基因组：SigCYBDEGBC、SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3、SigCutpnt、SigBasal、SigClaudin、SigNorm、SigLumB和SingLumA。本发明的生物标志物具有能有效地预测乳腺癌患者的远期生存和预后的优点。
Description
技术领域
本发明涉及乳腺癌检测技术，特别涉及一种可用于预测乳腺癌内在亚型患者的死亡风险的生物标志物、以及诊断或预估死亡风险的方法。
背景技术
根据2014年世界癌症报告(世界卫生组织)，乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因。大约每年有170万女性被诊断为乳腺癌，每年因乳腺癌致死的人数约50万人。在临床上，根据雌激素受体和Her2基因的表达情况，乳腺癌可以分为雌激素受体阳性、Her2阳性和三阴性三个亚类。三阴性就是雌激素受体、孕激素受体和Her2阴性的亚类。也可以根据基因表达图谱将乳腺癌分成六个内在亚型：腺腔A和B(雌激素受体阳性)、类正常型、Her2高表达型、基底细胞型和低Claudin蛋白型(后两者是三阴型)。不同的亚型都具有其独特性，并且远期死亡风险也不一样。雌激素受体阳性的乳腺癌患者的生存率明显高于Her2阳性和三阴性的患者。在根据PAM50分类的亚型里，腺腔A和B型都是雌激素受体阳性，但是腺腔B型更具侵袭性。同腺腔型的乳腺癌相比，类正常型的死亡风险明显增加；而且低Claudin蛋白型、Her2阳性型和基底细胞型的乳腺癌恶性程度更高。因此，相对于根据雌激素受体、孕激素受体和Her2基因的表达情况进行的分类，根据RNA表达(也就是基因表达图谱)的乳腺癌分类能更准确地预测乳腺癌的远期死亡风险。基于这些前期研究，有必要进一步评估不同内在亚型的乳腺癌患者的死亡风险。
目前，市场上用于诊断雌激素受体阳性、Her2阴性和淋巴结阴性(也就是阳性淋巴结≤3个)乳腺癌患者复发的试剂盒有Oncotype DX、MammaPrint、EndoPredict和Prosigna试剂盒。但是这些试剂盒只能用于评估早期腺腔A型(luminal A)乳腺癌的复发。目前，市场上还没有能用于评估所有各类乳腺癌亚型复发的诊断试剂盒。这样的试剂盒将会有极高的市场价值。
乳腺癌是一种高度异质性肿瘤。乳腺癌的进展涉及复杂的分子生物网络。每个不同的乳腺癌亚型的分子生物学网络机制也是不一样的。因此，十分有必要研究不同乳腺癌亚型中起重要作用的分子生物学机制，以及这些研究成果应用于诊断上的可能性。发现和研究新的分子通路和网络，以及研究它们在乳腺癌内在亚型的预后诊断上的应用前景是十分重要的。最近，我们最新的研究证实，在宫颈癌中，CYB5D2是一种新的重要抑癌基因。CYB5D2基因也被称为neuferricin，因为它能通过抑制细胞分裂增殖，从而促进神经元分化得名。CYB5D2属于膜相关孕酮受体(MAPRs)蛋白家族，它具有MAPR家族的典型特征，有类细胞色素b5(cyt-b5)的heme/激素结合域。除了neuferricin/CYB5D2之外，MAPR家族还包括PGRMC1(progesterone receptor membrane component 1)、PGRMC2和neudesin。PGRMC1有助于多种肿瘤的肿瘤发生，这些肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌；而有关PGRMC2怎样参与肿瘤发生仍然不是很清楚。在III期乳腺癌中可以观察到PGRMC2的表达增加。另一方面，据报道，PGRMC2抑制体外培养的卵巢癌(SKOV-3)细胞的迁移。而在转移宫颈腺癌中，PGRMC2表达减少。这些实验结果表明PGRMC2是肿瘤抑制因子。类似的，在宫颈癌中，CYB5D2的表达显著下调；当在HeLa细胞中高表达CYB5D2时，CYB5D2可以抑制体外培养的Hela细胞侵袭能力和Hela细胞在小鼠中肺转移癌的形成。CYB5D2/Neuferricin基因位于染色体17p13.2。该染色体区域位于TP53区域17p13.1的远端。在50％的乳腺癌中，该区域是缺失的。这些实验和临床证据表明CYB5D2是一种新的抑癌基因。CYB5D2和其它相关的分子生物网络能有效地评估乳腺癌患者的远期生存和预后。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：基于CYB5D2和与其相关的分子生物网络，提供一种生物标志物，能有效地预测患者(例如乳腺癌患者)的远期生存和预后。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种生物标志物，至少包括以下一组特征性基因组：SigCYBDEGBC、SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt；
所述SigCYBDEGBC包括以下基因：APOD、NOSTRIN、SCUBE2、SLC40A1、SLC7A2、AFF3、CYB5D2、FBP1、STMND1、XBP1、C1ORF106、CALML5、CBX2、CCNE1、KIF1A、KRT16P3、LAD1、SLPI、TTK、UBE2C和S100A8；
所述SigCYBDEGBC1包括以下基因：FGD3、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、TIPARP、MEF2D、SYTL1、TMEM218、ARL6IP5、APOM、USP35、CEP63、MGARP、PXK、NCCRP1、DDIT4、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、TRIB2、CKAP4、GSK3B、TBC1D31、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A和ZBTB9；
所述SigCYBDEGBC2包括以下基因：ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11ORF1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、TMEM218、ARL6IP5、APOM、USP35、CEP63、MGARP、RPGRIP1、PXK、NCCRP1、NFIB、DDIT4、ZSWIM4、FAT1、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、CKAP4、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A、ZBTB9；
所述SigCYBDEGBC3包括以下基因：FGD3、MFAP4、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11ORF1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、FAM102B、TMEM218、ARL6IP5、APOM、CCDC96、USP35、CEP63、MGARP、RPGRIP1、PXK、ZFYVE28、CALML5、NCCRP1、NFIB、DDIT4、ZSWIM4、FAT1、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、IRX6、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、CKAP4、ATAD2、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A、ZBTB9；
所述SigCutpnt包括以下基因：FGD3、MFAP4、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11orf1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、FAM102B、TMEM218、ARL6IP5、APOM、CCDC96、USP35、CEP63、MGARP、PXK、ZFYVE28、CALML5、NCCRP1、DDIT4、GLYATL2、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、ATAD2、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、GPI、NOLC1。
一种生物标志物，至少包括以下一组特征性基因组：SigBasal、SigClaudin、SigNorm、SigLumB和SingLumA；
所述SigBasal包括以下基因：ZNF311和TAX1BP1；
所述SigClaudin包括以下基因：ZMYND12、NEBL、NFKBIB和UBL4A；
所述SigNorm包括以下基因：HDDC3、EPHX2、MAP2K4、TBCK、MRPS14、SPAG7、UBE2W、ZNF18、CHM、CEP63、TTC30B、GLYATL2和MTA2；
所述SigLumB包括以下基因：TRIM4、PLPBP、DCTN6、EIF3J、HRK、PDCD2L、MTBP、PPP6R1、TSPAN14、CNOT10和IQGAP3；
所述SingLumA包括以下基因：TMEM30B、LEF1、NKD2、PIGV、CTDSPL、WDR19、C11ORF1、CRIPAK、MICU2、TACC1、ANKRD12、IMP3、SYTL1、DET1、FUZ、ADPRM、C1ORF123、PCSK6、ECE1、SCN2B、CA9、OASL、ZNF750、VARS、TBC1D22B、ZNF683、XRN1、IL12A、CHPF2、OTOF、TRIM24、CNOT10、ARF1、ACTRT3、CBR1和RAB3GAP2。
