CN108384708A - 一种种子罐无菌可控量型接种装置及用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物发酵或细胞培养技术领域，具体涉及一种种子罐无菌可控量型接种装置及用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法，尤其适合于菌球型或易产生菌球性菌种、高黏度型菌液、无抗菌能力易染菌型菌种。该接种装置组成部分一种种子罐无菌可控量型接种装置，该接种装置组成部分包括：用于盛装目标菌液的菌种瓶套装、种子罐、连锁接种阀门装置、高压蒸汽以及压缩空气接入端。全套装置均可灭菌，操作简便、低成本、高效果、接近零风险，无机械损伤不影响菌种细胞，可适用标准化规程操作，有利于提高生产效率、降低人为差错和稳定质量控制。

Description

一种种子罐无菌可控量型接种装置及用于发酵或培养的无菌 可控量型接种方法

技术领域

本发明属于生物发酵或细胞培养技术领域，具体涉及一种种子罐无菌可控量型接种装置及用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法，尤其适合于菌球型或易产生菌球性菌种、高黏度型菌液、无抗菌能力易染菌型菌种。

背景技术

生物发酵或细胞培养过程中，其一应工艺要求和菌种特性等，对菌种接种比有严格要求，尤其个别行业如制药行业对接入量有明确要求且要求准确定量等；其二部分菌种特性导致其为菌球型或易结球、菌液黏度大，接种难度大；其三部分菌种无抗菌能力，属于营养型，生命力脆弱、极易染菌，不同于抗生素类等有一定抗菌能力。

实际工作过程中，一般较为常用的方法为：火焰接种法、压差瓶式接种法和针式蠕动泵接种法，这几种方法设备要求低，但存在部分缺陷，如接种量不可控，不能满足现代发酵行业愈发严格的质量可控要求，如部分菌种使用蠕动泵类方法效果不理想，如高黏度、大菌球，如无菌能力不足，存在较大染菌风险。因而极有必要开发一种高无菌性能、接种量可控、广泛适用各类菌种的接种装置和方法，从而为生物发酵或细胞培养领域质量可控、培养稳定、零接种染菌提供有效保障。

发明内容

本发明主要目的在于提供一种种子罐无菌可控量型接种装置及用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法，方便于菌种接种时预防染菌风险、把控工艺接种量或/和解决特殊菌种接种难问题，为生物发酵和细胞培养过程提供保障。

本发明所采取的技术方案详述如下：

一种种子罐无菌可控量型接种装置，该接种装置组成部分包括：用于盛装目标菌液的菌种瓶套装、种子罐、连锁接种阀门装置、高压蒸汽以及压缩空气接入端；其特征在于：

所述菌种瓶套装包括菌种瓶瓶体（16）、可与瓶身拆解和密封连接的瓶盖（12）、双口贯通板（13）、垫片（14），所述双口贯通板（13）有第一管路和第二管路两根贯通管路接口，其中第一管路内侧（10）连接软管（15），所述第一管路的外侧（31）连接软管（2），末端连接宝塔头（3）、三通隔膜阀（6），再与连锁接种阀门装置相连；其中第二管路瓶内侧不连接，在瓶外侧（9）通过外侧连接软管（1），与压缩空气管路软管连接进行接种；优选地，通过外侧连接软管（1）连接无菌过滤滤芯（11），滤芯两侧均具有软管连接口，另一端可与压缩空气管路软管连接进行接种；

所述连锁接种阀门装置包括L型三通隔膜阀主阀（27）、数个配套隔膜阀（19、23）、疏水阀（24）、蒸汽进出管路、菌种瓶套装接入区替代弯头（30）及与种子罐连接装置（17、25）；L型三通隔膜阀主阀单通端（18）通过种子罐连接装置与种子罐罐顶接口（17）相连；所述L型三通隔膜阀主阀L型端双口的第一口（20）连接隔膜阀（19），再通过管路连接到高压蒸汽供气端，所述双口的第二口（28）顺序连接菌种瓶套装接入区替代弯头（30）、隔膜阀（23），再通过管路连接疏水阀门（24），再连接至排废管路；

