CN108339151A - 一种促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物-多因子综合体系 - Google Patents

一种促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物-多因子综合体系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物‑多因子综合体系，制备方法：1)合成纳米层状双氢氧化物；2)采用离子交换法，在4度条件下，将10mg CL1和200～2000ng的生物因子低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，既得；所述生物因子为NT3、VEGF或bFGF。实验显示，该材料‑因子体系对横断吸除脊髓损伤模型小鼠的行为学具有显著的恢复作用，对模型小鼠的电生理行为具有显著恢复作用，并随着时间推移，电生理信号增强，说明可以重建损伤区域的神经环路。本发明首次将纳米层状双氢氧化物作为损伤填充材料，应用于脊髓损伤的修复。其在神经损伤修复中有着重要的应用价值。

Description

一种促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物-多 因子综合体系
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物-多因子综合体系。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在全球呈现高发生率，高致残率，高耗费和低龄化的“三高一低”的局面，迄今为止仍是一个医学难题。脊髓损伤患者以青壮年为主，高发年龄段集中在18-32岁，脊髓损伤后劳动能力几乎完全丧失，往往严重致残。据统计我国脊髓损伤发病率为18-60人次/百万人/年，现有创伤性脊髓损伤患者超过200万，每年新增10-14万人。脊髓损伤患者治疗康复费用高昂，美国每年仅对脊髓损伤患者的花费就超过60亿美元，我国每年花费超过几百亿人民币，给家庭和社会造成巨大负担。
目前，脊髓损伤主要采用外科修复、神经营养、高压氧治疗以及现代康复干预等临床综合治疗，但尚未取得理想的疗效，其主要原因在于损伤后有效的神经再生和神经环路重建这一关键科学问题没有得到根本解决。近年来，因子调控与组织工程材料等领域的进展为脊髓损伤再生修复提供了重要的技术支撑。
目前多种功能材料被应用到脊髓损伤修复中。早在2002年，瑞典大学的Kellerth 等最早利用聚羟基丁酸酯(PHB)复合海藻酸盐及纤维蛋白作为支架治疗小鼠脊髓损伤，研究发现该支架能够减少脊髓损伤后神经元的死亡。此后，不断有学者展开仿生支架的三维结构及生物相容性微环境改造，以满足脊髓损伤后环路重建的需求。2011年，葡萄牙Coimbra大学的Ferreira等报道，纳米材料聚乙烯亚胺搭载维甲酸能够促进室管膜下区神经干细胞向神经元的分化。2013年,美国California大学伯克利分校的Schaffer等将ephrin-B2的胞外结构域与透明质酸共轭结合形成多价配位，所得纳米材料可以诱导神经干细胞中的信号传导，提高干细胞向神经元的分化能力。目前国内外也有多项用于干细胞培养的支架材料获得专利，包括壳聚糖类(US20110093020；US9180166)和胶原类(US9205106；US8828433)。以上成果均表明，优化并设计适合内源性神经干细胞增殖、分化和迁移的纳米材料，以满足促进神经环路重建所需要的微环境，在脊髓损伤修复相关研究中具有极大的研究价值和临床应用前景。
层状双氢氧化物，是一类典型的无机层状材料，是由两种或两种以上的金属离子组成的具有层状晶体结构的氢氧化物，其层片结构带正电，层间存在可交换的阴离子，层状双氢氧化物通过剥离获得的纳米薄片带有正电荷，且具有纳米二维尺度的开放结构，可作为新型基元组装功能复合纳米结构或材料，是一种具有广泛用途的无机材料。纳米片状结构无机材料具有较大比表面积、分散性好，这类纳米片在纳米尺度范围的超薄厚度及层板离子可调控性，使它在催化、乳液稳定、生物等多个领域具有广泛的应用。中国专利2014101424699公开无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用，利用纳米层状双氢氧化物能够在不添加LIF因子的情况下，促进各多能性基因的表达，抑制细胞分化，并且处理后的细胞仍然具有向三个胚层分化的潜能。中国专利201410485883X公开一种地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物作为治疗哮喘药物的应用及其制备方法，利用层状双氢氧化物对地塞米松磷酸钠进行搭载，用于提高地塞米松磷酸钠的治疗效果，降低地塞米松磷酸钠的毒副作用。该地塞米松磷酸钠/层状双氢氧化物载药量较高，具有一定的缓释作用，能抑制卵蛋白诱发的哮喘大鼠气道炎症，有望应用于哮喘疾病的治疗。中国专利2010105286223，公开一种修复脊髓损伤的生物材料，修复脊髓损伤的生物材料的制备方法，包括如下步骤：a)有序胶原材料与 151IgG共价交联，形成交联151IgG的有序胶原材料；b)将带胶原结合区的脑源性神经营养因子与步骤a)得到的交联151IgG的有序胶原材料孵育，得到所述修复脊髓损伤的生物材料。然而现有技术中，关于本发明促进神经再生修复脊髓损伤的纳米层状双氢氧化物-多因子综合体系，目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进神经再生、修复脊髓损伤的材料中的应用。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进脊髓损伤部位行为学和电生理功能恢复的材料中的应用。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进神经再生、修复脊髓损伤的材料中的应用，所述纳米层状双氢氧化物-因子体系制备方法如下：
