CN108315291A - 一种高山被孢霉的生长调节剂及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高山被孢霉的生长调节剂及发酵方法，其通过将一种或多种高山被孢霉的生长调节剂加入发酵培养基，促进高山被孢霉菌体的快速生长，在相同接种量的条件下，显著缩短发酵延迟期，并能促进高山被孢霉菌体的快速生长，提高了ARA油脂的生产效率，降低了生产成本。该方法操作简单，对于促进菌体生长效果显著，适用于ARA油脂的工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，更具体的说，涉及一种促进高山被孢霉快速生长的生长调节剂及发酵方法。
背景技术
花生四烯酸(ARA)是一种长链多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养物质，ARA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的神经组织中，是胎儿和婴儿大脑发育的基础，对其智力和认知能力具有促进作用，且ARA是多种二十烷酸衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列腺环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)和白细胞三烯和C4(LTC4)等生理活性物质的直接前体，这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。
目前，工业化生产ARA油脂主要是来源于高山被孢霉发酵，接种量大，发酵周期较长，如能缩短延迟期，将会显著提高ARA油脂生产效率，降低生产成本。中国专利201510164029.8公开了一种提高高山被孢霉发酵生产花生四烯酸产量的方法，主要是通过添加外源前体物油酸，提高了ARA产量，而外源油脂的加入，却使发酵周期有所延长。中国专利201110228154.2公开了一种提高微生物油脂发酵生产效率的方法，主要是通过改进发酵工艺，补加葡萄糖和食用油，显著提高ARA产量，该方法操作简单，但生产效率有待进一步提高。
因此，如何促进高山被孢霉的快速生长，对于高山被孢霉工业化生产具有重要的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种高山被孢霉的生长调节剂及发酵方法，解决现有高山被孢霉发酵生产效率低、菌体生产慢、ARA产量低下的问题。
本发明为了解决上述问题，提供的技术方案为：提供了一种高山被孢霉的生长调节剂，所述生长调节剂在高山被孢霉发酵初期加入发酵培养基用以促进高山被孢霉菌体的生长；所述生长调节剂包括如下物质中的至少一种：对羟基苯乙胺、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、苯乙胺、2-苯乙醇、对羟基苯乙醇。
在本发明提供的高山被孢霉的生长调节剂中，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为20-200μmol/L。
在本发明提供的高山被孢霉的生长调节剂中，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为80-120μmol/L。
在本发明提供的高山被孢霉的生长调节剂中，所述发酵初期为发酵培养基接种高山被孢霉种子液后48h内。
在本发明提供的高山被孢霉的生长调节剂中，所述发酵培养基包括：葡萄糖80.0-100.0g/L，酵母粉5.0-8.0g/L，黄豆饼粉2.0-4.0g/L，硝酸钠1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾0.1-2.0g/L，七水合硫酸镁0.5-1.0g/L，氯化钙0.1-1.0g/L。
本发明还提供一种高山被孢霉的发酵方法，在高山被孢霉发酵初期，向发酵培养基中加入生长调节剂用以促进高山被孢霉菌体的生长；所述生长调节剂包括如下物质中的至少一种：对羟基苯乙胺、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、苯乙胺、2-苯乙醇、对羟基苯乙醇。
在本发明提供的高山被孢霉的发酵方法中，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为20-200μmol/L。
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实施本发明，具有如下有益效果：通过将一种或多种高山被孢霉生长的调节剂加入发酵培养基，在相同接种量的条件下，显著缩短发酵延迟期，并能促进高山被孢霉菌体的快速生长，提高了ARA油脂的生产效率，降低了生产成本。该方法操作简单，对于促进菌体生长效果显著，适用于ARA油脂的工业化应用。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明主要创新点在于：在高山被孢霉发酵初期通过将高山被孢霉生长的调节剂加入发酵培养基，有效促进高山被孢霉菌体的生长。生长调节剂包括如下物质中的至少一种：对羟基苯乙胺、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、苯乙胺、2-苯乙醇、对羟基苯乙醇。
本发明还提供一种高山被孢霉的发酵方法，具体实现步骤如下：
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉活化制备孢子液，将孢子液按照5％-10％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
