CN108358990B - 一种具有抗菌活性的五环三萜类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗菌活性的五环三萜类化合物。本发明所述的化合物对多种革兰氏阳性菌和真菌都有显著的抑制效果。本发明还揭示了该化合物在制备治疗和/或预防细菌感染和真菌感染的药物中的应用。

Description

一种具有抗菌活性的五环三萜类化合物

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及一种具有抗菌活性作用的五环三萜类化合物及其在制备治疗和/或预防细菌感染和真菌感染的药物中的应用。

背景技术

细菌感染是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续发明的抗生素主要通过抑制细菌细胞壁合成，抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径达到抗菌目的。然而这些抗菌途径容易诱导细菌发生突变而产生抗菌素耐药性。因此人们一直在致力于开发新型的抗菌素。

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是超过25％的人口共生定植的细菌。重要的是，这种生物能够突破其初始定植部位，导致细菌传播和疾病。金黄色葡萄球菌是医院感染的主要原因，是感染性心内膜炎以及皮肤和软组织感染最常见的病原，并且是食物传染疾病的四大主要原因之一。耐抗生素菌株，如耐青霉素金黄色葡萄球菌菌株、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株以及耐受被视为对金黄色葡萄球菌感染的最后防线的抗生素-万古霉素的耐药菌株的出现进一步突显了金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁。

单核细胞增多性李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，人感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它在自然界中广泛存在，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在4℃的环境中仍可以生长繁殖，食品中存在的单核细胞增多性李斯特氏菌对人类的健康安全具有危险，我国将其列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一。

艰难梭菌是革兰氏阳性菌的一种。艰难梭菌感染通常影响抗生素治疗中的患者，因为该细菌仅能够在耗尽细菌群落的患者结肠内繁殖。目前艰难梭菌感染是全世界的主要难题，该细菌感染症状为患者本身表现为从轻微自限性腹泻至可能危及生命的、严重的结肠炎。老年患者最容易处于这些可能危及生命的疾病风险中且在过去10年中，这种疾病发生率已显著增加。目前用于治疗艰难梭菌感染的治疗方法依赖于甲硝唑和万古霉素的使用。然而，在部分情况下，这些抗生素是无效的，并且20％-30％的患者经历该疾病的复发。

此外，近几年由于广谱抗生素、抗真菌药物、抗肿瘤药物以及一些免疫抑制剂的广泛应用,使得条件致病菌感染发生率呈现逐年升高的趋势,真菌的耐药性也逐渐增强,使得临床抗真菌治疗效果受到限制影响。研究发现,目前临床上耐药真菌引起的深部感染,已经成为治疗失败的关键危险因素。

总体而言，随着耐药菌株的不断出现，目前抗生素的效力在不断下降，迫切需要开发新型的抗菌药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性作用的五环三萜类化合物及其在制备治疗和/或预防细菌感染和真菌感染的药物中的应用。本发明的五环三萜类化合物对多种菌都有显著的抑制效果。

在本发明的第一方面，提供式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备抑菌组合物：

其中，R独立地选自：羟基、C1-C4烷氧基、芳氧基、AcO-、

R’独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。

在一个优选例中，R为

在另一优选例中，R为羟基。

在另一优选例中，R为AcO-。

在另一优选例中，R’独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。

在另一优选例中，所述的化合物通过靶向结合甲硫氨酸腺苷转移酶2，调控甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白功能，抑制细菌和真菌的生长。

在另一优选例中，所述的菌为细菌或真菌；较佳地，所述的菌是具有甲硫氨酸腺苷转移酶的菌。

在另一优选例中，所述的细菌包括：革兰氏阳性菌；较佳地，所述的革兰氏阳性菌为耐青霉素金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌或艰难梭菌；或所述的真菌包括：白色念珠菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、絮状表皮癣菌、奥杜盎小孢子菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型包括(单不限于)：口服制剂、注射剂、外用制剂或栓剂。

在本发明的另一方面，提供一种制备抑菌组合物的方法，所述的方法包括：将有效量的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体、或它们的药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合，制备成抑菌组合物；

其中，R独立地选自：羟基、C1-C4烷氧基、芳氧基、AcO-、

R’独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其含有式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐作为必需的活性成分与药学上可接受的载体。其可以为临床上或药学上可接受的任一剂型。