1)纳米层状双氢氧化物CL1的合成：以A(C)2·6H2O、B(C)3·9H2O和NaOH为原料以水为溶液合成CL1纳米微粒悬浮液，并通过旋转离心形成软性凝胶；所述A为二价离子；所述B为三价离子；所述C为阴离子酸根；
2)材料-因子的合成：采用离子交换法，在4度条件下，将10mg CL1和200～2000ng的生物因子低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，既得；所述生物因子为NT3、VEGF或bFGF。
作为本发明的一个优选实施方案，所述A为二价离子，包括但不限于Mg、Ca、Cu、Zn。
作为本发明的一个优选实施方案，所述B为三价离子，包括但不限于Al、Fe、Cr。
作为本发明的一个优选实施方案，所述C为阴离子酸根，包括但不限于NO3、CO3。
作为本发明的一个优选实施方案，所述旋转离心的转速为5000～8500rpm。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进脊髓损伤部位行为学和电生理功能恢复的材料中的应用。
本发明合成了一种生物相容性好的纳米层状双氢氧化物，搭载系列生物因子，优化配比，从而促进神经再生和神经环路的重建，达到修复脊髓损伤的目的。
本发明首次将纳米层状双氢氧化物作为损伤填充材料，应用于脊髓损伤的修复。该材料-因子体系具有极佳的神经再生功能，同时促进了内源性神经干细胞的新生。
本发明优点在于：
1、所获得的材料-因子体系对横断吸除脊髓损伤模型小鼠的行为学具有显著的恢复作用。
2、所获得的材料-因子体系可减少损伤区域的炎症反应。
3、所获得的材料-因子体系可提供神经再生的良好微环境，并已证实在材料-因子体系的作用下，可实现神经干细胞和神经元的再生。
4、所获得的材料-因子体系对横断吸除脊髓损伤模型小鼠的电生理行为具有显著恢复作用，并随着时间推移，电生理信号增强，说明可以重建损伤区域的神经环路。
附图说明
附图1为纳米无机层状双氢氧化物CL1透射电镜图。
附图2为CL1-NT3透射电镜图。
附图3为CL1-NT3材料填充使用示意图。
附图4为CL1-NT3材料填充后模型小鼠行为学恢复结果图。
附图5为CL1-NT3材料填充后模型小鼠电生理功能恢复结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：纳米无机层状双氢氧化物CL1的制备
CL1的合成：配制Mg(NO3)2·6H2O(1.536g,0.006mol)和Al(NO3)3·9H2O(0.75g,0.002mol) 的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Mg/Al的摩尔比1:1，配制0.016molNaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察(如图1)，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm转速离心形成软性凝胶。
实施例2：纳米无机层状双氢氧化物CL1的制备
CL1的合成：配制Ca(NO3)2·6H2O(0.006mol)和Fe(NO3)3·9H2O(0.002mol)的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Ca/Fe的摩尔比1:1，配制0.016mol NaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm 转速离心形成软性凝胶。
实施例3：纳米无机层状双氢氧化物CL1的制备
CL1的合成：配制Cu(CO3)2·6H2O(0.006mol)和Cr(CO3)3·9H2O(0.002mol)的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Cu/Cr的摩尔比1:1，配制0.016mol NaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm 转速离心形成软性凝胶。
实施例4：纳米无机层状双氢氧化物-神经营养因子3(CL1-NT3)体系的制备
CL1的合成：配制Mg(NO3)2·6H2O(1.536g,0.006mol)和Al(NO3)3·9H2O(0.75g,0.002mol) 的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Mg/Al的摩尔比1:1，配制0.016molNaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察(如图1)，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm转速离心形成软性凝胶。
材料-因子的合成：采用离子交换法，在4度条件下，将10mg纳米无机层状双氢氧化物 CL1(干重)和神经营养因子NT3(200～2000ng)低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，获得 CL1-NT3。合成的CL1-NT3通过透射电镜观察(如图2)。
实施例5：纳米无机层状双氢氧化物-血管内皮细胞生长因子(CL1-VEGF)体系的制备
