CN108396011A - 抗羟考酮单克隆抗体、杂交瘤细胞株的制备及其应用 - Google Patents

抗羟考酮单克隆抗体、杂交瘤细胞株的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗羟考酮单克隆抗体、杂交瘤细胞株的制备及其应用。用本发明偶联的羟考酮人工抗原免疫动物制备可用于制备抗羟考酮的单克隆抗体，并采用快速免疫的方法，缩短免疫时间；免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，用与载体蛋白偶联的羟考酮作为包被抗原筛选阳性杂交瘤细胞、经细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗羟考酮抗体的杂交瘤细胞，并用改良的辛酸‑硫铵法制备腹水单抗。制备的抗体可用于具有高度特异性、灵敏性和精确性的免疫胶体金试剂盒。本发明提供的羟考酮与载体蛋白偶联产物及羟考酮抗体的制备方法，可为快速检测羟考酮药物滥用服务。

Description

抗羟考酮单克隆抗体、杂交瘤细胞株的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗羟考酮单克隆抗体、分泌产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该杂交瘤细胞株的制备方法。
背景技术
羟考酮(oxycodone)是从生物碱蒂巴因(thebaine)中提取的半合成阿片类药物，具有镇痛,抗焦虑及镇静作用，在临床上作为强效镇痛药应用已有百年左右。羟考酮作为半合成的纯阿片受体激动药，其药理作用及作用机制与吗啡相似，主要通过激动中枢神经系统内的阿片受体而起镇痛作用，镇痛效力中等。大剂量或过量使用时，羟考酮可引起浅度呼吸抑制、嗜睡、昏睡或昏迷、骨骼肌松弛。由于羟考酮生物利用度高，给药途径多，因而在临床上应用广泛。可用于缓解中至重度疼痛，如关节痛、背痛、癌性疼痛、牙痛、手术后疼痛，但在临床发现在高剂量连续使用羟考酮后，突然中断或减量，部分病人有戒断综合征的发生，中国已将其列入麻醉药品管制范围。
由于羟考酮药物滥用，会威胁人类健康。目前，对羟考酮的分析研究多采用血液、尿液、唾液等生物检材。胶体金免疫层析法(GICA)是近年来迅速发展起来的一种新型的免疫方法，该法克服了传统仪器检测速度慢和不能高通量或进行现场检测的弱点，而且无需专业技术人员操作，是目前进行高通量或进行现场检测的最佳方法。与传统的检测方法相比较，具有收集方便，随取随检，而且几乎无侵入性，容易监督防止作假等,满足公安、征兵、出入境、戒毒所等毒品检测的需要。
发明内容
本发明首先提供了一种产生抗羟考酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株OXY 2A1。
命名为羟考酮特异性淋巴细胞杂交瘤株。该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201729，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
此外，所述抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1由小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，其产生的抗羟考酮单克隆抗体与羟考酮抗原有高特异性，高灵敏度，且抗体亲和力高。
本发明还提供了一种制备权利要求1所述杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，该包括如下步骤：
(1)将羟考酮与牛血清白蛋白交联得到羟考酮免疫抗原，即羟考酮-牛血清白蛋白，作为人工抗原；
(2)用所述羟考酮-牛血清白蛋白，通过快速免疫法免疫6-8周龄的Balb/C雌鼠；
(3)取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养液筛选所得的融合细胞，选择阳性细胞株；
(4)将步骤(3)所得的阳性细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水；
(5)用改进的辛酸-硫铵法纯化所述腹水，从而获得高特异性，高灵敏度的羟考酮单克隆抗体；
(6)将融合后的羟考酮单克隆抗体进行筛选，筛选出若干个效价最高的羟考酮单克隆抗体做克隆化培养直至单克隆抗体检测阳性率多次达到100％，即可得到一株稳定分泌专一性的抗羟考酮单克隆抗体的抗羟考酮杂交瘤细胞株。
进一步的，步骤(1)中，以羟考酮盐酸盐为原料，与三溴化硼进行反应得到含羟基的羟考酮半抗原，再与溴乙酸乙酯进行亲和取代反应，得到含羧基的羟考酮半抗原；
并通过碳二亚胺法使羟考酮半抗原与牛血清蛋白结合制备羟考酮人工抗原，即羟考酮-牛血清蛋白。
羟考酮人工抗原合成路线如下所示：
进一步的，步骤(2)中，将羟考酮人工抗原(1mg/ml)与氢氧化铝佐剂按1：1的体积通过注射器混匀，并乳化完全，选择6-8周龄的BALB/c雌鼠进行首次皮下免疫，免疫4只小鼠，每只小鼠注射100ul佐剂，每隔7天免疫一次，皮下和腹腔交替进行，免疫3次后，加强免疫。该免疫方法为快速免疫法，首次免疫后，每隔7天免疫一次，皮下和腹腔交替进行，在第30天进行细胞融合。缩短免疫时间，节约抗原的用量。
进一步的，步骤(3)中，在小鼠进行首次免疫后第30天进行细胞融合，包括以下步骤：
S1制备饲养细胞的细胞悬液；
S2培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；
S3制备脾细胞；
S4采用聚乙二醇融合法，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴预热1min，加入1ml 37℃预温的PEG 4000，90s内加完，然后静止1min，在1min内加入1ml DMEM无血清培养液，之后直接加入DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，弃上清；然后用HAT培养基重悬沉淀并加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，铺板12块，置于 37℃，5﹪CO2培养箱中培养，HAT选择培养液维持培养一周后，改用HT培养液，再维持培养一周，改用一般培养液。