在一个优选例中，该药物组合物的剂型可以为口服制剂、注射剂、外用制剂或栓剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、AKBA体外抑制耐青霉素G金黄色葡萄球菌生长的实验结果图，说明不同浓度的受试物AKBA对耐青霉素G金黄色葡萄球菌的体外抑菌能力。其中，以万古霉素为对照药。

图2、AKBA体外抑制李斯特菌生长的实验结果图，说明不同浓度的受试物AKBA对李斯特菌的体外抑菌能力。其中，以氨苄西林Ampicillin为对照药。

图3、AKBA体外抑制艰难梭菌生长的实验结果图，说明不同浓度的受试物AKBA对艰难梭菌的体外抑菌能力。其中，以万古霉素为对照药。

图4、AKBA与靶蛋白甲硫氨酸腺苷转移酶2的亲和力测定实验结果图，说明AKBA与甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白的结合能力。

图5、AKBA体外抑制MAT-2蛋白酶活性试验结果图，说明AKBA在体外可以抑制MAT-2蛋白的酶催化活性。

图6、AKBA处理HaCaT细胞12h后单碳循环代谢物变化图，说明AKBA在细胞内可以有效抑制MAT-2蛋白活性。

具体实施方式

发明人经过深入的研究，揭示一类五环三萜结构修饰化合物的新用途，用于制备抑菌的组合物。所述的五环三萜结构修饰化合物可通过靶向结合甲硫氨酸腺苷转移酶2(MAT2，也称为蛋氨酸腺苷转移酶2)蛋白发挥抗菌和抑菌作用。在此基础上完成了本发明。

术语

本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。

本文所用的术语“烷氧基”指与氧原子连接的烷基。

本文所用的术语“芳氧基”指与氧原子连接的芳香性基团。

本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。

本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。

本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。

本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。

本文所用的

的表示方法是本领域人员熟知的，其表示基团R’可以取代在环上的任意一个或多个可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R’的选择可以是不同的。

本文所用的术语“溶剂合物”表示携带有溶剂分子的化合物，例如，所述的溶剂合物可以是水合物。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

化合物

基于本发明人的新发现，首先提供了一种如结构式(I)所示的化合物：

其中，R独立地选自：羟基、C1-C4烷氧基、芳氧基、AcO-、或

其中，R为羟基，即为11-羰基-β-乳香酸(KBA)，KBA具有如下的结构式：

其中，R为AcO-，即为11-羰基-β-乙酰乳香酸(Acetyl-11-keto-β-boswellicacid；AKBA)，AKBA具有如下的结构式：

其中，R为

R’独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、卤素。较佳地，R’独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基。更佳地，R’为氢。

本发明还包括上述式(I)化合物的异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过市售可得或通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如参照专利CN201310623314或本发明实施例所述方法。这些方法均可被包含在本发明中。

用途

本发明人发现，本发明中的化合物AKBA可靶向结合甲硫氨酸腺苷转移酶2(MAT2)，调控甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白功能，从而抑制细菌和真菌的生长。这是首次在细胞中明确AKBA及其结构修饰物直接作用的新靶点——甲硫氨酸腺苷转移酶2。

甲硫氨酸腺苷转移酶(也称为蛋氨酸腺苷转移酶，Methionine adenosyltransferase，MAT，EC 2.5.1.6)是细胞合成S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methioinie,SAM)的关键酶。SAM是生物体内许多生物活性物质(激素、磷脂、活性氨基酸、DNA和RNA等)甲基化的甲基提供者，且与多种细胞信号传递途径有关，发挥极为重要的生理功能。M AT在生物体中有三种，MAT-1、MAT-3存在于成年肝脏中，MAT-2广泛分布于各种组织中，其中MAT-2则是由基因MAT2A编码的蛋白，在原核生物和真核生物中普遍存在并极为保守[武汉大学学报(医学版)，2008，29，4:559-562]。

细菌生长循环的两个阶段——活跃期和非活跃期都需要甲硫氨酸腺苷转移酶的参与，从而催化蛋氨酸与ATP生成S-腺苷蛋氨酸。有效抑制甲硫氨酸腺苷转移酶活性，尤其是甲硫氨酸腺苷转移酶2的活性，将同时影响细菌生长的两个阶段，从而产生抑菌和抗菌的药理作用[BMC Microbiol.2003Jun16；3:12.]。