CL1的合成：配制Mg(NO3)2·6H2O(1.536g,0.006mol)和Al(NO3)3·9H2O(0.75g,0.002mol) 的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Mg/Al的摩尔比1:1，配制0.016molNaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察(如图1)，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm转速离心形成软性凝胶。
材料-因子的合成：采用离子交换法，在4度条件下，将10mgCL1(干重)和血管内皮细胞生长因子VEGF(200～2000ng)低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，获得CL1-VEGF。
实施例6：纳米无机层状双氢氧化物-多因子(CL1-VEGF-bFGF)体系的制备
CL1的合成：配制Mg(NO3)2·6H2O(1.536g,0.006mol)和Al(NO3)3·9H2O(0.75g,0.002mol) 的金属混合盐溶液共40ml，水作为溶剂，其中Mg/Al的摩尔比1:1，配制0.016molNaOH溶液。N2气氛下，将金属盐混合溶液加入到剧烈搅拌NaOH溶液中，所得悬浮液转至水热合成釜，100℃18h后取出，从而获得粒径大小为20-200nm的CL1纳米颗粒悬浮液。合成的CL1通过透射电镜观察(如图1)，具有较好的晶体结构，均呈六边形。将制备的CL1纳米颗粒悬浮液置于离心机中，通过8500rpm转速离心形成软性凝胶。
材料-因子的合成：采用离子交换法，在4度条件下，将10mgCL1(干重)和血管内皮细胞生长因子VEGF及碱性成纤维细胞生长因子bFGF(细胞生长因子总量为200～2000ng)低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，获得CL1-VEGF-bFGF。
实施例7：纳米层状双氢氧化物-因子体系对于脊髓损伤的动物实验
采用小鼠脊髓横断吸除模型，吸除2mm长度的脊髓，具体造模方法可参见文献：大鼠脊髓横断损伤模型的建立，神经解剖学杂志。如图3所示，尽量不挤压到周边脊髓组织的情况下，将软性凝胶状LDH小心填充到小鼠脊髓横断吸除部位，分别填充CL1、CL1-NT3、CL1-VEGF 和CL1-VEGF-bFGF，常规护理小鼠。每周评价小鼠BMS得分从而判断材料有效性。刺激电极在大鼠的腿部肌肉施加电刺激，接收电极分别在脊髓横断部位的靠头端和靠尾端接受电刺激。
如图4所示，各组小鼠在损伤后得分为0分，均完全丧失后肢运动功能。而各实验组均能促进小鼠行为能力的恢复。从第5周开始，CL1组和CL1-NT3组后肢运动功能恢复表现出优于对照组的趋势；从第6周开始，CL1-NT3组后肢运动功能恢复表现出优于CL1组的趋势。术后13周，其中CL1-NT3效果最好，小鼠最高得分可得6分(满分9分)，平均分4.5分，而对照组得分仅为0.5～1分。此外CL1-VEGF最高得分可达3分，CL1-VEGF-bFGF最高得分可得3分，但CL1-VEGF-Bfgf平均得分略高于CL1-VEGF。上述结果表明，本发明的纳米层状双氢氧化物-因子体系对横断吸除脊髓损伤模型小鼠的行为学具有显著的恢复作用。
另取实验小鼠，用刺激电极在小鼠的腿部肌肉施加电刺激，接收电极分别在脊髓横断部位的靠头端和靠尾端接受电刺激。如果脊髓横断部位的神经传导恢复的越好，电刺激就能越多的传导到横断部位的靠头端，靠头端的接收电极接受到的电信号amplitude值越大。如图 5所示，从第4周开始，CL1组与CL1-NT3组amplitude值高于对照组，且CL1-NT3组amplitude 值最大。上述结果表明：本发明的纳米层状双氢氧化物-因子体系对横断吸除脊髓损伤模型小鼠的电生理行为具有显著恢复作用，并随着时间推移，电生理信号增强，说明可以重建损伤区域的神经环路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进神经再生、修复脊髓损伤的材料中的应用，所述纳米层状双氢氧化物-因子体系制备方法如下：
1)纳米层状双氢氧化物CL1的合成：以A(C)2·6H2O、B(C)3·9H2O和NaOH为原料以水为溶液合成CL1纳米微粒悬浮液，并通过旋转离心形成软性凝胶；所述A为二价离子；所述B为三价离子；所述C为阴离子酸根；
2)材料-因子的合成：采用离子交换法，在4度条件下，将10mg CL1和200～2000ng的生物因子低速摇床共孵育2小时，离心后取沉淀，既得；所述生物因子为NT3、VEGF或bFGF。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述A为二价离子，包括但不限于Mg、Ca、Cu、Zn。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述B为三价离子，包括但不限于Al、Fe、Cr。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C为阴离子酸根，包括但不限于NO3、CO3。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述旋转离心的转速为5000～8500rpm。
6.权利要求1-5任一所述的纳米层状双氢氧化物-因子体系生物材料在制备促进脊髓损伤部位行为学和电生理功能恢复的材料中的应用。
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