进一步的，步骤(5)的详细步骤为：
取1份预处理过的腹水加2份60mmol/L PH4.0的乙酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2 小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；
不透析，直接将上清经滤纸过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；
在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；
沉淀溶于适量PBS(含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA)中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心 30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
进一步的，步骤(6)包括以下步骤：
初筛：
融合细胞隔7天后半换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；
复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株OXY做亚克隆培养；
杂交瘤细胞株OXY的克隆化：
杂交瘤细胞株OXY的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含20 ﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的抗羟考酮单克隆抗体，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗羟考酮抗体的抗羟考酮单克隆细胞，命名为抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1。
本发明又提供了一种抗羟考酮单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO.C201729的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1分泌产生。
本发明再提供了一种抗羟考酮单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将单克隆细胞株XOY 2A1用含体积分数为20﹪FBS的DMEM培养基接种到24 孔细胞培养板中，培养1-2天后接种到小号细胞培养瓶中，在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/2视野时,接种到大号细胞培养瓶中，培养1-2天后，观察细胞生长在对数期，离心收集杂交瘤细胞；
用0.9％的生理盐水稀释，注射到已注射液体石蜡1周的小鼠腹腔内，每只注射1 ×106个杂交瘤细胞；
约7-10天后，小鼠腹部明显涨大，此时用75％的乙醇消毒腹部，用注射针头收集腹水。
本发明最后提供了一种用于检测羟考酮的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为 CCTCCNO.C201729的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1分泌产生的抗羟考酮单克隆抗体。
(2)包被有羟考酮-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。
本发明所述的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1分泌产量高，其分泌得到的抗羟考酮单克隆抗体具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点，适用于20ng/ml 阈值的唾液检测。
附图说明
图1为本发明不同浓度下实施例2制备的抗羟考酮单克隆抗体的OD450 值；
图2为羟考酮抗体2A1，7F6，9H2三个单克隆抗体腹水相比较示意图。
具体实施方式
以下对本发明作进一步阐述。
实施例一：
一种能产生抗羟考酮单克隆抗体的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1，所述抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1由小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，其产生的抗羟考酮单克隆抗体与羟考酮抗原有高特异性，高灵敏度，且抗体亲和力高.
实施例二：羟考酮人工抗原的制备
2.1羟考酮半抗原的制备：以羟考酮盐酸盐为原料，与三溴化硼进行反应得到含羟基的羟考酮半抗原，再与溴乙酸乙酯进行亲和取代反应，得到含羧基的羟考酮半抗原。
具体的，将羟考酮盐酸盐1g溶于10ml水，用浓氨水调pH为10，有大量固体析出，将其置于4℃静置30分钟后，以10000转/分钟离心，去除清液，固体用20ml无水乙醇转移至圆底烧瓶中，50℃减压浓缩得到905mg白色固体羟考酮。
取703.66mg(2mmol)羟考酮置于250ml茄形瓶中，加入40ml无水二氯甲垸，摇匀使其溶解，氮气保护下将其置于冰浴中，搅拌10-15min；同时，将 3.76ml三溴化硼溶解于40ml无水二氯甲垸中，配制成lmol/L的三溴化硼-二氯甲垸溶液待用。待茄形瓶内温度恒定时，将配制好的三溴化硼-二氯甲垸溶液置于恒压滴液漏斗中，缓滴于冰浴中搅拌着的茄形瓶中，30min中滴完。滴完后撤去冰浴，室温反应4h。
室温反应完成后，将反应体系倒入搅拌着的饱和碳酸氢钠溶液90ml中搅拌lh，然后再整体转移到90ml水中搅拌lh；抽滤，滤饼用水洗涤多次，滤液用2mol/L的盐酸调至中性后再次产生沉淀，将产生的沉淀抽滤后，合并两次滤饼，真空干燥器干燥过夜后，得到653mg白色固体产物II。
