CN108359656A - 一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，本发明将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行混合，实现无缝克隆，为进一步增强反应体系重复性和降低生产成本，将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行进行融合表达，构建成嵌合蛋白，在大肠杆菌进行表达和纯化。该融合蛋白更适合于无缝克隆体系，应用效果好，成本低，更适合产业化，在酶作用后的体系中添加脱氧核糖核苷三磷酸，可进一步提高克隆效率。

Description

一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法。
背景技术
分子克隆是近代分子生物学一种必用的手段，主要用有两种方法，一种是连接酶依赖性的(ligase-dependent cloning，LDC)，另外一类是不依赖连接酶的(ligase-independent cloning，LIC)。其中LDC的使用最为广泛，它主要是将载体和待克隆的片段用合适的酶切，出现相同的粘端，实现互补，连接酶将切口连接上而产生新重组分子，其缺点是受到酶切位点的限制，操作也相对复杂，对于一些特殊的克隆，如用于转基因的基因克隆难免引入切点的序列，这些切点的序列给功能分析带来隐患。而LIC早期主要用于大片段的基因克隆，主要是对BAC克隆用同源重组的方法(Red/ET)进行改造，用于转基因，其优点是不受酶切位点的影响，也不会引入额外的序列，对于转基因等的功能分析非常合适，但操作也较为繁琐，常规的载体构建一般不采用该方法。
无缝克隆最早问世的产品是In-fusion PCR cloning System，美国ClontechLaboratories，INC的产品，其原理是在PCR引物引入15bp和载体相同的序列，在T4DNA多聚酶和一种价格昂贵有知识产权的高保真酶的共同作用下，产生新的重组分子，是一种非常有效的克隆方法。其缺点是操作需要严格控制几个温度，先在37℃处理一段时间，然后在50℃或80℃处理一段时间，才完成重组分子的产生，操作相对麻烦，更主要是有知识产权的高保真酶价格非常昂贵，限制了其应用的发展。
降低成本和简化操作是无缝克隆技术的发展方向。如国内南京金斯瑞有限公司在这方面取得突破，并申请美国专利US8501454B2，操作方法和使用普通的连接酶的操作相似，重组体系只要是室温放置一段时间即可实现重组分子的产生。其原理是用外切酶和RecA或其它单链结合蛋白混合酶，实现重组分子的产生，实现无缝克隆。但我们在使用过程中发现，这种方法不太稳定，对用于重组反应的核酸片段和载体片段的定量要求非常高。鉴于此目的，所以如何提供一种操作方法简单、稳定、成本低廉适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术中方法不太稳定，对用于重组反应的核酸片段和载体片段的定量要求非常高的问题，提供一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
设计一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将噬菌体T7的5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶的基因，用PCR扩增后，回收二个基因的片段，二个片段中有一部分同源，将二个片段加入到PCR管子中，用噬菌体T7的5’-3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4DNA多聚酶的基因羧基端引物，进行PCR扩增，得到5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶融合基因片段，琼脂糖胶回收后，通过Nde I和Xho I位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白表达载体；
步骤二：将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)，进行表达，得到预期的嵌合蛋白；
步骤三：将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合亲和层析和肝素琼脂糖凝胶层析，得到纯化的嵌合蛋白；
步骤四：将纯化的嵌合蛋白保存于磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和50％甘油的保存液中，即得到所述的嵌合酶。
优选的，所述的嵌合酶使用于无缝克隆后，添加四种混合的脱氧核糖核苷三磷酸并充分混合，提高克隆效率。
所述的加入的嵌合酶为0.01-0.1μg/20μL反应体系。
优选的，所述的加入的嵌合酶为0.05μg/20μL反应体系。
本发明提供一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其有益效果在于：本发明将噬菌体T75’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶进行混合，可实现无缝克隆，为进一步增强反应体系重复性和降低生产成本，将噬菌体T75’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶构建成嵌合蛋白，在大肠杆菌进行表达和纯化，该融合蛋白更适合于无缝克隆体系，应用效果好，成本低，更适合产业化，在酶作用后的体系中添加四种混合脱氧核糖核苷三磷酸，可进一步提高克隆效率。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参阅附图1所示，本发明的一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将噬菌体T7的5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶的基因，用PCR扩增后，回收二个基因的片段，二个片段中有一部分同源，将二个片段加入到PCR管子中，用噬菌体T7的5’-3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4DNA多聚酶的基因羧基端引物，进行PCR扩增，得到5’-3’单链外切酶和T4DNA多聚酶融合基因片段，琼脂糖胶回收后，通过Nde I和Xho I位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白；