本发明人在研究中发现，优选化合物AKBA能够靶向结合甲硫氨酸腺苷转移酶2，调控甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白功能，抑制细菌和真菌的生长。在本发明的具体实施例中，通过测定AKBA和MAT2蛋白的解离常数为5.61nM，该解离常数数值非常小，说明小分子AKBA与蛋白甲硫氨酸腺苷转移酶2之间具有非常强的亲和力。

在本发明的另一具体实施例中，测定了优选化合物AKBA和KBA体外抑制革兰氏阳性菌活性的最小抑菌浓度(MIC)，结果发现AKBA体外抵抗耐青霉素G金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性与万古霉素相当，KBA体外抗菌活性与万古霉素接近。

在本发明的其他实施例中，测定了优选化合物AKBA对耐青霉素G金黄色葡萄球菌、李斯特菌和艰难梭菌体外生长的抑制活性，获得杀菌曲线以评估其抑菌抗菌能力，结果发现AKBA体外对耐青霉素G金黄色葡萄球菌杀菌效果与阳性对照药万古霉素基本相当，对艰难梭菌的杀菌效果显著优于阳性对照药万古霉素，而对李斯特菌杀菌效果则显著优于另一阳性对照药氨苄西林。

此外，在本发明的另一具体实施例中，测定了优选化合物KBA体外对白色念珠菌的抑制效果，结果发现KBA对白色念珠菌具有显著的抑菌能力，最小抑菌浓度为2～4μg/ml。

基于本发明人的上述新发现，式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体可应用于治疗和/或预防细菌感染和真菌感染药物的制备，可以作为必需的活性成分与药学上可接受的载体形成药物组合物，可以为临床上或药学上可接受的任一剂型，包括但不限于口服制剂、注射剂、外用制剂或栓剂。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的式(I)所述的化合物、或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：口服制剂、注射剂、外用制剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆、溶液、或悬浮液。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。

本发明的化合物或其药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。

式(I)化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.05-500mg/kg，较佳地0.1-300mg/kg，更佳地1-200mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、体外抑制革兰氏阳性菌活性的测定

参照文献Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of AnaerobicBacteria；Approved Standard-Seventh Edition(M11-A7，Vol.27，No2，Jan2007)和Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria ThatGrow Aerobically；Approved Standard-Seventh Edition(M7-A7，Vol.26，No2，Jan 2006)所描述的美国临床实验室标准委员会(CLSI)试验方案，以万古霉素作为阳性对照药，采用微量肉汤稀释法测定受试化合物对耐青霉素G金黄色葡萄球菌(S.aureus，resistant toPenicillin G，上海交通大学医学院提供)、艰难梭菌(C.diff，上海交通大学医学院提供)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，USA 300和USA400MW2，中国科学院上海巴斯德研究所)的最小抑菌浓度(MIC)。

受试化合物AKBA、KBA对抗上述细菌的最小抑制浓度(MIC)总结在表1(以下)中。

表1

在上表中，用于指示MIC值的符号所表示含义为：

+++表示最小抑制浓度范围为1～8μg/ml(含8μg/ml)；

++表示最小抑制浓度范围为9～16μg/ml(含16μg/ml)；

+表示最小抑制浓度范围为17～64μg/ml(含64μg/ml)；

ND代表未检测。

试验结果显示，优选化合物AKBA和KBA体外抵抗耐青霉素G金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性与万古霉素相当或接近。

实施例2、AKBA体外对耐青霉素G金黄色葡萄球菌生长抑制的测定

选用实施例1中的耐青霉素G金黄色葡萄球菌为试验菌株。参照文献Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That GrowAerobically；Approved Standard-Seventh Edition(M7-A7，Vol.26，No2，Jan 2006)所描述的美国临床实验室标准委员会(CLSI)试验方案，将35℃培养约18小时的菌液接种于MH肉汤培养基中，接种量约为10⁹CFU/ml，置35℃培养30分钟，分别加入溶剂(DMSO)、对照药万古霉素(浓度为16μg/ml)以及优选化合物AKBA，浓度分别为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml，置35℃继续培养并定时取样，在营养琼脂平板上计活菌落数，将菌落数取对数值，绘制时间-菌落数对数值曲线，获得杀菌曲线图，如图1。