250ml三口烧瓶中，602.66mg(2mmol)羟考酮和20ml DMF加入，氮气保护下，加入528mg(4mmol)碳酸钾和368mg(2.2mmol)4-溴乙酸乙酯。加完后升至80℃反应过夜，冷至室温，过滤，滤液中加入60ml水，分别用3×100ml 乙酸乙酯萃取，有机层再依次用60ml饱和食盐水洗涤，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得581mg黄色固体化合物Ⅲ。
250ml单口烧瓶中，581mg(1.5mmol)化合物Ⅲ和36mL甲醇加入，再加入氢氧化钠水溶液(820mg氢氧化钠于8.2ml水)。加完后室温反应过夜，TLC跟踪反应完全。用1M的盐酸调pH为7。减压浓缩蒸干，残渣用吡啶提取得467mg 淡黄色固体化合物Ⅳ。
2.2羟考酮人工抗原的制备：通过碳二亚胺法使羟考酮半抗原与牛血清蛋白(BSA)结合制备羟考酮人工抗原，即羟考酮-牛血清蛋白。
100ml单口烧瓶中，467mg(1.3mmol)化合物Ⅳ和11ml DMF加入，搅拌10min后，再依次加入149.7mg(1.3mmol)NHS和268mg(1.3mmol)DCC。加完后室温反应过夜，将反应液离心，取上层清液，记为A液。将1.3g牛血清蛋白BSA溶于66ml pH为7.2、0.1M的PBS缓冲液中,记为B液。4℃时，在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液中，滴完，4℃反应过夜。将反应液置入pH为7.2、0.1M的PBS缓冲液中进行透析三天，期间每天换缓冲液两次。透析结束后，将反应液离心，取上层清液即为羟考酮人工抗原V。
实施例三：抗羟考酮单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
3.1小鼠免疫
将羟考酮人工抗原(1mg/ml)与氢氧化铝佐剂按1：1的体积通过注射器混匀，并乳化完全，选择6-8周龄的BALB/c雌鼠进行首次皮下免疫，免疫4只小鼠，每只小鼠注射100ul佐剂。每隔7天免疫一次，皮下和腹腔交替进行，免疫3次后，加强免疫，在第30天进行细胞融合。
3.2脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
3.2.1饲养细胞制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于75﹪酒精中消毒5min，固定于泡沫板上，剪开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，在腹腔中注入37℃预热的DMEM 无血清培养基5ml，轻揉小鼠腹腔1分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后过滤收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
3.2.2小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0处于对数生长期，并在前一天换液以保证生长状态良好用于细胞融合。
3.2.3脾细胞制备：取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死，泡75％的酒精中消毒5min后剖腹，无菌取出脾脏。用不完全的培养基洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液，铜网过滤后离心，弃上清用无血清培养液重复离心一次，待用。
3.2.4脾细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴预热 1min，加入1ml 37℃预温的PEG 4000，90s内加完，然后静止1min。在1min 内加入1ml DMEM无血清培养液，之后直接加入DMEM无血清培养液终止PEG 作用；离心，弃上清；然后用HAT培养基重悬沉淀并加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，铺板12块，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养。HAT选择培养液维持培养一周后，改用HT培养液，再维持培养一周，改用一般培养液。
3.3杂交瘤细胞的筛选
3.3.1初筛：
融合细胞隔7天后半换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3.3.2复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株OXY做亚克隆培养。
3.3.3杂交瘤细胞株OXY的克隆化：
杂交瘤细胞株OXY的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含20 ﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的单克隆，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗体的的抗羟考酮单克隆细胞，命名为抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1(保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏号CCTCC NO.C201729)，扩大培养后进行羟考酮单克隆抗体纯化。
3.4抗羟考酮单克隆抗体制备与纯化
3.4.1羟考酮单克隆抗体制备
采用动物体内诱生法-腹水制备法。将筛选到的单克隆细胞株OXY用含体积分数为20﹪FBS的DMEM培养基接种到24孔细胞培养板中，培养1-2天后接种到小号细胞培养瓶中，在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/2视野时,接种到大号细胞培养瓶中，培养1-2天后，观察细胞生长在对数期，离心收集杂交瘤细胞。用0.9％的生理盐水稀释，注射到已注射液体石蜡1周的小鼠腹腔内，每只注射1×106个杂交瘤细胞。约7-10天后，小鼠腹部明显涨大，此时用75％的乙醇消毒腹部，用注射针头收集腹水。
3.4.2羟考酮单克隆抗体纯化—改进的辛酸-硫铵法