其中所述菌种瓶套装接入区替代弯头（30）在种子罐灭菌时安装，用以替代菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接种时将其替换为菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接入区两个接口与阀门L型端两口分别相连，通过穿过无菌滤芯（11）压缩空气提供动力，使菌种由移种瓶（16），依次流经菌种瓶套装软管（15、10、2、3）、套装三通阀门（6）、连锁接种阀门装置，在绝对无菌状态下进入种子罐。

优选地，所述双口贯通板（13）及贯通管路接口为一体式，优选采用不锈钢、硅胶、四氟材质。

优选地，所述各个软管采用硅胶管、或热塑性硅胶管。

优选地，所述菌种瓶瓶体采用蓝盖瓶、可承压玻璃瓶、或不锈钢瓶。

优选地，还包括保温装置，用于保护菌种不受外界环境干扰，优选采用便携式冷藏箱、便携式恒温箱、泡沫箱加冰、水浴。

优选地，所述L型三通隔膜阀主阀（27）单通端通过种子罐连接装置与种子罐罐顶接口相连，其中采用螺纹O型圈、螺纹垫片、卡箍垫片、耐压软管或直接焊接连接方式连接。

优选地，所述排废管路的材质不锈钢材质。

本发明还提供利用上述种子罐无菌可控量型接种装置的用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1) 连锁接种阀门装置与种子罐连接并随同种子罐灭菌同时灭菌；

2) 菌种瓶套装在灭菌设备中灭菌，关闭套装L型三通隔膜阀（6）的阀门，然后在无菌洁净设备中进行菌种转移，菌种转入菌种瓶套装装置中；

3) 带菌种菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6）去除牛皮纸纱布后，接入连锁接种阀门装置预留接入区，替换掉弯头（30），进行接入区灭菌，任选地在所述过程中菌种瓶放入保温装置保温；

4) 灭菌完成后，关闭进出蒸汽阀门（19、23），种子罐泄压，空气滤芯（11）一端与压缩空气管路相连，打开两个L型三通阀门（27、6），使用压缩空气将菌种压入种子罐，通过压缩空气气阀、L型三通阀门（6）和移种瓶（16）液位控制菌种进入量；

5) 关闭L型隔膜主阀（27），使用弯头（30）替换接入区L型三通阀门（6），进行连锁接种阀门装置二次灭菌。

优选地，所述灭菌为121.0℃灭菌30min，优选采用脉动真空灭菌器。

优选地，所述第4)步中采用0.01~0.4MPa压缩空气将菌种压入种子罐。

本发明的主要高效有益效果体现在以下三个方面：

1）使用菌种瓶标示刻度，接种时可根据工艺要求准确移种至菌种瓶，或使用阀门控制进入量，便于工艺产品质量可控，提高工作效率，并可以节省菌种降低菌种浪费量；

2）本发明所提供装置及方法，具有高安全性、极低染菌概率有点，从而可在生产过程中使用统一模式安装和使用，降低普通方法中易受到人为经验、手法等因素影响，尤为适用于无抗菌能力、极易染菌菌种发酵，可实现高效、低风险、标准化，确保高标准产品产出；

3）本发明所提供装置及方法尤为适用于易结球、需结球、高黏度的菌种，这类菌种易堵塞针头、细管路等，使用蠕动泵类设备效果不理想或难度大等，本装置使用阀门，管路可随阀门适当增大，在绝对无菌情况下取代高风险针式接种法，同时规避局部直径小的风险；使用压缩空气通过滤芯过滤，低压力差就可以将菌种压入种子罐，同时也降低了对菌种挤压造成的剪切等损伤，保护菌种特性。