进一步的，所述生物标志物用于诊断或预估乳腺癌内在亚型患者的死亡风险。
进一步的，所述乳腺癌内在亚型患者包括基底细胞型、低Claudin蛋白型、类正常型、腺腔A型和腺腔B型亚型患者。
进一步的，所述生物标志物用于诊断或预估乳腺癌患者的治疗失败。
进一步的，所述生物标志物用于诊断或预估以下肿瘤患者的死亡和癌症的复发风险：急性骨髓性白血病、较低分化的脑胶质瘤、食管癌、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞肾细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、皮肤黑素瘤、肉瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺癌和子宫体子宫内膜癌。
进一步的，所述特征性基因组中定义的基因包括所述基因的同种型和基因家族成员。
一种诊断或预估死亡风险的方法，通过检查上述的生物标志物中特征性基因组表达变化来诊断或预估患者的死亡风险。
进一步的，采用PCR、microarray(微阵列)、Nanostring(数字化基因检测技术)或RAN测序的方法，以检查上述的生物标志物中的所有低mRNA表达的基因和高mRNA表达的基因。
进一步的，其对象是人或哺乳动物。
附图说明
图1显示乳腺癌中SigCYBDEGBC的改变；
图2显示SigCYBDEGBC与乳腺癌患者生存期(OS)降低的相关性；
图3显示SigCYBDEGBC与乳腺癌患者生存期(OS)降低的相关性；
图4显示SigCYBDEGBC与乳腺癌患者生存期(OS)和无癌生存期(disease freesurvival,DFS)；
图5显示SigCYBDEGBC1(A)、SigCYBDEGBC2(B)和SigCYBDEGBC3(C)与乳腺癌患者的生存期(OS)降低的非常密切关系；
图6显示SigCYBDEGBC1(A)、SigCYBDEGBC2(B)和SigCYBDEGBC3(C)与乳腺癌患者的生存期(OS)降低的非常密切关系；
图7显示SigCYBDEGBC1评估如图所示癌症类型中生存期(OS)和无癌生存期(DFS)降低的可信程度；
图8显示用SigCYBDEGBC1来确定分界点；
图9显示使用SigCYBDEGBC1进行乳腺癌患者的分层分析；
图10显示使用SigCYBDEGBC2进行乳腺癌患者的分层分析；
图11显示使用SigCYBDEGBC3进行乳腺癌患者的分层分析；
图12显示用SigCutpnt评估在乳腺癌患者死亡和生存判别中的敏感性和特异性；
图13显示SigBasal与乳腺癌基底细胞亚型中生存期降低的关联；
图14显示SigBasal与Curtis数据库中乳腺癌(A)和TCGA数据库中条件性肝细胞癌(B)的生存期(OS)下降以及TCGA中条件性乳腺癌中的无癌生存期缩短(C)的相关性；
图15显示SigBasal在评估基底细胞型乳腺癌患者死亡和生存方面的敏感性和特异性；
图16显示SigClaudin和低Claudin蛋白型乳腺癌中生存期(OS)降低的关联；
图17显示SigClaudin在评估低Claudin蛋白型乳腺癌患者死亡和生存方面的敏感性和特异性；
图18显示SigNorm和类正常型乳腺癌中生存期(OS)降低的关联；
图19显示SigNorm在评估类正常型乳腺癌患者死亡和生存方面的敏感性和特异性；
图20显示SigLumB与腺腔型B(Luminal B)乳腺癌中生存期(OS)减少的关联；
图21显示SigLumB在评估腺腔型B(Luminal B)乳腺癌患者的死亡和存活判断中的敏感性和特异性；
图22显示SigLumA与腺腔型A(Luminal A)乳腺癌中生存期(OS)减少的关联；
图23显示SigLumA在评估乳腺癌A(Luminal A)型乳腺癌患者死亡和存活方面的敏感性和特异性；
图24显示在Curtis数据库中乳腺癌(A)和TCGA条件性乳腺癌(B)中SigLumA与生存期(OS)缩短的相关性。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明描述了由4891个基因构成的CYB5D2分子生物网络。根据一系列分析，CYB5D2分子生物网络中，获得了一组特征性基因组合。这一组特征性基因组合能有效地用来预测乳腺癌患者的远期生存和预后，也可以用于不同的乳腺癌内在亚型，这些亚型包括腺腔A和B、类正常型、低Claudin蛋白型和基底细胞型。这一组特征性基因组合包括21个不同基因的SigCYBDEGBC、36个基因的SigCYBDEGBC1、42个基因的SigCYBDEGBC2、50个基因的SigCYBDEGBC3、37个基因的SigCutpnt、2个基因的SigBasal、4个基因的SigClaudin、11个基因的SigNorm、13个基因的SigLumB和36个基因的SigLumA。
SigCYBDEGBC基因组合来源于4981个基因中的最主要的98个基因(其中，64个基因是主要的下调基因和34个基因是主要的上调基因)。
根据分析，SigCYBDEGBC、SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt都能有效地预估乳腺癌患者的远期预后和死亡。
乳腺癌患者中位生存(Median Months Survival)如下所列：
SigCYBDEGBC阳性乳腺癌患者中位生存为126个月，SigCYBDEGBC阴性的为211个月(p＝5.74e-12)；SigCYBDEGBC1阳性为125.6个月，SigCYBDEGBC1阴性为205.6个月(p＝0)；SigCYBDEGBC2阳性为128.5个月，SigCYBDEGBC2阴性为206.1个月(p＝0)；SigCYBDEGBC3阳性135.3个月，SigCYBDEGBC3阴性为211个月(p＝0)；SigCutpnt阳性为129个月，SigCutpnt阴性为214个月(p＝0)。
SigBasal同患有基底细胞型患者(n＝209)的总生存率减少密切相关(n＝209)；SigBasal基底细胞型患者的中位生存为56.3个月(95％置信区间，95％/CI：39-101个月)，没有SigBasal降低的患者的中位生存为292.7个月(95％CI：195.4-NA个月)，p＝3.09e-7。SigBasal的组成基因包括了ZNF311和TAX1BP1两基因。
SigClaudin由ZMYND12和NEBL基因表达的下调和NFKBIB和UBL4A基因表达的上调组成。SigClaudin极其有效的预估了低claudin蛋白型的乳腺癌患者(n＝218)的死亡率。在低claudin蛋白型的乳腺癌患者中，SigClaudin阳性患者的中位生存为114个月(95％CI：89.5-158个月)，而SigClaudin阴性患者的中位生存为290个月(p＝1.88e-9)。
SigNorm包括HDDC3、EPHX2、MAP2K4、TBCK、MRPS14、SPAG7、UBE2W、ZNF18、CHM、CEP63和TTC30B基因的表达下调和GLYATL2和MTA2基因的表达上调。这一组特征性基因组合能十分有效地预测类正常型乳腺癌患者的总生存率的下降(n＝148)。在这类亚型乳腺癌中，SigNorm阳性的患者中位生存为86.1个月(95％CI：63.5-105个月)；阴性的患者，在350个月的随访中，未达到中值生存时间(median survival time)(p＝3.95e-14)。
SigLumB包括TRIM4、PLPBP、DCTN6和EIF3J基因的表达下调以及HRK、PDCD2L、MTBP、PPP6R1、TSPAN14、CNOT10和IQGAP3基因的表达上调组成。SigLumB可以非常有效地预估腺腔B型乳腺癌患者的总生存(n＝475，p＝4.82e-10)。SigLumB阳性的乳腺癌患者的中位生存时间是88.8个月(95％CI：79.2-108个月)，而SigLumB阴性的为164.6个月(95％CI：141.6-188个月)。
SigLumA可以非常有效地预估腺腔A型乳腺癌患者的总生存(n＝700，p＝0)。该组特征性基因组合是TMEM30B、LEF1、NKD2、PIGV、CTDSPL、WDR19、C11ORF1、CRIPAK、MICU2、TACC1、ANKRD12、IMP3、SYTL1、DET1、FUZ、ADPRM、C1ORF123、PCSK6、ECE1和SCN2B基因的表达下调和CA9、OASL、ZNF750、VARS、TBC1D22B、ZNF683、XRN1、IL12A、CHPF2、OTOF、TRIM24、CNOT10、ARF1、ACTRT3、CBR1和RAB3GAP2基因的表达上调。SigLumA阳性的腺腔A型乳腺癌患者中位生存是127个月(95％CI：118-147个月)，而SigLumA阴性的腺腔A型乳腺癌患者中位生存是257个月(95％CI：228-NA个月)。
本发明所包含的各种特征性基因组合同以下肿瘤的总生存降低和/或无癌存活相关：
急性骨髓性白血病、低分化脑胶质瘤、食管癌、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞肾细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、肉瘤、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤、甲状腺癌、以及子宫体子宫内膜癌。
本发明的附图中：