步骤二：将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)，进行表达，得到预期的嵌合蛋白；
步骤三：将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合亲和层析和肝素琼脂糖凝胶层析，得到纯化的嵌合蛋白；
步骤四：将纯化的嵌合蛋白保存于磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和50％甘油的保存液中，即得到所述的嵌合酶。
所述的嵌合酶作用于无缝克隆后，添加四种脱氧核糖核苷三磷酸并充分混合，并作用一段时间，可进一步提高克隆效率。
实施例二
为测试嵌合酶用于无缝克隆的效果和测试嵌合酶作用后，添加四种脱氧核糖核苷三磷酸对无缝克隆的影响。我们采用pET28a作为载体，人工合成的Tth基因用PCR扩增后，作为被克隆的片段，进行无缝克隆效率的研究。
克隆的载体是大肠杆菌表达载体pET28a，先用Bam HI和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收，避免没有酶切完全的质粒污染，可能导致的克隆背景增加，回收的片段用PCR产物回收用离心柱式试剂盒，在最后洗脱是用10mmol/L TrisHCl，pH8.5，不使用试剂盒里提供的含有EDTA的洗脱液，避免EDTA对下面的无缝克隆反应的影响，回收的片段用分光光度计进行定量。PCR产物扩增的片段为2031bp，用上述同样的方法制备回收，定量。设计的扩增Tth基因的PCR引物和
载体序列相同的部分分别为15，18，20bp，用下划线标示。
表1
实施例三
无缝克隆的体系溶液：1，10X缓冲液，70mmol/L TrisHCl，10mmol/L MgCl2，100μg/ml BSA(pH 7.9 @ 25℃)2，10X dNTP，2mmol/L pH 8.0。无缝克隆的操作：在20μl体系中加入2μl 10X缓冲液，20-100ng的载体片段和1-5摩尔数的PCR片段，用水补足体积到20μl，加入嵌合蛋白0.01-0.1μg，37℃ 1-5分钟，再加入2.3μl的2mmol/L dNTP，反应1-5分钟，或不加入dNTP处理步骤。无缝克隆产物可直接用于转化，或-20℃保存，留待以后转化。转化的后调取克隆，用BamHI和Xho I双切，若出现约2kb的片段为阳性克隆，每次调20个克隆，确定阳性克隆的比例。
实施例四
在20μl体系中加入2μl 10X缓冲液，20ng的载体片段和5摩尔数的PCR片段，用水补足体积到20μl，加入嵌合蛋白0.03μg，37℃ 1分钟，直接用于转化。转化的后调取克隆，用BamHI和Xho I双切鉴定阳性克隆，切出约2kb的片段为阳性克隆，调取20个克隆，阳性克隆的比例见表2。
实施例五
在20μl体系中加入2μl 10X缓冲液，20ng的载体片段和5摩尔数的PCR片段，用水补足体积到20μl，加入嵌合蛋白0.03μg，37℃ 1分钟，再加入2.3μl的2mmol/L dNTP，反应5分钟，直接用于转化。转化的后调取克隆，用BamHI和Xho I双切鉴定阳性克隆，切出约2kb片段为阳性克隆，共调取20个克隆，阳性克隆的比例见表2。
实施例六
在20μl体系中加入2μl 10X缓冲液，50ng的载体片段和3摩尔数的PCR片段，用水补足体积到20μl，加入嵌合蛋白0.05μg，37℃ 1分钟，再加入2.3μl的2mmol/L dNTP，反应5分钟，产物用于转化，转化的后调取20个克隆，用BamHI和Xho I双切，切出约2kb片段鉴定为阳性克隆，阳性克隆的比例见表2。
实施例七
在20μl体系中加入2μl 10X缓冲液，50ng的载体片段和5摩尔数的PCR片段，用水补足体积到20μl，加入嵌合蛋白0.05μg，37℃ 1分钟，再加入2.3μl的2mmol/L dNTP，反应5分钟，产物用于转化，转化的后调取20个克隆，用BamHI和Xho I双切，鉴定阳性克隆，阳性克隆的比例见表2。
表2
引物同源碱基 实例四 实例五 实例六 实例七
15bp 13/20 18/20 18/20 19/20
18bp 15/20 19/20 20/20 19/20
20bp 15/20 20/20 19/20 19/20
人工合成的Tth DNA连接酶编码区序列：
pET28a载体序列
酶的序列
1、噬菌体T7基因6 5’-3’单链外切酶
2、噬菌体T4 DNA多聚酶
3、嵌合蛋白序列
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将噬菌体T7的5’-3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶的基因，用PCR扩增后，回收二个基因的片段，二个片段中有一部分同源，将二个片段加入到PCR管子中，用噬菌体T7的5’-3’单链外切酶基因的氨基端引物和T4 DNA多聚酶的基因羧基端引物，进行PCR扩增，得到5’-3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶融合基因片段，琼脂糖胶回收后，通过Nde I和Xho I位点亚克隆到pET28a表达载体中进行表达形成嵌合蛋白；
步骤二：将上述的嵌合蛋白的表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)，进行表达，得到预期的嵌合蛋白；
步骤三：将步骤二所得的提取蛋白经离子交换、氮三乙酸螯合亲和层析和肝素琼脂糖凝胶层析，得到纯化的嵌合蛋白；
步骤四：将纯化的嵌合蛋白保存于磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和50％甘油的保存液中，即得到所述的嵌合酶。
2.根据权利要求1所述的一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其特征在于，所述的磷酸钾、氯化钾、二硫苏糖醇和甘油的质量分别为：20mmol的磷酸钾、200mmol的氯化钾、2mmol的二硫苏糖醇和总质量50％的甘油。
3.根据权利要求1所述的一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其特征在于，所述的加入的酶量为0.01-0.1μg/20μL反应体系。
4.根据权利要求1所述的一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，其特征在于，所述的嵌合酶作用后，前添加四种脱氧核糖核苷三磷酸并充分混合。
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