综上所述，本发明所提供的接种装置，设计合理新颖，符合现代生物行业愈发严格的高标准、标准化的要求，能较为优秀的满足便捷型、规范化、高安全性、极低风险和有效性，并最大程度降低移种对菌种的破坏，适合于生产普及化。对接种操作机械化、现代标准化、低成本高效率具有巨大应用意义，同时为生物领域的无菌化和质量可控提供优秀保障，对于提高生产效率、降低人为差错和稳定质量控制有着明显的实用价值和广泛的应用推广意义。

附图说明

图1为本发明种子罐无菌可控量型接种装置中菌种瓶套装结构正视分解示意图；

图2为本发明种子罐无菌可控量型接种装置中连锁接种阀门装置结构俯视示意图；

图3为本发明种子罐无菌可控量型接种装置中连锁接种阀门装置与种子罐罐顶连接结构正视示意图；

图4为本发明种子罐无菌可控量型接种装置总体连接示意图；

其中：1-第二管路外侧连接软管，2-瓶口外侧连接软管， 3-宝塔头，4-密封垫片，5-L型三通隔膜阀单通端，6-菌种瓶套装三通隔膜阀，7-菌种瓶套装三通隔膜阀L型端双口第一口，8-菌种瓶套装三通隔膜阀端L型双口第二口，9-第二管路，10-第一管路，11-无菌过滤滤芯，12-瓶盖，13-双口贯通板，14-垫片，15-瓶内连接软管，16-菌种瓶瓶体，17-种子罐罐顶接口，18-L型三通隔膜阀主阀单通端，19- L型三通隔膜阀主阀L型端双口第一口相连接的隔膜阀，20-L型三通隔膜阀主阀L型端双口第一口，21-密封垫片，22-密封垫片，23-弯头侧隔膜阀，24-疏水阀，25-罐顶连接弯头，26-密封垫片，27-L型三通隔膜阀主阀，28-L型三通隔膜阀主阀L型端双口第二口，29-密封垫片，30-菌种瓶套装接入区替代弯头，31-第一管路瓶口外侧。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步解释说明。

实施例

如图1~4所示，本发明所提供的种子罐无菌可控量型接种装置，该接种装置组成部分包括：用于盛装目标菌液的菌种瓶套装（图1）、保温装置、种子罐、连锁接种阀门装置（图2）、高压蒸汽以及压缩空气接入端；

所述菌种瓶套装包括菌种瓶瓶体（16）（优选刻度蓝盖瓶）、可与瓶身拆解和密封连接的瓶盖（12）、双口贯通板（13）、垫片（14），双口贯通板有两根贯通管路接口；第一管路（10）内侧连接软管（15）延长或直接延长至菌种瓶瓶底，外侧（31）连接软管（2），末端连接宝塔头（3）、三通隔膜阀（6），再与连锁接种阀门装置相连；

所述第一管路软管末端连通L型三通隔膜阀单通端（5），阀门关闭状态下，菌种瓶套装内部与外部形成完全无菌的封闭保护，三通隔膜阀L型端双口（第一口7和第二口8）与连锁接种阀门装置连接，接种时可调节关闭，在需要时确保阻止菌种流动；

所述双口贯通板及贯通管路接口为一体式，耐高温高压、耐腐蚀，例如不锈钢、硅胶、四氟材质，实施例为316不锈钢材质并镜面抛光；

所述双口贯通板第二管路内侧不连接，第二管路外侧（9）通过外侧连接软管（1）优选连接无菌过滤滤芯（11）（实施例为赛多利斯Sartorius-Stedim midisart 2000 0.20um滤芯），滤芯两侧均具有软管连接口，另一端可与压缩空气管路软管连接进行接种，提供压力，不接压缩空气时可直接与环境接触，提供少量菌种需氧；

所述所用软管可采用硅胶管、热塑性硅胶管等，热塑性硅胶管可搭配使用无菌封管机和接管机配套使用，实施例均为药用级别硅胶管；

所述保温装置用于保护菌种不受外界环境干扰，可根据菌种工艺要求使用便携式冷藏箱、便携式恒温箱、泡沫箱加冰、水浴等多种方式，直接将菌种瓶置于保温装置内即可，放置于接种工作区就近放置，亦或无要求可不使用，具体实例如：低温虫草菌可用冰水保温，直接将菌种瓶置于冰水中即可；

