CN108314700A - 一种固相合成多肽的方法、合成的磁性纳米探针及其应用 - Google Patents

一种固相合成多肽的方法、合成的磁性纳米探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种固相合成特定序列多肽的方法，该方法合成的磁性纳米探针，及其在筛选肿瘤靶向多肽药物中的应用。本发明所述的固相合成多肽的方法，利用磁性酚醛树脂复合纳米颗粒作为固相载体进行特定氨基酸序列或氨基酸个数多肽的合成。该方法使用具有磁性的固相载体，便于分离及提取，同时该复合结构固相载体能够简便的合成所需特定序列的多肽，可以作为磁性探针用于多种用途。

Description

一种固相合成多肽的方法、合成的磁性纳米探针及其应用
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种固相合成特定序列多肽的方法，该方法合成的磁性纳米探针，及其在筛选肿瘤靶向多肽药物中的应用。
背景技术
多肽作为一种有机聚合物，因其具有多种功能性和良好的生物相容性而受到越来越多的关注，使得多肽的化学合成方法也成为了有机合成领域的一大重要区域。目前，多肽合成的原理主要是以氨基酸为基本单元，并在催化剂的作用下，通过氨基酸之间羧基与氨基的反应形成酰胺键将进行连接，并以此实现多肽链的增长。但是，在传统的多肽有机合成方法中，相连接的氨基酸之间的羧基与氨基的连接通常仅仅依靠氨基酸之间的自由结合，以此得到的多肽通常都是氨基酸无规则连接的多肽结构。可见，现有多肽合成方法难以得到特定序列或特定长度氨基酸序列的多肽，得到的多肽产物也难以应用。
随着Merrifield提出了多肽的固相合成方法(Biochemistry，1964，3(3)：1385)，多肽合成技术实现了质的飞越，而固相多肽合成技术也成为了现代多肽合成的主要方法。该方法首先需要选择合适的固相载体，通过在载体表面偶联Linker来实现多肽的生长和切割，进而将一端基团保护的氨基酸逐个接枝，形成多肽链。目前常见的固相多肽合成载体主要是以聚苯乙烯为基体的Wang树脂，也有报道称可以采用聚丙烯酰胺和聚乙二醇等作为固相载体。固相多肽合成方法根据氨基酸保护基团的不同，通常可以分为Fmoc法和Boc法，而无论采用哪一种方法，都需要注意对于干扰基团的封闭和重要基团的保护。固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。固相多肽合成方法不仅简便、高效，还可以根据需要调整投料顺序，合成特定序列或特定氨基酸数量的多肽产品。
随着固相多肽合成技术的发展，多肽的合成越来越朝向规则化、多样化发展，并且其应用领域也随之进一步扩展，尤其在靶向药物筛选中发挥了重要的作用。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种固相合成多肽的方法，以解决现有技术中多肽合成难以得到特定序列或特定长度氨基酸序列的多肽的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种固相合成多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)制备表面带有酚羟基的复合固相载体；
(b)在所述复合固相载体的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸作为Linker；
(c)以步骤(b)制得的表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸的Linker作为固相载体，以Fmoc氨基保护的氨基酸作为单体，将氨基酸接枝在固相载体上，进行多肽的合成。
所述步骤(a)中，所述复合固相载体为Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球。
所述步骤(a)中，所述Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球的制备包括如下步骤：
(a-1)取超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于无水乙醇中，加入氨水混匀后，再加入TEOS进行反应，反应结束后将产物进行磁性分离，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