试验结果显示，优选化合物AKBA在试验条件下，体外对耐青霉素G金黄色葡萄球菌杀菌效果与阳性对照药万古霉素基本相当，12小时即可明显降低细菌载量；且在2-12小时时间范围内，杀细菌能力在一定程度上优于万古霉素。

实施例3、AKBA体外对李斯特菌生长抑制的测定

选用李斯特菌(Listeria monocytogenes上海交通大学医学院提供)为试验菌株。参照实施例2的方法分别测定溶剂(DMSO)、对照药氨苄西林Ampicillin(浓度为32μg/ml)以及优选化合物AKBA(浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml)的体外抑菌效果，并绘制时间-菌落数对数值曲线，获得杀菌曲线图，如图2。

试验结果显示，在相同浓度(32μg/ml)下，优选化合物AKBA的杀菌效果显著优于阳性对照药氨苄西林，12小时左右菌落计数即低于最低检测限。

实施例4、AKBA体外对艰难梭菌生长抑制的测定

选用实施例1中的艰难梭菌(C.diff)为试验菌株。参照文献Methods forAntimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria；Approved Standard-Seventh Edition(M11-A7，Vol.27，No2，Jan2007)所描述的美国临床实验室标准委员会(CLSI)试验方案，分别测定溶剂(DMSO)、对照药万古霉素(浓度为16μg/ml)以及优选化合物AKBA(浓度分别为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml)的体外抑菌效果，并绘制时间-菌落数对数值曲线，获得杀菌曲线图，如图3。

试验结果显示，优选化合物AKBA的杀菌效果显著优于阳性对照药万古霉素，在高浓度(64μg/ml)下2小时左右菌落计数即低于最低检测限，中低浓度(32μg/ml、16μg/ml)下7小时左右菌落计数即低于最低检测限。

实施例5、KBA体外抑制白色念珠菌活性的测定

参照文献Reference Method for Broth Dilution Antifungal SusceptibilityTesting of Yeasts；Approved Standard—Second Edition(M27-A3，Vol.28，No14，Apr2008)所描述的美国临床实验室标准委员会(CLSI)试验方案，采用微量肉汤稀释法测定KBA对白色念珠菌的最小抑菌浓度。

受试白色念珠菌菌株(上海市新华医院皮肤科提供)经35℃培养24h，制成菌悬液将其浓度调至菌浓度为1～5×10⁶CFU/ml，然后用RPMI1640液基1:50稀释后再1:20稀释(即共稀释1000倍)，至菌浓度为1～5×10³CFU/ml。接种后的药敏板置微量振荡板上振荡5min，使混合均匀，35℃湿盒温育24h，观察受试菌生长情况并记录最小抑菌浓度。

试验结果显示，优选化合物KBA体外对白色念珠菌的生长具有显著的抑制效果，最小抑菌浓度为2～4μg/ml。

实施例6、AKBA与甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白亲和力的测定

参照文献[J Immunol.2015Jul 15；195(2):602-10]所述方法，使用Forte BIOOctet RED 96检测AKBA和MAT2蛋白的亲和力。

室温下，将12μL biotin标记的AKBA储备液(20mM，DMSO)加入1200μL检测缓冲液(Tris-Cl 100mM pH8.0，MgCl₂ 20mM，KCl 200mM)中稀释为200μM，固定在链霉亲和素修饰的生物传感器上。MAT2蛋白(上海市免疫学研究所)作为溶液中流动相，分别用含0.1mg/mlBSA的检测缓冲液稀释为5个浓度梯度1000nM、500nM、250nM、125nM和62.5nM。生物传感器先在检测缓冲液中浸泡10min，然后按照基线60s，在生物传感器上装载biotin-AKBA 600s，再次基线120s，和蛋白MAT2结合900s，解离900s的程序运行。实验结果用Octet软件处理，减去不含蛋白的本底值后，将梯度浓度下蛋白和小分子的结合曲线拟合，得到AKBA和MAT2蛋白的解离常数(Kd)值。Kd值反映了蛋白与小分子之间的亲和力，Kd值越小，其亲和力越大。