取1份预处理过的腹水加2份60mmol/L PH4.0的乙酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2 小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；不透析，直接将上清经滤纸过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS(含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA) 中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
实施例四：抗羟考酮单克隆抗体的性能检测
4.1细胞培养液上清、腹水效价测定和亚类鉴定
参照单克隆抗体分型试剂盒对实施例1制备的抗羟考酮单克隆抗体进行细胞培养液上清和亚类鉴定，见表1
表1细胞培养液上清和亚类鉴定
2A1 7F6 9H2
细胞培养液上清 1:6400 1:3200 1:1600
抗体亚类 IgG1 IgG1 IgG2b
抗羟考酮单克隆抗体2A1,7F6,9H2相比，细胞培养基上清效价最高的是2A1，效价达到1:6400，抗体的亚类为IgG1。
4.2抗羟考酮单克隆抗体腹水反应活性测试
间接ELISA方法检测实施例2制备的抗羟考酮单克隆抗体2A1，7F6，9H2，测定其OD450值，以抗羟考酮单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值。如图1所示为不同浓度下实施例2制备的抗羟考酮单克隆抗体的OD450 值。
如图2所示，羟考酮抗体2A1，7F6，9H2三个单克隆抗体腹水相比较， 2A1的活性最佳且抗体反应活性可以到达0.0005μg/ml。
羟考酮单克隆抗体反应活性，2A1>7F6>9H2.
表3羟考酮单克隆抗体反应活性
4.3羟考酮单克隆抗体灵敏度检测
用胶体金竞争免疫亲和层析方法进行灵敏度的测定，在最佳的浓度下将 OXY-BSA划膜于尼龙膜上，胶体金标记纯化的单抗，制备免疫亲和层析条。同时，配制5-1000ng/ml不同浓度的标准品，测试3种不同抗体制备的胶体金检测条，结果呈阳性的最低样品的浓度即为该抗体的灵敏度。
表3羟考酮单克隆抗体灵敏度检测
金标法检测羟考酮的灵敏度结果显示，OXY 2A1抗体的灵敏度可以达到 20ng/ml，而7F6,9H2抗体的灵敏度为50ng/ml。
4.4抗羟考酮单克隆抗体2A1的亲和力常数测定
用抗体竞争结合抗原测定亲和力实施例
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释羟考酮单克隆抗体(OXY-BSA) 至1μg/ml，然后在96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的羟考酮人工抗原，4℃包被过夜(2块板)；然后用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；②每孔中加入200μl含1％BSA的0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，置37℃ 60分钟，再用0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干备用；③取纯化后的抗体配制5ml浓度为2.5*10-10mol/L和5ml浓度为36*10-10mol/L的羟考酮抗原，然后将羟考酮抗原向下倍比稀释，取等体积的抗体分别与8个浓度抗原混合得8 个待测样，37℃孵育60分钟。④以每孔100μl将8个待测样加入到已包被的酶标板中，置37℃60分钟，将孵育后的剩余液体加到另一块板中孵育60分钟，用 0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板5次；⑤将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP 稀释到4000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠 IgG-HRP，37℃反应60分钟，用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；⑤每孔加入50μl底物TMB 37℃反应8分钟后，用浓度为2M的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值.然后根据亲和力常数计算公式:Kd(i0-a0B)＝B/(1-B)求得亲和力Kd值，其中a0为抗体初始浓度，i0为抗原初始浓度，B是抗体结合率， B＝(A0-Ai)/A0,A0和Ai分别为检测初始抗体和已结合抗原的抗体的D450值。单抗2A1的亲和力常数为0.334×10-10mol/L。
表4在不同浓度抗体竞争下的抗原结合率
ELISA检测结果显示，该羟考酮单克隆抗体亲和力常数为0.334×10-10mol/L，亲和力较高，可用于羟考酮唾液检测试剂盒制备。
4.5改进的辛酸-硫铵法对反应活性的影响
将改进的辛酸-硫铵法与传统的方法进行比较，在反应活性，灵敏度方面的影响。如表5所示，改进的辛酸法在纯化时间上相比于传统方法可以缩短一半，而不影响其反应活性及灵敏度，从而缩短纯化时间，提高的纯化效率。
表5改进的辛酸-硫铵法与传统的纯化方法的比较
综上所诉，本实验筛选得到的OXY 2A1细胞株具有较高的特异性，及亲和力，可用于羟考酮唾液检测试剂盒的制备。检测灵敏度达到20ng/mL，并且与100μ g/ml的纳曲酮、丁丙诺啡样品，50μg/ml的纳洛酮样品，100μg/ml的甲基安非他明、麻黄碱、伪麻黄碱、可卡因、地西泮、苯巴比妥、氯胺酮、美沙酮、曲马多、加替沙星、普鲁卡因，浓度为10μg/ml的Δ9-四氢大麻酚酸等非阿片类毒品的样品以及阴性唾液样本均不发生交叉反应。

Claims (10)

1.一种产生抗羟考酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株OXY 2A1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201729。
2.一种制备权利要求1所述杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）将羟考酮与牛血清白蛋白交联得到羟考酮免疫抗原，即羟考酮-牛血清白蛋白，作为人工抗原；