所述连锁接种阀门装置（图2）包括L型三通隔膜阀主阀（27）、数个配套隔膜阀（19、23）、疏水阀（24）、蒸汽进出管路、菌种瓶套装接入区替代弯头（30）及与种子罐连接装置（17、25）；L型三通隔膜阀主阀单通端（18）通过种子罐连接装置（图3）与种子罐罐顶接口（17）相连，可采用螺纹O型圈、螺纹垫片、卡箍垫片、耐压软管或直接焊接连接等方式连接，实施例为：不锈钢卡箍、90°不锈钢弯头、快卡口对接垫片连接；

所述L型三通隔膜阀主阀L型端双口，第一口（20）连接隔膜阀（19），在通过管路连接到高压蒸汽供气端，第二口（28）顺序连接菌种瓶套装接入区替代弯头（30）、隔膜阀（23），再通过管路连接疏水阀门（24），再连接至排废管路；所述管路材质均采用不锈钢材质，实施例304不锈钢管路；

所述菌种瓶套装接入区替代弯头（30）在种子罐灭菌时安装，用以替代菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接种时将其替换为菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接入区两个接口与阀门L型端两口分别相连（第二口8接28、第一口7接隔膜阀23），通过穿过无菌滤芯（11）压缩空气提供动力，使菌种由移种瓶（16），依次流经菌种瓶套装软管（15、10、2、3）、套装三通阀门（6）、连锁接种阀门装置（图2），在绝对无菌状态下进入种子罐；

具体应用时，为保证菌种瓶套装L型三通隔膜阀在多次转移过程中不受污染，可在灭菌前将其裸露的L型端两口（第一口7、第二口8）使用若干层纱布外加层牛皮纸包裹，并用棉绳扎紧，然后进行套装灭菌，接入连锁接种阀门装置接入区前，取下纱布牛皮纸连接再次灭菌。

利用所述种子罐，以生产中发酵行业常用50L发酵罐为例，其上部通常具有接种口（17），以此为例具体应用本发明提供接种装置时，具体包括如下步骤（连接全貌图如图4）：

1) 连锁接种阀门装置（图2）与种子罐连接（图3连接）并随同种子罐灭菌同时灭菌；

2) 菌种瓶套装在灭菌设备（例如脉动真空灭菌器）中灭菌121.0℃、30min，关闭套装三通阀门（6），然后在无菌洁净设备（如生物安全柜）中进行菌种转移，菌种转入菌种瓶套装装置中；

3) 带菌种菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6）去除牛皮纸纱布后，接入连锁接种阀门装置预留接入区，替换掉弯头（30），进行接入区灭菌121.0℃、30min，过程中菌种瓶放入保温装置保温；

4) 灭菌完成后，关闭进出蒸汽阀门（19、23），种子罐泄压，空气滤芯（11）一端与压缩空气管路相连，，打开两个L型三通阀门（27、6），使用0.01~0.4MPa压缩空气将菌种压入种子罐，可通过压缩空气气阀、L型三通阀门（6）和移种瓶（16）液位控制菌种进入量；

5) 关闭L型隔膜主阀（27），使用弯头（30）替换接入区L型三通阀门（6），进行连锁接种阀门装置二次灭菌121.0℃、30min。

Claims (10)

1.一种种子罐无菌可控量型接种装置，该接种装置组成部分包括：用于盛装目标菌液的菌种瓶套装、种子罐、连锁接种阀门装置、高压蒸汽以及压缩空气接入端；其特征在于：

所述菌种瓶套装包括菌种瓶瓶体（16）、可与瓶身拆解和密封连接的瓶盖（12）、双口贯通板（13）、垫片（14），所述双口贯通板（13）有第一管路和第二管路两根贯通管路接口，其中第一管路内侧（10）连接软管（15），所述第一管路的外侧（31）连接软管（2），末端连接宝塔头（3）、三通隔膜阀（6），再与连锁接种阀门装置相连；其中第二管路瓶内侧不连接，在瓶外侧（9）通过外侧连接软管（1），与压缩空气管路软管连接进行接种；优选地，通过外侧连接软管（1）连接无菌过滤滤芯（11），滤芯两侧均具有软管连接口，另一端可与压缩空气接入端的管路软管连接进行接种；