结果如图4所示。试验结果显示，化合物AKBA与甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白的解离常数为5.61nM，说明小分子AKBA与蛋白甲硫氨酸腺苷转移酶2之间具有非常强的亲和力。

实施例7、AKBA体外对MAT-2蛋白酶活性抑制的测定

参照文献[BMC Struct Biol.2013,13:22-31]所述方法，使用HPLC检测AKBA体外抑制MAT-2蛋白酶活性效果。由于MAT-2作为甲硫氨酸腺苷转移酶催化以下化学反应：三磷酸腺苷(ATP)+L-蛋氨酸(L-methionine)+H₂O----->磷酸(phosphate)+二磷酸(diphosphate)+S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)因此，可以通过使用检测SAM生成量测定AKBA对MAT-2活性抑制程度。

具体实施方法为：在Tris-Cl 100mM pH8.0，MgCl₂ 20mM，KCl 200mM的缓冲液体系中加入终浓度为5mM的L-methionine，涡旋条件下再分别加入DMSO(空白对照)和终浓度为10μM、100μM、200μM的AKBA储备液，37℃加热10min使AKBA充分溶解，再分别加入终浓度为0.4mg/ml的MAT-2蛋白，37℃预热15min，每个反应中加入终浓度为5mM的ATP启动反应，37℃反应3h。用2％(v/v)冷HClO₄终止反应，NaOH中和体系pH值。使用HPLC(Agilent 1200)和Mercury SCX柱(250×4.6mm)分离产物，甲酸铵(100mM，甲酸调pH值为4.0)作为流动相，流速1.5ml/min。对照SAM的出峰时间，确定产物中SAM的出峰位置，比较不同浓度AKBA处理下SAM的峰面积即MAT-2酶活被抑制情况。

从图5可以看出，箭头所标示SAM的HPLC峰，当AKBA浓度增加到100μM时，SAM峰面积明显减少为DMSO对照组的约1/3，说明AKBA在体外可以抑制MAT-2蛋白的酶活性。

实施例8、AKBA对细胞内MAT-2蛋白酶活性抑制的测定

参照文献[Cell Metab.2015,22:861–873]所述方法，通过LC-MS测定AKBA处理后细胞内SAM以及相关单碳循环通路上代谢产物的含量变化，检测AKBA对细胞内MAT-2蛋白的抑制活性。

具体实施方法为：接种HaCaT细胞至4个10cm细胞培养皿中，待细胞长至70-80％融合度时，向10ml培养基中分别加入20μl DMSO和20μl 1mM、2.5mM、5mM AKBA储备液，使AKBA终浓度分别为0、2、5、10μM。12h后，取出培养皿，室温下立即吸走培养基，迅速将培养皿放于干冰上，并加入2ml 80％甲醇/水(质谱级别，-80℃预冷至少1h)，将培养皿放置于-80℃冰箱15min，取出后仍置于干冰上，并用细胞刮刮下细胞转移至离心管中4℃、20 000rcf离心10min，收集并转移上清至新离心管。冷冻干燥后用适当溶剂复溶，高效液相色谱—线性离子阱质谱联用仪(LTQ)检测各代谢物。

根据图6可以看出，AKBA可以梯度减少细胞内SAM的生产量，由于SAM处于单碳循环的甲硫氨酸循环中，SAM的减少也影响了整个通路中其他代谢物比如甲硫氨酸(methionine)、二甲基甘氨酸(dimethylglycine，DMG)、三甲基甘氨酸(betaine)、同型半胱氨酸(homocysteine，hCYS)和S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)的生成，也影响了单碳循环的叶酸循环产物嘌呤(Purine)的生成，说明AKBA在细胞内也有效抑制了MAT-2蛋白活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.式(I)所示化合物或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备抑菌组合物：

其中，R为AcO-，所述菌选自艰难梭菌或李斯特菌；或，R为羟基，所述菌选自艰难梭菌或白色念珠菌。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R为羟基。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R为AcO-。

4.如权利要求1～3中任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述的化合物通过靶向结合甲硫氨酸腺苷转移酶2，调控甲硫氨酸腺苷转移酶2蛋白功能，抑制细菌和真菌的生长。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的菌是具有甲硫氨酸腺苷转移酶的菌。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物的剂型选自：口服制剂、注射剂、外用制剂。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的外用制剂是栓剂。

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