（2）用所述羟考酮-牛血清白蛋白，通过快速免疫法免疫6-8周龄的Balb/C雌鼠；
（3）取所述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养液筛选所得的融合细胞，选择阳性细胞株；
（4） 将步骤（3）所得的阳性细胞株注入同系小鼠腹腔诱生腹水；
（5） 用辛酸-硫铵法纯化所述腹水，从而获得高特异性，高灵敏度的羟考酮单克隆抗体；
（6）将融合后的羟考酮单克隆抗体进行筛选，筛选出若干个效价最高的羟考酮单克隆抗体做克隆化培养直至单克隆抗体检测阳性率多次达到100%，即可得到一株稳定分泌专一性的抗羟考酮单克隆抗体的抗羟考酮杂交瘤细胞株。
3.如权利要求2所述的制备杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于步骤（1）中，以羟考酮盐酸盐为原料，与三溴化硼进行反应得到含羟基的羟考酮半抗原，再与溴乙酸乙酯进行亲和取代反应，得到含羧基的羟考酮半抗原；
并通过碳二亚胺法使羟考酮半抗原与牛血清蛋白结合制备羟考酮人工抗原，即羟考酮-牛血清蛋白。
4.如权利要求2所述的制备杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于步骤（2）中，将羟考酮人工抗原与氢氧化铝佐剂按1：1的体积通过注射器混匀，并乳化完全，选择6-8周龄的BALB/c雌鼠进行首次皮下免疫，免疫4只小鼠，每只小鼠注射100ul佐剂，每隔7天免疫一次，皮下和腹腔交替进行，免疫3次后，加强免疫。
5.如权利要求2所述的制备杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于步骤（3）中，在小鼠进行首次免疫后第30天进行细胞融合，包括以下步骤：
S1 制备饲养细胞的细胞悬液；
S2培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；
S3制备脾细胞；
S4采用聚乙二醇融合法，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴预热1min，加入1ml 37℃预温的PEG 4000，90s内加完，然后静止1min，在1min内加入1ml DMEM无血清培养液，之后直接加入DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，弃上清；然后用HAT培养基重悬沉淀并加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，铺板12块，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养，HAT选择培养液维持培养一周后，改用HT培养液，再维持培养一周，改用一般培养液。
6.如权利要求2所述的制备杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于步骤（5）的详细步骤为：
取1份预处理过的腹水加2份60mmol/L PH4.0的乙酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；
不透析，直接将上清经滤纸过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；
在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；
沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。
7.如权利要求2所述的制备杂交瘤细胞株OXY 2A1的方法，其特征在于步骤（6）包括以下步骤：
初筛：
融合细胞隔7天后半换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；
复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株OXY做亚克隆培养；
杂交瘤细胞株OXY的克隆化：
杂交瘤细胞株OXY的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含20﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的抗羟考酮单克隆抗体，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗羟考酮抗体的抗羟考酮单克隆细胞，命名为抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1。
8.抗羟考酮单克隆抗体，其特征在于它是由保藏号为CCTCC NO.C201729的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1分泌产生。
9.一种抗羟考酮单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
将单克隆细胞株XOY 2A1用含体积分数为20﹪FBS的DMEM培养基接种到24孔细胞培养板中，培养1-2天后接种到小号细胞培养瓶中，在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/2视野时,接种到大号细胞培养瓶中，培养1-2天后，观察细胞生长在对数期，离心收集杂交瘤细胞；
用0.9%的生理盐水稀释，注射到已注射液体石蜡1周的小鼠腹腔内，每只注射1×106个杂交瘤细胞；
约7-10天后，小鼠腹部明显涨大，此时用75%的乙醇消毒腹部，用注射针头收集腹水。
10.一种用于检测羟考酮的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
（1）携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为CCTCCNO.C201729的抗羟考酮杂交瘤细胞株OXY 2A1分泌产生的抗羟考酮单克隆抗体；
（2）包被有羟考酮-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。
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