图1数据来自Curtis数据库，此处显示基因表达同乳腺癌患者生存期(OS)的关系，总生存期显示在图右侧(description is consistent with Fig 1)；图2数据来自Curtis数据库，SigCYBDEGBC阳性和阴性评估乳腺癌患者生存预后，包括整个群体的生存预后(n＝1980)(A)，雌激素受体阳性(ER+)亚型(B)和类正常亚型(C)。统计分析采用Log-rank检验。Sig#2:特征基因组2；total:总数；dec：死亡病例数量；MMS：中位数月存活；图3数据来自Curtis数据库。SigCYBDEGBC阳性和阴性评估乳腺癌患者生存预后，包括雌激素受体阴性(ER-)亚型(A)，HER2+(B)和类正常亚型(C)。统计分析使用Log-rank Test检验。Sig#2:特征基因组2；total:总数；dec：死亡病例数量；图4数据来自TCGA-细胞数据库(n＝817)。SigCYBDEGBC阳性和阴性和乳腺癌患者生存期(OS)(A，C)和无癌生存期(disease freesurvival,DFS)(B，D包括在A，B里的所有样本和C，D里的小叶乳腺癌)。(E)来自Curtis数据库的数据(n＝1980)用来分析SigCYBDEGBC阳性和阴性和小叶乳腺癌患者生存期(OS)的关系。统计分析使用Log-rank检验。Sig:特征基因组；dec：死亡病例；Relap：复发病例；图5在cBioPortal数据库中，Curtis数据库(n＝1980)被用于这些分析。Sig:特征基因组；dec：死亡病例数量；MMS：中位数月存活；图6一个独立的TCGA Provisional肿瘤库的数据(n＝1100)被用于这些分析。dec：死亡病例数量；MMS：中位数月存活；图7MMDS：中位无癌月数。图8使用Curtis数据库的数据来分析。使用R语言中的Maxstat软件包来估计分界点。图示分界点和p值；图9使用Curtis数据库的数据来分析。分层分析的参数包括分界点、Q1、中值和Q3分类。在随访期间患者数量也显示图内；图10分析参见图9；图11分析参见图9；图12这里使用R语言中的“timeROC”软件包进行时间依赖性ROC分析(time-dependent receiveroperating characteristic,tROC)。tAUC：曲线下的时间依赖区域；图13两个垂直点线是中位数月生存。这里也显示了Kaplan-Meier曲线(点曲线)的各自95％CI(置信区间)；图14SigBasal还与皮肤黑素瘤(D)和肉瘤(E)中的的生存期(OS)下降有关；图15使用tROC测定tAUC；图16此图也显示了中位数月存活和95％的可信区间曲线；图17使用tROC测定tAUC；图18此图也显示了中位数月存活和95％的可信区间曲线；图19使用tROC测定tAUC；图20此图也显示了中位数月存活和95％的可信区间曲线；图21使用tROC测定tAUC；图22包括中位数月存活和95％CI曲线；图23使用tROC测定tAUC；图24显示在Curtis数据库中乳腺癌(A)和TCGA条件性乳腺癌(B)中SigLumA与生存期(OS)缩短的相关性。
本发明技术方案的详细介绍：
CYB5D2是一个新发现的在乳腺癌中有重要作用的抑癌基因。
首先，发明人在宫颈癌中证实CYB5D2是一个抑癌基因。CYB5D2/Neuferricin基因位于染色体17p13.2区；50％的乳腺癌出现丢失染色体17p13.2-13.3，这个区域也位于TP53所在的17p13.1的远端。这些证据表明在乳腺癌中CYB5D2也是一个很重要的抑癌基因。实际上，我们证明CYB5D2能抑制MCF7细胞增殖和抑制雌激素受体控制的萤光素酶活性。此外，我们已经在源自MCF7的TAM抗性(TAM-R)细胞系中观察到在TAM-R细胞中CYB5D2的mRNA和蛋白质水平明显减少。通过实时定量PCR或免疫组化IHC，我们也证实，MCF7细胞的异种移植肿瘤在给于tamoxifen(TAM)后，相比阴性对照组，CYB5D2的表达也明显下降。更有意义的是，我们分析了OncomineTM(Compendia Bioscience，Ann)数据库所包括TCGA、柯蒂斯、Finak和Karnoub数据库中的乳腺癌样本。我们发现在乳腺癌中，CYB5D2的mRNA表达显著下调。下调的CYB5D2的mRNA可以做为一个指标，用来敏感地区分乳腺癌组织和正常乳腺组织。
CYB5D2表达降低与乳腺癌患者的总生存期降低相关联。
分析来源于OncomineTM数据库的数据，我们发现CYB5D2表达降低与乳腺癌患者(包括雌激素受体阳性或者孕激素受体阳性的乳腺癌)患者的总生存期(OS)缩短相关。我们使用Metabric数据库(来源于cBioPortal)中的Curtis数据库(n＝1980)，进一步分析CYB5D2下调同患者总生存期缩短的相关性。我们将肿瘤患者与参考群体平均值相比较后，将肿瘤患者分成CYB5D2不变组和CYB5D2下调组。CYB5D2下调组进一步分为减少一个标准差(-1SD)，-1.5SD或者-2SD。参考群体是指，在数据库中，目标基因是二倍体或完整肿瘤的群体(http://www.cbioportal.org/faq.jsp)。在120个月的随访期内，与CYB5D2不变组相比，CYB5D2表达下调-1SD，-1.5SD或-2SD与患者的总生存期缩短显著相关。
CYB5D2表达下调与主要的乳腺癌相关基因的突变密切相关。
目前，公认需要把基因表达改变同基因组的基因变异结合起来分析。这样才能更准确地揭示关于肿瘤进展上的关键性问题。例如，把基因表达与基因拷贝数改变结合起来考虑，乳腺癌可以细分为10个完全不同的亚组。据此，我们分析了CYB5D2下调相关的基因组改变。在Metabric数据库中(n＝2509，cBioPortal)，CYB5D2表达下调-1SD，-1.5SD或-2SD同拷贝数变化没有显着的联系(q<0.05，错误发现率，false discovery rate)。然而，我们获得了一组基因，它们的基因突变同CYB5D2表达下调密切相关。值得注意的事，CYB5D2的下调-1.5SD或-2SD同乳腺癌中最常见的突变基因，包括TP53、CDH1、GATA3、PIK3CA和MAP3K1基因的基因突变密切相关。在CYB5D2表达下调-1SD时，CYB5D2的减少同RB1和BRCA1的基因突变密切相关。这些发现强烈支持CYB5D2的下调在乳腺癌的癌发生和进展中起着重要作用。
我们也分析了这些基因组改变是否会会有助于CYB5D2表达下调所导致的总生存期缩短。由于三个不同水平的CYB5D2表达下调都能明显的引起总生存期缩短，我们选择CYB5D2表达下调-1.5SD做进一步分析。通过分析CYB5D2下调对总生存期缩短的贡献，我们获得了特征性基因组1(Signature#1)。它包括CYB5D2表达下调和TP53、CDH1、BRCA1、THSD7A、BIR6和RB1基因突变。与Curtis数据库中(n＝1980，来源于cBioPortal的Metabric数据库的子数据库)，特征性基因组1同乳腺癌总生存期缩短和雌激素受体阳性的乳腺癌亚型患者的生存期缩短有非常强的相关性。在特征性基因组1中，TP53的基因突变是最频繁地出现的。TP53也是特征性基因组1与乳腺癌患者的生存期缩短相关性的重要因子。当剔出TP53的基因突变后，尽管特征性基因组1仍然与生存期缩短相关，但是，它的预估癌患者预后的效能明显降低(对照组n＝1145，死亡数n＝640，中位数月生存169个月，95％CI：159-181；风险个体n＝361，死亡数n＝241，中位数月生存124个月，95％CI：114-149个月，p＝4.33e-5)。进一步分析显示，当剔出其他单个成分时，特征性基因组1同乳腺癌患者的生存期缩短相关性也减少。这也证实这些成分对这一相关性贡献。此外，在依据诊断时的年龄，细胞性，整合聚类(Integrative Cluster)，肿瘤组织学分级，Nottingham预后指数和肿瘤大小和分期进行调整后，我们发现特征性基因组1是预估癌患者远期死亡的一个独立因素(HR 1.328，95％CI：1.131-1.560，p＝5.3e-4)。在去除TP53这一因子后，特征性基因组1仍然是预估癌患者远期死亡的一个独立因素(HR 1.217，95％CI：1.041-1.422，p＝0.01379)。此外，分析另外一个的TCGA-Cell数据库的数据后(n＝817)，我们发现，在80个月的随访期间，特征性基因组1同癌患者生存期(OS)和无癌生存期(DFS)的缩短密切相关。总而言之，我们的这些实验数据力证了CYB5D2表达下调同重要的乳腺癌发病相关基因密切相关。
发现CYB5D2表达下调的相关基因。
为了进一步研究CYB5D2参与乳腺癌发病机制，我们分析了CYB5D2表达下调-1.5SD的肿瘤和CYB5D2表达没有变化肿瘤之间的差异表达基因(differentially expressedgenes，DEGs)。肿瘤数据来源于cBioPortal数据库中TCGA-Cell数据库(n＝817)和Metabric数据库(n＝2509)。差异表达基因(DEGs)定义为检验的显著性q<0.001。在Metabric(n＝2509)和TCGA-Cell(n＝817)数据库中，分别获取了4981和660差异表达基因。在从TCGA-Cell数据库获取的660差异表达基因中，471(71.4％)和从Metabric数据库获取的基因相互重叠。进一步分析发现，这471个基因在两个数据库中显示出相同改变(同时下调或者上调)。这些发现强力的支持这些差异表达基因与CYB5D2表达下调有关。
差异表达的基因所形成的调节细胞增殖的网络。
为了进一步分析差异表达基因，我们使用R语言中的GAGE和Reactome两个软件包以及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行了通路富集分析。在使用GAGE软件包中KEGG基因组分析方法，对在TCGA-Cell和Metabric数据库中共同检测到的471基因(共同-DEGs)进行了分析。我们发现471个差异表达基因中存在三种上调的基因组群――细胞周期相关基因，卵母细胞减数分裂相关基因和孕酮介导的卵母细胞成熟相关基因。我们对从TCGA-Cell数据库中获得的全部660差异表达基因(TCGA-DEGs)进行了富集通路分析。我们可以发现从TCGA-Cell数据库中所获得的所有关键的差异表达基因也会出现在来自于Metabric数据库的差异表达基因组中。事实上，相同的细胞周期相关的KEGG基因组(hsa04110 cellcycle)也被富集，并出现在上调的MetabricMet的差异表达基因组中。另外，两个与DNA复制和核糖体生物合成相关的基因组也富集出现，并出现在上调的MetabricMet的差异表达基因组中。这两个基因组是调控细胞增殖的核心通路。由于细胞增殖对于肿瘤发生起至关重要的作用，一个癌症相关的通路在共同的差异表达基因组(common-DEGs)也是上调的。