(2)将种子液按照2％-10％(优选8％-10％)的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，在发酵开始0-48h，发酵培养基中添加一种或几种高山被孢霉生长调节剂。生长调节剂的总浓度为20-200μmol/L，优选为80-120μmol/L。
高山被孢霉生长调节剂采用二甲基亚砜(DMSO)溶解，通过无菌有机滤膜过滤除菌后添加，对应的添加至发酵培养基的终浓度分别为：0-15.0μm，0-120.0μm，0-50μm。
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖80.0-100.0，酵母粉5.0-8.0，黄豆饼粉2.0-4.0，硝酸钠1.0-3.0，磷酸二氢钾0.1-2.0，七水合硫酸镁0.5-1.0，氯化钙0.1-1.0g/L。
(3)发酵结束后，收集湿菌体，干燥至恒重，破壁，利用有机溶剂萃取得到富含ARA的油脂。
实施例1
(1)制备高山被孢霉种子液
将4℃冰箱保藏的斜面菌种高山被孢霉接种至PDA培养基进行活化7天制备孢子，添加50mL带有玻璃珠的无菌生理盐水，制备孢子液，将孢子液按照8％的接种量接入种子培养基28℃进行培养48h，制备种子液；
种子培养基组成成分(g/L)：葡萄糖50.0g/L，酵母粉10.0g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸二氢钾3.0g/L，七水合硫酸镁0.5g/L。
(2)将种子液按照2％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，并分别添加不同的高山被孢霉生长调节剂；
A组：对羟基苯乙胺20μmol/L
B组：对羟基苯乙酸20μmol/L
C组：对羟基苯丙酸20μmol/L
D组：苯乙胺20μmol/L
E组：2-苯乙醇20μmol/L
F组：对羟基苯乙醇20μmol/L
G组：对羟基苯乙胺5μmol/L，对羟基苯乙酸15μmol/
H组：对羟基苯丙酸10μmol/L，苯乙胺10μmol/L
I组：2-苯乙醇15μmol/L，对羟基苯乙醇5μmol/L
CK1：DMSO
CK2：不添加
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉5.0，黄豆饼粉3.0，硝酸钠2.0，磷酸二氢钾1.0，七水合硫酸镁1.0，氯化钙0.5g/L。121℃，灭菌20min，冷却备用。每组实验为5个平行样。
(3)发酵结束后，利用抽滤瓶进行抽滤，收集菌体，并用单蒸水洗涤2-3次后，置于60℃烘箱进行干燥，约需6-8h，至菌体恒重，并称重。
(4)对干燥的菌体进行破壁，称取0.5g破壁菌体，加入3mL的30-60沸程的石油醚进行萃取，离心，去上清，重复该操作两次，合并上清液，旋转蒸发，获得富含ARA的油脂，甲酯化后进行气相检测分析。
菌体生长情况如表1所示，结果表明，在较低接种量的条件下，添加高山被孢霉生长调节剂可显著明显菌体延迟期，有效促进菌体的生长。
表1添加高山被孢霉生长调节剂对菌体生长情况的影响
实施例2
(1)制备高山被孢霉种子液同实施例1。
(2)将种子液按照10％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，并分别添加不同的高山被孢霉生长调节剂；
A组：对羟基苯乙胺100μmol/L
B组：对羟基苯乙酸100μmol/L
C组：对羟基苯丙酸100μmol/L
D组：苯乙胺100μmol/L
E组：2-苯乙醇100μmol/L
F组：对羟基苯乙醇100μmol/L
G组：对羟基苯乙胺20μmol/L，对羟基苯乙酸40μmol，对羟基苯丙酸40μmol/L
H组：苯乙胺50μmol/L，2-苯乙醇20μmol/L，对羟基苯乙醇30μmol/L
CK1：DMSO
CK2：不添加
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖100.0，酵母粉8.0，黄豆饼粉2.0，硝酸钠1.0，磷酸二氢钾2.0，七水合硫酸镁0.5，氯化钙0.1。121℃，灭菌20min，冷却备用。每组实验为5个平行样。
(3)和(4)的菌体干燥和油脂提取步骤同实施例1。
菌体生长情况如表2所示，结果表明，添加较高浓度的高山被孢霉生长调节剂可明显缩短菌体延迟期，可更显著的促进菌体生长。
表2添加高山被孢霉生长调节剂对菌体生长情况的影响
实施例3
(1)制备高山被孢霉种子液同实施例1。
(2)将种子液按照8％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，并分别添加不同的高山被孢霉生长调节剂；
A组：对羟基苯乙胺80μmol/L
B组：对羟基苯乙酸80μmol/L
C组：对羟基苯丙酸80μmol/L
D组：苯乙胺80μmol/L
E组：2-苯乙醇80μmol/L
F组：对羟基苯乙醇80μmol/L
G组：对羟基苯乙胺20μmol/L，对羟基苯乙醇60μmol/
H组：对羟基苯乙酸40μmol/L，苯乙胺40μmol/L
I组：2-苯乙醇20μmol/L，对羟基苯丙酸60μmol/L
CK1：DMSO
CK2：不添加
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉5.0，黄豆饼粉4.0，硝酸钠3.0，磷酸二氢钾0.1，七水合硫酸镁0.8，氯化钙1.0g/L。121℃，灭菌20min，冷却备用。每组实验为5个平行样。
(3)和(4)的菌体干燥和油脂提取步骤同实施例1。
菌体生长情况如表3所示，结果表明，单独或混合添加高山被孢霉生长调节剂都可显著缩短菌体延迟期，有效促进菌体的生长。
表3添加高山被孢霉生长调节剂对菌体生长情况的影响
实施例4
(1)制备高山被孢霉种子液同实施例1。