所述连锁接种阀门装置包括L型三通隔膜阀主阀（27）、数个配套隔膜阀（19、23）、疏水阀（24）、蒸汽进出管路、菌种瓶套装接入区替代弯头（30）及与种子罐连接装置（17、25）；L型三通隔膜阀主阀单通端（18）通过种子罐连接装置与种子罐罐顶接口（17）相连；所述L型三通隔膜阀主阀L型端双口的第一口（20）连接隔膜阀（19），再通过管路连接到高压蒸汽供气端，所述双口的第二口（28）顺序连接菌种瓶套装接入区替代弯头（30）、隔膜阀门（23），再通过管路连接疏水阀门（24），再连接至排废管路；

其中所述菌种瓶套装接入区替代弯头（30）在种子罐灭菌时安装，用以替代菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接种时将其替换为菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6），接入区两个接口与阀门L型端两口分别相连，通过穿过无菌滤芯（11）压缩空气提供动力，使菌种由移种瓶（16），依次流经菌种瓶套装软管（15、10、2、3）、套装三通阀门（6）、连锁接种阀门装置，在绝对无菌状态下进入种子罐。

2.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：所述双口贯通板（13）及贯通管路接口为一体式，优选采用不锈钢、硅胶、四氟材质。

3.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：所述各个软管采用硅胶管、或热塑性硅胶管。

4.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：菌种瓶瓶体采用蓝盖瓶、可承压玻璃瓶、或不锈钢瓶。

5.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：还包括保温装置，用于保护菌种不受外界环境干扰，优选采用便携式冷藏箱、便携式恒温箱、泡沫箱加冰、水浴。

6.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：所述L型三通隔膜阀主阀（27）单通端通过种子罐连接装置与种子罐罐顶接口相连，其中采用螺纹O型圈、螺纹垫片、卡箍垫片、耐压软管或直接焊接连接方式连接。

7.如权利要求1所述的种子罐无菌可控量型接种装置，其特征在于：所述排废管路的材质不锈钢材质。

8.采用权利要求1~7任一项所述种子罐无菌可控量型接种装置的用于发酵或培养的无菌可控量型接种方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)连锁接种阀门装置与种子罐连接并随同种子罐灭菌同时灭菌；

2)菌种瓶套装在灭菌设备中灭菌，关闭套装L型三通隔膜阀（6）的阀门，然后在无菌洁净设备中进行菌种转移，菌种转入菌种瓶套装装置中；

3)带菌种菌种瓶套装L型三通隔膜阀（6）去除牛皮纸纱布后，接入连锁接种阀门装置预留接入区，替换掉弯头（30），进行接入区灭菌，任选地在所述过程中菌种瓶放入保温装置保温；

4)灭菌完成后，关闭进出蒸汽阀门（19、23），种子罐泄压，空气滤芯（11）一端与压缩空气管路相连，打开两个L型三通阀门（27、6），使用压缩空气将菌种压入种子罐，通过压缩空气气阀、L型三通阀门（6）和移种瓶（16）液位控制菌种进入量；

5)关闭L型隔膜主阀（27），使用弯头（30）替换接入区L型三通阀门（6），进行连锁接种阀门装置二次灭菌。

9.如权利要求8所述的接种方法，其特征在于，所述灭菌为121.0℃灭菌30min，优选采用脉动真空灭菌器。

10.如权利要求8所述的接种方法，其特征在于，第4)步中采用0.01~0.4MPa压缩空气将菌种压入种子罐。