我们用R语言中的“gageData”软件包分析肿瘤基因库基因(Gene Ontology genesets，go.gs)。我们发现共同的差异表达基因组在细胞周期、有丝分裂期、DNA代谢、DNA复制、DNA修复、细胞检查点激活等起着重要作用。同GO术语的相似基因组群也在TCGA-差异表达基因组和Metabric-差异表达基因组中富集。
与上述基因组富集分析一样，我们使用R语言中Reactome软件包进行的通路富集分析。我们发现一些通路被如上所述的差异表达基因组调控。这些差异表达基因组包括共同的差异表达基因组，TCGA差异表达基因组和Metabric差异表达基因组。源自共同的差异表达基因组的富集通路主要与有丝分裂有关。除有丝分裂之外，TCGA的差异表达基因组还调节细胞周期和S期DNA复制所需的ATR激活。此外，Metabric的差异表达基因组参与三个主要途径：S期，G1-S期和重要的由p53调节的转录。Cyclin D1-Cdk4/6蛋白促使的G1期进展是乳腺癌发展的主要机制。Metabric的差异表达基因组富集于Cyclin D1调节的G1事件和G1细胞周期转换。这一点也支持了CYB5D2表达下调在乳腺癌发病机制中起着的重要作用。此外，上述通路分析结果与Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析结果是非常相似的。IPA分析表明差异表达基因相关的CDKN1A(编码p21CIP1 CDK抑制蛋白)的基因抑制和HER2和E2F4基因的激活密切相关。总之，上述分析清楚地支持与CYB5D2表达下调相关的差异表达基因主要激活了细胞周期调节机制。
创立一个包含21基因的特征性基因组。
为了进一步分析差异表达基因组，在比较了差异表达基因在有CYB5D2表达下调的肿瘤和CYB5D2表达不变的肿瘤中不同。从中我们选择那些相对变化更大的差异表达基因。据此，我们从Metabric差异表达基因中选择98个基因。在CYB5D2表达下调的肿瘤中，其中64个基因下调，另外34个基因上调。然后，我们使用Cox回归模型中的前向加法或后向消除协变量来判别这些差异表达基因对危害比(Hazard ratio)的贡献值。此处我们使用SPSSstatistics version 23软件进行分析。由此产生包含了21个基因的特征性基因组――SigCYBDEGBC(表1；图1)。SigCYBDEGBC与Curtis乳腺癌数据库(n＝1980，p＝5.72e-12)和雌激素受体阳性(ER+)亚型(n＝1560，p＝9.32e-12)(图2中的A、B)的生存期缩短密切相关。在雌激素受体阴性亚型中，SigCYBDEGBC与患者生存期缩短相关性相对比较弱(p＝0.077)(图3中的A)。我们注意到大部分雌激素受体阴性肿瘤SigCYBDEGBC呈阳性(在474个肿瘤中有432个肿瘤)(图3中的A)，这一点表明这种分布不平衡是观察到的，非显著关联的原因(图3中的A)。由于雌激素受体阴性肿瘤是具有高侵袭性的亚型，这些发现支持来源于CYB5D2的特征性基因组在乳腺癌发病机制起着重要的作用。
表1
注：a：上调和下调定义在离人口均值1.5SD处；b：下调的基因；c：上调的基因；d：一氧化氮合酶运输诱导剂；e：eNOS互动合作伙伴；抑制胰腺癌的进展。
我们随后使用Curtis数据库(cBioPortal)检查了SigCYBDEGBC对根据PAM50分类的内在亚型的乳腺癌患者生存期的影响。由于腺腔(Luminal)亚型本质上是雌激素受体阳性的乳腺肿瘤，我们的分析集中在其他内在亚型：类正常/低Claudin蛋白/HER2阳性和基底细胞型的乳腺癌。在209个基底细胞型的乳腺癌中，198个是SigCYBDEGBC阳性；其中110患者在随访期间死亡。SigCYBDEGBC阳性和阴性基底细胞型的乳腺癌的生存期没有显著差异(p＝0.659)。而在160个月的随访期内，HER2阳性，尤其是低Claudin蛋白型的乳腺癌中，SigCYBDEGBC阳性患者生存期明显缩短(图3中的B、C，右图)。在类正常型乳腺癌患者中，SigCYBDEGBC阳性同患者的生存期缩短明显相关(图2中的C)。在cBioPortal数据库中，有一个最大的TCGA数据库(n＝1101)，它包含TCGA-Cell数据亚库(n＝817)。类似的，我们分析发现，在100个月的随访期内，SigCYBDEGBC阳性与患者生存期(OS)缩短和无癌生存期(DFS)的缩短相关(图4中的A，B)。TCGA-Cell数据库包含18.8％的小叶乳腺癌，并且这一数据库已经用于大规模分析阐述小叶乳腺癌的基因组和基因表达总体情况。值得注意的是，在TCGA数据库(图中的C，D)和Curtis数据库(图4中的E)中，SigCYBDEGBC阳性和小叶乳腺癌患者生存期(OS)缩短和无癌生存期(DFS)的缩短相关密切地相关。此外，在调整了一些已知的临床因素后，SigCYBDEGBC有效的独立预估患者生存期(OS)(表2)。总之，上述发现清楚地证明了源自于CYB5D2的，包含21个基因的特征性基因组与乳腺癌患者生存期(OS)缩短和无癌生存期(DFS)的缩短非常密切的关联。
表2
注：a：临床变量和SigCYBDEGBC；b：风险比；c：置信区间；d：一体化集群；e：肿瘤组织学分级；f：Nottingham预后指数。
SigCYBDEGBC与TP53和RB1突变的明显共同出现。
分析Metabric数据库的数据，我们发现，在CYB5D2表达下调-1.5SD的乳腺癌中，80.6％存在TP53突变(p＝2.95e-56，q＝5.11e-54)；在Curtis数据库中也看到非常类似的现象(p＝1.31e-61，q＝2.26e-59)。有趣的是，我们发现，在出现TP53基因突变的肿瘤中，源自CYC5D2的SigCYBDEGBC明显富集。在85％(560/659)出现TP53突变的乳腺癌中，SigCYBDEGBC呈现阳性(表4；p＝3.02e-80，q＝5.22e-78)。在Metabric数据库(n＝2509)和Curtis数据库中(n＝817，26/49＝53.1％，p＝1.192e-3，q＝0.0206)，RB1基因突变仅与CYB5D2表达下调-1SD的乳腺癌共同出现。在Curtis数据库中，SigCYBDEGBC阳性肿瘤中检测到79.6％(39/49)的RB1突变(表3)。另外，在同SigCYBDEGBC阳性共同出现的11个突变基因中(表3)，9个也与CYB5D2表达下调相关。这一点表明这些突变同SigCYBDEGBC的密切关系。实际上，加入SigCYBDEGBC所包含基因的基因组突变这样的因子并不增强SigCYBDEGBC与Curtis数据库中乳腺癌生存期(OS)缩短的关联。p53和pRB蛋白都是细胞周期的关键抑制蛋白；此处我们的发现提示CYB5D2在调节乳腺癌细胞增殖中起着重要的作用。
表3
| 基因 | 位点 | Sig+ | Sig- | Log R<sup>c</sup> | P值 | Q值 |
| TP53<sup>b</sup> | 17q13.1 | 560(52.98％) | 99(12.24％)<sup>e</sup> | 2.11 | 3.02e-80 | 5.22e-78 |
| PIK3CA<sup>b</sup> | 3q26.3 | 362(34.25％) | 433(53.52％) | -0.64 | 5.0e-17 | 4.32e-15 |
| CBFB<sup>b</sup> | 16q22.1 | 21(1.99％) | 71(8.78％) | -2.14 | 1.35e-11 | 7.80e-10 |
| MAP3K1<sup>b</sup> | 5q11.2 | 75(7.1％) | 123(15.20％) | -1.1 | 1.53e-8 | 6.64e-7 |
| GATA3<sup>b</sup> | 10p11 | 94(8.89％) | 136(16.81％) | -0.92 | 2.08e-7 | 7.19e-6 |
| CDH1<sup>b</sup> | 16q22.1 | 70(6.62％) | 102(12.61％) | -0.93 | 7.53e-6 | 2.17e-4 |
| DNAH11 | 7p21 | 120(11.35％) | 55(6.80％) | 0.74 | 4.73e-4 | 0.0117 |
| RB1<sup>b</sup> | 13q14.2 | 39(3.69％) | 10(1.24％) | 1.58 | 5.74e-4 | 0.0124 |
| GLDC | 9p22 | 29(2.74％) | 6(0.74％) | 1.89 | 9.06e-4 | 0.0174 |
| SYNE1<sup>b</sup> | 6q25 | 152(14.38％) | 80(9.89％) | 0.54 | 2.08e-3 | 0.0359 |
| AKAP9<sup>b</sup> | 7q21-22 | 81(7.66％) | 36(4.45％) | 0.78 | 2.73e-3 | 0.0429 |
注：a：CYB5D2 mRNA降低<-1.5SD水平；使用Curtis数据库(n＝817)确定与SigCYBDEGBC共同改变的突变；b：这些突变与CYB5D2下调共同改变；c：无变化组中改变组百分比/基于log2的比例；正和负的比率分别是共同的和相互独立的。
SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3特征性基因组的构建。