(2)将种子液按照8％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，并分别添加不同的高山被孢霉生长调节剂；
A组：对羟基苯乙胺120μmol/L
B组：对羟基苯乙酸120μmol/L
C组：对羟基苯丙酸120μmol/L
D组：苯乙胺120μmol/L
E组：2-苯乙醇120μmol/L
F组：对羟基苯乙醇120μmol/L
G组：对羟基苯乙胺50μmol/L，对羟基苯乙酸40μmol/，对羟基苯乙醇30μmol/L
H组：对羟基苯丙酸40μmol/L，苯乙胺50μmol/L，2-苯乙醇30μmol/L
CK1：DMSO
CK2：不添加
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖90.0，酵母粉6.0，黄豆饼粉3.0，硝酸钠2.0，磷酸二氢钾1.0，七水合硫酸镁1.0，氯化钙0.5g/L。121℃，灭菌20min，冷却备用。每组实验为5个平行样。
(3)和(4)的菌体干燥和油脂提取步骤同实施例1。
菌体生长情况如表4所示，结果表明，添加高山被孢霉生长调节剂可显著缩短菌体延迟期，有效促进菌体的生长。
表4添加高山被孢霉生长调节剂对菌体生长情况的影响
实施例5
(1)制备高山被孢霉种子液同实施例1。
(2)将种子液按照8％的接种量接入发酵培养基28℃进行培养，并分别添加不同的高山被孢霉生长调节剂；
A组：对羟基苯乙胺100μmol/L
B组：对羟基苯乙酸100μmol/L
C组：对羟基苯丙酸100μmol/L
D组：苯乙胺100μmol/L
E组：2-苯乙醇100μmol/L
F组：对羟基苯乙醇100μmol/L
G组：对羟基苯乙胺10μmol/L，对羟基苯乙酸20μmol/，对羟基苯丙酸30μmol/L，对羟基苯乙醇40μmol/L
H组：2-苯乙醇40μmol/L，苯乙胺40μmol/L，对羟基苯乙酸10μmol/，对羟基苯丙酸10μmol/L
CK1：DMSO
CK2：不添加
发酵培养基组成成分及浓度(g/L)：葡萄糖90.0，酵母粉7.0，黄豆饼粉3.0，硝酸钠2.0，磷酸二氢钾1.5，七水合硫酸镁0.9，氯化钙0.8g/L。121℃，灭菌20min，冷却备用。每组实验为5个平行样。
(3)和(4)的菌体干燥和油脂提取步骤同实施例1。
菌体生长情况如表5所示，结果表明，添加高山被孢霉生长调节剂可显著缩短菌体延迟期，有效促进菌体的生长。
表5添加高山被孢霉生长调节剂对菌体生长情况的影响
需要特殊说明的是，以上技术方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做出改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
Claims (10)
1.一种高山被孢霉的生长调节剂，其特征在于，所述生长调节剂在高山被孢霉发酵初期加入发酵培养基用以促进高山被孢霉菌体的生长；所述生长调节剂包括如下物质中的至少一种：对羟基苯乙胺、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、苯乙胺、2-苯乙醇、对羟基苯乙醇。
2.根据权利要求1所述的高山被孢霉的生长调节剂，其特征在于，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为20-200μmol/L。
3.根据权利要求1所述的高山被孢霉的生长调节剂，其特征在于，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为80-120μmol/L。
4.根据权利要求1所述的高山被孢霉的生长调节剂，其特征在于，所述发酵初期为发酵培养基接种高山被孢霉种子液后48h内。
5.根据权利要求1所述的高山被孢霉的生长调节剂，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖80.0-100.0g/L，酵母粉5.0-8.0g/L，黄豆饼粉2.0-4.0g/L，硝酸钠1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾0.1-2.0g/L，七水合硫酸镁0.5-1.0g/L，氯化钙0.1-1.0g/L。
6.一种高山被孢霉的发酵方法，其特征在于，在高山被孢霉发酵初期，向发酵培养基中加入生长调节剂用以促进高山被孢霉菌体的生长；所述生长调节剂包括如下物质中的至少一种：对羟基苯乙胺、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、苯乙胺、2-苯乙醇、对羟基苯乙醇。
7.根据权利要求1所述的高山被孢霉的发酵方法，其特征在于，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为20-200μmol/L。
8.根据权利要求1所述的高山被孢霉的发酵方法，其特征在于，所述生长调节剂在所述发酵培养基中的总浓度为80-120μmol/L。
9.根据权利要求1所述的高山被孢霉的发酵方法，其特征在于，所述发酵初期为发酵培养基接种高山被孢霉种子液后48h内。
10.根据权利要求1所述的高山被孢霉的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：葡萄糖80.0-100.0g/L，酵母粉5.0-8.0g/L，黄豆饼粉2.0-4.0g/L，硝酸钠1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾0.1-2.0g/L，七水合硫酸镁0.5-1.0g/L，氯化钙0.1-1.0g/L。
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