如前所述，我们发现源自CYB5D2所调节的，分子生物网络的生物标志物具有预估乳腺癌生存和预后的能力。我们使用R语言glmnet软件包中的Elastic-net程序进行协变量选择分析。我们分析了4981个差异表达基因对来源于Curtis数据库的乳腺癌患者生存期的影响。我们将参数α(α＝0和1分别为Ridge回归和Lasso回归)设置为0.8、0.5和0.2和10倍的交叉验证。通过这样的分析，我们获得了三个相关特征性基因组，它们分别是：包含36个基因的SigCYBDEGBC1，包含42个基因的SigCYBDEGBC2和包含50个基因的SigCYBDEGBC3(表4中的A-C)。SigCYBDEGBC1和SigCYBDEGBC2所含的基因在SigCYBDEGBC3基因组内(表4A-C)。所有三个基因组都与Curtis数据库和TCGA数据库中乳腺癌生存期(OS)缩短密切相关(图5中的A-C和6中的A-C)。并且，SigCYBDEGBC1，SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3也能用来预估低分化的恶性脑胶质瘤、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、乳头状肾细胞癌(pRCC)或肝细胞癌的死亡风险(图7，表5)；它们也能预估透明细胞肾细胞癌，乳头状肾细胞癌，前列腺癌和子宫体子宫内膜癌患者的无癌生存期的缩短(DFS)(图7，表5)。虽然所有三个特征性基因组与嫌色细胞肾细胞癌(chromophobe RCC)患者的乳腺癌生存期(OS)或无癌生存期(DFS)的缩短无显著相关性，但在这些特征性基因组阳性的嫌色细胞肾细胞癌中，在随访期间，出现7/8例患者死亡和7/9例患者癌症复发。这一点强烈表明所有三个特征性基因组能够预估由嫌色细胞肾细胞癌引起的远期死亡。
表4
表5
在肾癌中，透明细胞肾细胞癌是最具侵袭性，其次是乳头状肾细胞癌。嫌色细胞肾细胞癌死亡风险相对较低。目前，还没有生物标志物可用于评估肾癌死亡和癌症复发的风险。肝癌是最致命的癌症类型之一，是中国癌症死亡的主要原因。但是，目前还没有可用于预测肝癌进展和死亡的生物标志物。我们发现SigCYBDEGBC1，SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3可用于对透明细胞肾细胞癌，乳头状肾细胞癌，嫌色细胞肾细胞癌或肝细胞癌患者进行分层分组。可以把这类癌症分为死亡风险高和死亡风险低的两组。总的来说，这三个特征性基因组有可能成为多种不同癌症的生物标志物。
SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的验证。
我们首先使用Curtis数据库(表6)确定了这些特征性基因组中单个基因的系数，并且使用以下公式给每个患者给于特征性基因组评分：Σ(fi)n(fi：Cox系数，n＝患者中SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2或SigCYBDEGBC3的组成基因的数目)。对每位患者进行评分后，我们使用R语言中的Maxstat软件包(图8)估计切点(cutpoint)，并确定相应的四分位数1(Quartile 1)、中位数和Q3分数(表7)。Q1(>0)各组相当于对应的SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3组(表7)。对于获得SigCYBDEGBC1评分的肿瘤，肿瘤评分>0.33773的肿瘤指定为1，评分≤0.33773的肿瘤被指定为0。类似的，我们也对SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3评分进行转换，它们的分界点分别是1.09548和1.4581(表7)。根据评分≥和<Q1(>0)，中位数和Q3，我们把Q1、中位数和Q3肿瘤得分也分别转换为1和0。使用SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的分界点，肿瘤患者能非常有效的通过分层分组分为高风险组和低风险组；类似的各个Q1、中值和Q3评分也能进行了如此分析(表8)。然后，我们分析了各个分界点、Q1、中位数和Q3之间的分层效率。SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的分界点，中位数和Q3有效地将患者分层为高风险组和低风险组(图9-11)。分层的有效性按照Q3，cutpoint/Median和Q1从上到下排列(图9-11)。SigCYBDEGBC1的Q1在分层分组分析中不如SigCYBDEGBC2或SigCYBDEGBC3的Q1有效(图9-11)。总的来说，我们得到SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的有效分界点，中位数和Q3分数(图9-11)。此外，SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的所有单个组分基因可以非常有效的预测死亡风险(表6)。这些结果强烈支持SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3可以在临床中用来评估乳腺癌患者的死亡风险和治疗失败的风险。
表6
注：前21行基因以低于参照总体平均值的-1.5SD的水平表达，剩余基因以高于参考总体平均值2SD的水平表达；且**p<0.01,***p<0.001。
表7
| Signatures | cutpoint | Q1 | Median | Q3 |
| SigCYBDEGBC1 | 0.33773,p<2.2e-16 | 0 | 0.6375 | 1.6137 |
| SigCYBDEGBC2 | 1.09548,p<2.2e-16 | 0 | 0.7071 | 1.8543 |
| SigCYBDEGBC3 | 1.4581,p<2.2e-16 | 0 | 0.8299 | 2.1702 |
表8
SigCutpnt特征性基因组的构建。
为了进一步评估SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3以及设置可能用于临床的标准，我们分析了所有组分基因的mRNA水平对乳腺癌患者生存期的影响。由于SigCYBDEGBC3含有全部三个特征性基因组的所有基因(表4)，我们获取了其所有基因的mRNA水平和四个参照基因(ACTB、GAPDH、RPLP0和TFRC)的mRNA水平、随访数据、生存数据以及Curtis数据库中所有患者的治疗情况。我们将这些基因的mRNA水平根据四个参照基因的平均值进行了标准化转换。然后使用R语言中的Maxstat软件包确定它们的分界点，并以此数据把患者分为高和低死亡风险两组(表9)。在这50个基因中，35个基因的分界点可以用来显著区分具有较高死亡风险的患者，另外6个基因分界点的区分能力接近显著水平(p<0.05)(表9)。然后，根据基因表达≥和<分界点，我们将这41个基因表达量转换为0或1数值。使用二元基因表达分析(binary gene expression)，我们确定了这41个基因的风险比(Hazard Ratio)和Cox系数。我们发现4个基因与患者生存期缩短呈负相关。然后，我们将其余37个基因分组到SigCutpnt基因组中(表10)，并将所有正值二进制码“1”转换为相应的系数。每个患者的SigCutpnt得分使用以下公式确定：Σ(fi)n(fi：genex的Cox系数，n＝患者中SigCutpnt的成分基因的数目)。然后确定SigCutpnt的分界点、Q1、中值和Q3得分，并显示为二元分类公式。在评估乳腺癌患者的死亡风险中，使用源自分界点的二元表达数据分析可以获得同SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3一样可靠的结果(图9显示使用SigCYBDEGBC1进行乳腺癌患者的分层分析；图10显示使用SigCYBDEGBC2进行乳腺癌患者的分层分析；图11显示使用SigCYBDEGBC3进行乳腺癌患者的分层分析；)。在将患者分层为高风险组和低风险组(表8)时，使用Q1、中值和Q3二元分类公式和使用来源于SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的相应二进制编码是一样有效的。此外，SigCutpnt与脑胶质瘤、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌或子宫体子宫内膜癌的患者的乳腺癌生存期(OS)或无癌生存期(DFS)的缩短显著相关(表5)。此外，tROC(time-dependent receiver operating characteristic)分析显示SigCutpnt评分有效地区分死亡和生存。tAUC曲线(time-dependent areas under curve)的范围为73％到63.6％(图12)。在最初的49个月随访期内，评分能最有效地将死亡和生存分开，tAUC为73％(图12)。综上所述，从独立的角度分析发现，来源于SigCYBDEGBC3的，同样强大的SigCutpnt不仅能证实SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3有效性，而且为临床上，在根据这些基因的表达情况进行评估乳腺癌患者死亡风险时，提供了一个临床标准。
表9
注：加粗字体表述p值的分界点与OS的减少无显着相关；倾斜字体表示p值的分界点正在接近与OS减少的显着关联；且*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表10
SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt相互独立预测乳腺癌患者的死亡风险。
为了进一步评估这些特征性基因组，在根据诊断年龄、细胞性、整合簇(Integrative Cluster)、肿瘤组织学分级、Nottingham预后指数、肿瘤大小和肿瘤分期进行调整后，我们证实这些特征性基因组可以独立预测生存期的缩短(表11-14)。根据风险比(Hazard Ratio)，SigCutpnt在预测死亡风险方面优于SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3。当把四个特征性基因组和上述临床各个特征都包含在多变量分析中时，SigCutpnt仍然是一个独立的危险因子(表15)。这也表明SigCutpnt可以作为独立于SigCYBDEGBC1-3的生物标志物。这些结果进一步支持用于获得SigCutpnt的分界点的系统是独立于用于构建SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2和SigCYBDEGBC3的系统。因此，我们使用一个独立平台进一步验证SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt这些特征性基因组可以用做有效的生物标志物。
表11
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表12
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表13
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表14
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
表15
注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt在预测乳腺癌内在亚型的生存期的有效性。
基于基因表达谱将乳腺癌分类成内在亚型是目前乳腺癌研究的主要进展。因为该分类可以清楚地预估乳腺癌患者的死亡危险。在这方面，我们已经验证了如何有效的使用特征性基因组来预估不同乳腺癌内在亚型的生存期。四个特征性基因组可以有效地预估腺腔A(Luminal A)、腺腔B(Luminal B)和类正常型乳腺癌的生存期缩短。四个特征性基因组与基底细胞型乳腺癌生存期缩短没有关联，与低Claudin蛋白型乳腺癌生存期缩短有较弱的相关性。基底细胞型、Her2阳性型和低Claudin蛋白型比类正常型、腺腔A(Luminal A)和腺腔B(Luminal B)恶性程度更高。相对于用于预估后三种亚型的生存预后，这四个特征性基因组更能有效地预估整个Curtis数据库中的乳腺癌的生存期缩短。
构建用来评估乳腺癌内在亚型的特征性基因组。
Curtis数据库包含所有乳腺癌内在亚型、基底细胞型(n＝209)、Her2阳性型(n＝223)、低Claudin蛋白型(n＝218)、类正常型(n＝148)、腺腔A型(n＝475)和腺腔B型(700)。上述特征性基因组对预估个体内在亚型的有效性较低，这可以部分归因于它们是从分析整个Curtis数据库的乳腺癌，也就是包含各类亚型的乳腺癌，之后获得的特征性基因组。为解决这一局限性，我们使用协变量选择分析的方法分析了4981个乳腺癌内部亚型患者的差异表达基因。这些选择分析方法使用Elastic-net检验，α设置为0.5。通过这样的选择分析，我们获得了一系列特征性基因组。这些特征性基因组非常有效地预估除了Her2阳性乳腺癌之外的所有内在类型乳腺癌的死亡风险。
SigBasal特征性基因组
从4981个基因中，当基因表达水平低于参考群体平均值1.5SD时，我们可以获得包含ZNF311和TAX1BP1这两个基因的SigBasal特征性基因组(表16)。SigBasal同乳腺癌生存期缩短密切相关(图13)。SigBasal也可以非常有效的预估整个Curtis数据库中的乳腺癌(n＝1981)(图14中的A)、肝细胞癌(图14中的B)、皮肤黑素瘤(图14中的D)和肉瘤(图14中的E)的生存期缩短以及在TCGA数据库中乳腺癌的无癌生存期的缩短(图14中的C)。tROC显示SigBasal又可以用来区分基底细胞型乳腺癌患者的生存和死亡风险，它们的tAUC范围从60.7％至67.8％(图15)。这两种基因中任何一个基因表达的减少都可以有效预估基底细胞型患者的死亡风险(表17)。目前，这两种基因在乳腺癌肿瘤发生中并没有太多的研究(表16)。目前，还没有任何能用于预估基底细胞型乳腺癌死亡风险的生物标记物，SigBasal特征性基因组将是针对这类癌症非常新颖和重要的生物标记物。
表16
注：两个基因在-1.5SD水平下调。
表17
| 基因 | 相关系数 | HR | 95％CI | p值 |
| ZNF311 | 0.8045 | 2.236 | 1.513-3.302 | 5.29e-5*** |
| TAX1BP1 | 0.7001 | 2.014 | 1.332-3.044 | 0.000895*** |
注：***p<0.001。
SigClaudin特征性基因组
低Claudin蛋白型乳腺癌的特征性基因组――SigClaudin，由4个基因组成：表达下调-1.5SD的ZMYND12和NEBL基因以及表达上调+2SD的NFKBIB和UBL4A基因(表18)。SigClaudin与低Claudin蛋白型乳腺癌生存期缩短密切相关(图16)。这里tROC定义的tAUC范围从67.5％至75.4％(图17)。在整个Curtis数据库中，SigClaudin同乳腺癌、乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、食道癌、急性骨髓性白血病、肺鳞状细胞癌和皮肤黑素瘤生存期缩短显著相关。SigClaudin与前列腺癌，食道癌和睾丸生殖细胞癌的无癌生存期的缩短显著相关(表19)。SigClaudin中任何一个基因表达的变化都能有效预估低Claudin蛋白型乳腺癌的死亡风险(表20)。虽然有一篇报道表明乳腺癌中的NFKBIB基因上调，但SigClaudin中其它三个基因并没有相关报道。还没有相关的研究探讨这些基因在肿瘤发生中的作用。总的来说，我们这里发现了一个新特征性基因组，可以做为生物标记物，用来有效的评估低Claudin蛋白型乳腺癌的死亡风险。
表18
注：前两个基因以低于参考总体平均值-1.5SD的水平表达；后两个基因以高于参考总体平均值2SD的水平表示。
表19
表20
注：***p<0.0001。
SigNorm特征性基因组
我们构建了Curtis数据库中类正常型乳腺癌的13个基因的SigNorm特征性基因组。SigNorm由11个下调-1.5SD和2个上调+2SD的基因组成(表21)。SigNorm和类正常型乳腺癌生存期缩短显著相关(图18)。在tROC定义的类正常型乳腺癌中，其死亡和存活之间的区别在70.5-79％的范围内(图19)。在Curtis数据库中，SigNorm同乳腺癌、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、急性骨髓性白血病、胰腺癌和黑素瘤的生存期缩短显著相关。SigNorm也与透明细胞肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、子宫体子宫内膜癌、食管癌和甲状腺癌的无癌生存期的缩短显著相关(表22)。SigNorm中的任何一个基因的变化都可以有效地预测类正常型乳腺癌患者死亡风险(表23)。目前，SigNorm中的大多数基因在乳腺癌肿瘤发生和进展中所起的作用还没有报道(表21)。总的来说，我们这里确定了一个新的特征性基因组，可以用来非常有效地预估类正常型乳腺癌的预后。
表21
注：前11个基因以低于参考总体平均值-1.5SD的水平表达；后两个基因以高于参考总体平均值2SD的水平表示。
表22
表23
注：***p<0.0001。
SigLumB特征性基因组
从分析腺腔B型乳腺癌获得的SigLumB特征性基因组。它包括11个基因，其中4个下调的基因和7个上调的基因(表24)。SigLumB可以用来有效的预估腺腔B型乳腺癌患者生存期的缩短(图20)。在用来区分腺腔B型乳腺癌中对死亡和存活的预期时，tAUC范围从61.7％至64.7％(图21)。SigLumB同Curtis数据库中的乳腺癌、低分化脑胶质瘤、透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、皮肤黑色素瘤、肉瘤和甲状腺癌的生存期缩短显著相关(表25)。SigLumB也与低分化脑胶质瘤、透明细胞肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、葡萄膜黑素瘤、食管癌、肉瘤、胸腺瘤和甲状腺癌中的无癌生存期的缩短显著相关(表25)。SigLumB中的任何一个基因的变化都可以有效地预测腺腔B型患者死亡风险(表26)。SigLumB中的大多数基因尚未被证实在乳腺癌肿瘤发生和发展过程中起作用(表24)。总的来说，我们发现SigLumB特征性基因组对腺腔B型乳腺癌患者有着非常有效的预估效能。
表24
注：前4个基因以低于参考总体平均值-1.5SD的水平表达；后7个基因以高于参考总体平均值2SD的水平表示。
表25
表26
注：**p<0.01,***p<0.001。
SigLumA特征性基因组
我们分析了Curtis数据库内最大的乳腺癌内在亚型之后(n＝700)，得到了由36个基因组成的SigLumA特征性基因组。SigLumA所包含的基因中有20个基因表达下调，其中16个基因表达上调(表27)。SigLumA与腺腔A型乳腺癌的生存期缩短显著相关(图22)。在用来区别死亡和生存率时，它的tAUC的范围为65.5％-68.1％(图23)。在用来预估Curtis数据库和TCGA条件性数据库中的乳腺癌生存期缩短时，SigLumA的有效性同SigCYBDEGBC1-3和SigCutpnt是一样的(图24中的A，B)。SigLumA与透明细胞肾细胞癌，肝细胞癌和前列腺癌中生存期缩短显著相关。SigLumA也与以及透明细胞肾细胞癌，肝细胞癌，前列腺癌和胸腺瘤中无癌生存期的缩短显著相关(表29)。除VARS基因之外，SigLumA中的任何单个组分基因都能有效的预测腺腔A型乳腺癌死亡风险(表28)。目前，大多数SigLumA的基因在乳腺癌和肿瘤发生中起作用还不清楚(表27)。综合起来，我们发现SigLumA可以用做腺腔A型乳腺癌的非常有效的生物诊断标记。
表27
注：前5个基因以低于参考总体平均值-1.5SD的水平表达；后16个基因以高于参考总体平均值2SD的水平表示。
表28
表29
| Gene | Coef | HR | 95％CI | p-value |
| TMEM30B | 1.1036 | 3.015 | 1.552-5.857 | 0.00113** |
| LEF1 | 1.613 | 5.015 | 2.726-9.226 | 2.16e-7*** |
| NKD2 | 0.7067 | 2.027 | 1.385-2.967 | 0.000276*** |
| PIGV | 0.7834 | 2.189 | 1.488-3.22 | 6.95e-5*** |
| CTDSPL | 1.3127 | 3.716 | 2.032-6.798 | 2.04e-5*** |
| WDR19 | 2.1834 | 8.877 | 4.156-18.96 | 1.71e-8*** |
| C11ORF1 | 0.6214 | 1.867 | 1.354-2.574 | 0.00014*** |
| CRIPAK | 1.1144 | 3.048 | 1.57-5.916 | 0.000992*** |
| MICU2 | 0.4801 | 1.616 | 1.168-2.236 | 0.00373** |
| TACC1 | 0.5941 | 1.656 | 1.162-2.359 | 0.0053** |
| ANKRD12 | 0.5326 | 1.703 | 1.185-2.448 | 0.00401** |
| IMP3 | 0.5327 | 1.703 | 1.196-2.426 | 0.00314*** |
| SYTL1 | 0.7163 | 2.047 | 1.236-3.389 | 0.00536** |
| DET1 | 0.7277 | 2.07 | 1.287-3.331 | 0.00271** |
| FUZ | 1.055 | 2.872 | 1.61-5.122 | 0.000351*** |
| ADPRM | 0.4694 | 1.599 | 1.201-2.129 | 0.0013** |
| C1ORF123 | 0.7111 | 2.036 | 1.323-3.135 | 0.00124** |
| PCSK6 | 1.1294 | 3.094 | 1.533-6.245 | 0.00162** |
| ECE1 | 0.5516 | 1.736 | 1.08-2.791 | 0.0228* |
| SCN2B | 1.3025 | 3.678 | 1.735-7.796 | 0.000678*** |
| CA9 | 1.489 | 4.433 | 2.092-9.393 | 0.000102*** |
| OASL | 1.0605 | 2.888 | 1.538-5.423 | 0.000971*** |
| ZNF750 | 1.1053 | 3.02 | 1.556-5.863 | 0.00109** |
| VARS | 0.2165 | 1.242 | 0.5132-3.004 | 0.631 |
| TBC1D22B | 0.6467 | 1.909 | 1.071-3.401 | 0.0281* |
| ZNF683 | 1.048 | 2.852 | 1.564-5.202 | 0.000631*** |
| XRN1 | 1.1445 | 3.141 | 1.618-6.098 | 0.000721*** |
| IL12A | 0.6427 | 1.902 | 1.211-2.987 | 0.00527** |
| CHPF2 | 0.6097 | 2.033 | 1.191-3.473 | 0.00936** |
| OTOF | 0.7124 | 2.039 | 1.252-3.321 | 0.0042** |
| TRIM24 | 0.8992 | 2.458 | 1.411-4.28 | 0.00148** |
| CNOT10 | 1.0551 | 2.872 | 1.358-6.075 | 0.00577** |
| ARF1 | 0.6009 | 1.824 | 1.292-2.574 | 0.000629*** |
| ACTRT3 | 0.5877 | 1.8 | 1.089-2.874 | 0.0218* |
| CBR1 | 1.8769 | 6.533 | 2.888-14.78 | 6.6e-6*** |
| RAB3GAP2 | 0.947 | 2.578 | 1.1413-4.702 | 0.00201** |
注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
以上源自于分析乳腺癌内在亚型所获得的各类特征性基因组和基于整个Curtis数据库中的乳腺癌的特征性基因组是非常类似的。所有这些特征性基因组同整个Curtis数据库中的乳腺癌，以及乳腺癌各种内在亚型和其他类型癌症的生存期缩短显著相关。当然，这些特征性基因组之间也有明显的不同。在评估由内在亚型乳腺癌引起的死亡风险时，源自于乳腺癌内在亚型的特征性基因组比基于整个乳腺癌群体的特征性基因组更加有效。
本发明的制备方法具体包括：
组织培养和产生Tamoxifen抗性细胞
MCF7细胞购自美国ATCC细胞库。MCF7培养在DMEM培养基中，其中另外加入了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(Life Technologies、Burlington、ON)。为了获取Tamoxifen抗性细胞，我们在不含酚红的DMEM培养基中添加了1μM的Tamoxifen(Sigma Aldrich、Oakville、ON)，然后持续培养细胞12个月，最终获取Tamoxifen抗性细胞(TAM-R)。在后续的Tamoxifen抗性细胞培养中，我们持续监测并确认细胞对Tamoxifen抗性状态。
蛋白质印迹分析(Western Blot)
细胞裂解缓冲液成分是20mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％Triton X-100、25mM sodium pyrophosphate、1mM NaF、1mMβ-glycerophosphate、0.1mMsodium orthovanadate、1mM PMSF、2μg/ml leupeptin和10g/ml aprotinin(SigmaAldrich、Oakville、ON)。将总细胞裂解蛋白(50μg)加样到SDS-PAGE胶上，分离并转移到Amersham hybond ECL的硝酸纤维素膜上(Amersham、Baie d'Urfe、QC)。用5％脱脂乳封闭膜，然后在4℃下用抗CYB5D2抗体(1：1000)或者抗actin抗体(Santa Cruz，1：1000)温育过夜。使用HRP-conjugated的二抗和ECL Western印迹试剂盒显影(Amersham、Baie d'Urfe、QC)。用ImageJ软件(National Institutes of Health)定量蛋白条带。
TAM所致的细胞毒性的测定
将细胞培养在6孔板中(105个细胞/孔)，在不含酚红的DMEM培养基中培养2天，然后用3μM的TAM或者对照DMSO按1:1000稀释处理48小时。然后将细胞在没有TAM的竞争性培养基中培养96小时。细胞用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的固定液固定20分钟，最后用结晶紫溶液(0.5％结晶紫，20％甲醇，150mM NaCl)染色30分钟，将6孔板在水中洗涤并使其干燥，然后拍照。最后使用2mL 33％乙酸释放染色剂，通过测量550nm的吸光度进行染色的定量。
用TAM处理异种移植肿瘤
将四至五周龄的裸小鼠去除卵巢，接着插入0.72mg雌激素片。将3x106个MCF7细胞植入每只小鼠的侧腹，随后将动物分成两组。一半接受5mg的tamoxifen片，另一半作为对照。小鼠继续喂养28周或者直到小鼠生长达到其终末期――也就是肿瘤达到1000mm3大小。使用卡尺根据标准公式：L×W×0.52来确定肿瘤体积，其中L和W分别是最长和最短的直径。所有的小鼠实验都是根据麦克马斯特大学(McMaster University)动物研究伦理委员会批准的方案进行。
CYB5D2表达的免疫组织化学(IHC)分析
TAM处理过或者对照的异种移植肿瘤被用来制备载玻片。IHC染色方法同我们以前发表的文章一样。简而言之，将载玻片在二甲苯中脱蜡，在乙醇漂洗，并在有柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)的蒸锅中加热处理20分钟。CYB5D2抗体(1:600)在4℃温育过夜。随后根据制造商的方案加入生物素化的二抗和Vector ABC试剂(Vector Laboratories、Burlington、ON)。显色反应用二氨基联苯胺进行，并用hemotaxylin复染。使用ScanScope扫描载玻片，并使用ImageScope软件(Aperio、Vista、CA)进行分析。使用ImageScope软件获得评分，并根据公式[(HScore＝％positive X(intensity+1)]获得HScore。
ER启动子测定
使用Lipofectamine 2000(Life Technologies、Burlington、ON)进行细胞的质粒转染。转染的质粒包括ERE-luciferase reporter(Addgene、Cambridge、MA)，pCH110-lacZ和CYB5D2或GFP(绿色荧光蛋白)。48小时后，测定细胞裂解物中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。萤光素酶活性通过对比β-半乳糖苷酶活性进行标准化。
实时定量PCR分析
根据制造商的说明书，使用TRIZOL和Superscript II试剂(Life Technologies、Burlington、ON)进行RNA分离和逆转录成cDNA。简而言之，在65℃下，将2μg RNA加热6分钟，随后在冰上2分钟，25℃下11分钟，50℃下60分钟和70℃下15分钟。
实时定量PCR引物包括CYB5D2(F：5'-GACCGGGGACTGTTCTGAAG-3'；R：5'-TAGAACCGTCCTGTCACCCT-3')和actin(F：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'；R：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3')。在ABI 7500Fast Real-Time PCR System机器上(AppliedBiosystems，Burlington，ON)使用SYBR-green法，进行实时定量PCR。所有样品实验都重复三次。
CYB5D2 mRNA表达量的测定
通过分析OncomineTM软件内(Compendia Bioscience，Ann Arbor，MI)的TCGA，Curtis，Finak和Karnoub数据库可以获得CYB5D2 mRNA表达量。cBioPortal数据库(http:// www.cbioportal.org/)，包含Curtis和TCGA-Cell数据库。从Curtis和TCGA-Cell数据库中获取TP53，PIK3CA，GATA3，MAP3K1和其他基因的突变数据。多种统计学方法被用于检查CYB5D2表达及其与癌生存期的关联分析(参见统计分析部分)。从Curtis(n＝1980)和TCGA-Cell(n＝817)数据库中获取与CYB5D2存在协同改变的基因突变和基因表达的相关数据。
通路富集分析
使用R语言中的GAGE和Reactine软件包以及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)and GO(gene ontology)数据集中，分析差异表达基因(differentiated expression genes,DEG)的富集通路。
统计分析
我们使用R语言中的生存软件包和SPSS(SPSS Statistics 23版)软件进行Student's t检验，Kaplan-Meier生存曲线检验，log-rank检验，Receiver OpertatingCharacteristic(ROC)曲线检验，单因素和多因素Cox比例风险回归分析。我们还使用以下R语言中的软件包：time-dependent ROC(tROC)、Glmnet和Maxstat。p<0.05的值被认为是统计学显著性。
特征性基因组的构建
使用Cox回归模型导出由CYB5D2减少和一组基因组突变组成的特征性基因组。
21个基因组成的SigCYBDEGBC是通过分析共同出现在Curtis和TCGA-Cell数据库中的471个差异表达基因(DEGs)后获得。使用SPSS软件，我们把这些基因输入Cox模型，通过选择协变量的前向加法或后向消除来分析其对风险比(HR)的贡献，然后获取SigCYBDEGBC。
我们使用Elastic-net程序分析Metabric数据库中(n＝2509)的CYB5D2差异表达的4981个基因，然后从中推导出其余的特征性基因组。Elastic-net程序来自于R语言中glmnet软件包。用于构建这些特征性基因组的乳腺癌患者来源于Curtis数据库中的Metabric乳腺癌群体(cBioPortal)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种用于诊断或预估乳腺癌患者的死亡风险的生物标志物，其特征在于，由以下任意一组特征性基因组组成：SigCYBDEGBC、SigCYBDEGBC1、SigCYBDEGBC2、SigCYBDEGBC3和SigCutpnt；
所述SigCYBDEGBC由以下基因组成：APOD、NOSTRIN、SCUBE2、SLC40A1、SLC7A2、AFF3、CYB5D2、FBP1、STMND1、XBP1、C1ORF106、CALML5、CBX2、CCNE1、KIF1A、KRT16P3、LAD1、SLPI、TTK、UBE2C和S100A8；
所述SigCYBDEGBC1由以下基因组成：FGD3、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、TIPARP、MEF2D、SYTL1、TMEM218、ARL6IP5、APOM、USP35、CEP63、MGARP、PXK、NCCRP1、DDIT4、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、TRIB2、CKAP4、GSK3B、TBC1D31、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A和ZBTB9；
所述SigCYBDEGBC2由以下基因组成：ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11ORF1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、TMEM218、ARL6IP5、APOM、USP35、CEP63、MGARP、RPGRIP1、PXK、NCCRP1、NFIB、DDIT4、ZSWIM4、FAT1、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、CKAP4、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A、ZBTB9；
所述SigCYBDEGBC3由以下基因组成：FGD3、MFAP4、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11ORF1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、FAM102B、TMEM218、ARL6IP5、APOM、CCDC96、USP35、CEP63、MGARP、RPGRIP1、PXK、ZFYVE28、CALML5、NCCRP1、NFIB、DDIT4、ZSWIM4、FAT1、GLYATL2、DLL3、SLC52A2、IRX6、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、CKAP4、ATAD2、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、LAGE3、MTBP、GPI、NOLC1、MCU、TMEM138、MFSD2A、ZBTB9；
所述SigCutpnt由以下基因组成：FGD3、MFAP4、ITM2A、IDNK、PIGV、CD44、C11orf1、TIPARP、MEF2D、SYTL1、FAM102B、TMEM218、ARL6IP5、APOM、CCDC96、USP35、CEP63、MGARP、PXK、ZFYVE28、CALML5、NCCRP1、DDIT4、GLYATL2、SLC52A2、PDZK1IP1、STIP1、HIST1H4C、G6PD、RPS6KB2、TRIB2、ATAD2、GSK3B、TBC1D31、SLC19A1、GPI、NOLC1。
2.一种用于诊断或预估乳腺癌内在亚型患者的死亡风险的生物标志物，其特征在于，由以下任意一组特征性基因组组成：SigBasal、SigClaudin、SigNorm、SigLumB和SingLumA；
所述SigBasal用于评估基底细胞型乳腺癌患者死亡风险，由以下基因组成：ZNF311和TAX1BP1；
所述SigClaudin用于评估低Claudin蛋白型乳腺癌患者死亡风险，由以下基因组成：ZMYND12、NEBL、NFKBIB和UBL4A；
所述SigNorm用于评估类正常型乳腺癌患者死亡风险，由以下基因组成：HDDC3、EPHX2、MAP2K4、TBCK、MRPS14、SPAG7、UBE2W、ZNF18、CHM、CEP63、TTC30B、GLYATL2和MTA2；
所述SigLumB用于评估腺腔型B乳腺癌患者死亡风险，由以下基因组成：TRIM4、PLPBP、DCTN6、EIF3J、HRK、PDCD2L、MTBP、PPP6R1、TSPAN14、CNOT10和IQGAP3；
所述SingLumA用于评估腺腔型A乳腺癌患者死亡风险，由以下基因组成：TMEM30B、LEF1、NKD2、PIGV、CTDSPL、WDR19、C11ORF1、CRIPAK、MICU2、TACC1、ANKRD12、IMP3、SYTL1、DET1、FUZ、ADPRM、C1ORF123、PCSK6、ECE1、SCN2B、CA9、OASL、ZNF750、VARS、TBC1D22B、ZNF683、XRN1、IL12A、CHPF2、OTOF、TRIM24、CNOT10、ARF1、ACTRT3、CBR1和RAB3GAP2。
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