(a-2)将得到的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于乙醇溶液中，并加入CTAB进行反应，随后加入间苯二酚、TEOS、甲醛溶液及氨水进行反应，将反应产物离心分离，即得所需的Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球。
所述步骤(b)中，具体包括：取步骤(a)中得到的表面带有酚羟基的复合固相载体分散于DMF或DCM中，并加入对羟甲基苯氧乙酸，在HOBT/DIC/DMAP体系下进行反应。
所述的在三层核壳复合纳米颗粒表面偶联对羟甲基苯氧乙酸作为Linker的过程中，固相载体表面的酚羟基：Linker：HOBT：DIC：DMAP＝1：3：3：3：0.1(摩尔比)，利用酚羟基与羧基在催化剂的作用下发生缩合反应，将对羟甲基苯氧乙酸接枝到固相载体表面，Linker的添加量太少会导致固相多肽合成产率减小，而添加过多的Linker会导致固相多肽合成时位阻过大，易产生副产物且不会明显提升产量。
所述步骤(c)中，所述多肽的合成包括特定序列多肽的合成，具体包括如下步骤：
(c-1)将步骤(b)得到的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸的复合固相载体分散于DMF或DCM溶液中，备用；
(c-2)向上述溶液中加入Fmoc保护氨基酸进行反应，将产物进行磁性分离，洗涤后加入封羟基端溶液进行反应，以封闭未反应的羟基，待反应结束后，洗涤并脱除Fmoc保护基团，洗涤，备用；
(c-3)向步骤(c-2)所得的产物中加入含有待连接氨基酸的活泼酯溶液，与固相载体混合均匀进行反应，并对产物进行磁性分离，备用；
(c-4)向产物中加入封氨基端溶液进行反应，以封闭未反应的氨基，反应结束后产物进行磁性分离，洗涤并脱除Fmoc保护；
(c-5)重复上述步骤(c-3)-(c-4)，以得到预定氨基酸序列的多肽链。
所述步骤(c)中，所述多肽的合成包括随机序列多肽库的合成，具体包括如下步骤：
(c’-1)将步骤(b)得到的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸的复合固相载体，根据欲合成的多肽库的数量分为若干份，并分散于DMF或DCM溶液中，备用；
(c’-2)分别向上述备用溶液中加入有Fmoc保护的不同氨基酸进行反应，并将产物进行磁性分离，洗涤后加入封羟基端溶液进行反应，以封闭未反应的羟基，待反应结束后，洗涤并脱除Fmoc保护基团，备用；
(c’-3)分别向步骤(c’-2)所得的产物中加入含有不同待连接氨基酸的活泼酯溶液，与固相载体混合均匀进行反应，并对产物进行磁性分离，备用；
(c’-4)分别向各产物中加入封氨基端溶液进行反应，以封闭未反应的氨基，反应结束后产物进行磁性分离，洗涤并脱除Fmoc保护；
(c’-5)将步骤(c’-4)得到的全部接枝有不同氨基酸的固相载体混合，并再次分为所需份数，并重复上述步骤(c’-3)-(c’-4)的步骤，以得到由不同氨基酸组成的全部序列的多肽库。
更优的，所述步骤(c-2)和(c’-2)中，所述加入Fmoc保护氨基酸进行反应的步骤是在HOBT/DIC/DMAP体系下进行反应；
所述步骤(c-3)和(c’-3)中，所述活泼酯溶液为HOBT/HBTU/DIEA溶剂体系。
所述步骤(c-2)和(c’-2)中，所述封羟基端溶液为含有苯甲酸酐、DCC、DMAP的DMF或DCM溶液；
所述步骤(c-4)和(c’-4)中，所述封氨基端溶液为醋酸酐-吡啶混合液。
所述的固相多肽合成过程，采用了氨基酸大大过量，以保证尽可能的提高接枝率，所述的比例为Linker：Fmoc氨基酸：HOBT：HBTU：DIEA＝1：6：6：6：12。
本发明还公开了由所述方法制备得到的特定序列的多肽磁性微球或随机序列多肽库。
所述的多肽磁性微球或所述的随机序列多肽库用于制备肿瘤靶向磁性探针的用途。
本发明所述的固相合成多肽的方法，利用磁性酚醛树脂复合纳米颗粒作为固相载体进行特定氨基酸序列或氨基酸个数多肽的合成。所述的复合纳米颗粒是以Fe3O4为磁性核心，设计并合成了Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒，首先利用酚羟基与羧基的缩合反应，将对羟甲基苯氧乙酸耦合在微球的表面作为Linker，以方便氨基酸的接枝及最后多肽链从微球表面切下。同时，本发明所述多肽合成采用了Fmoc保护的氨基酸作为原料，主要利用了氨基酸羧基与氨基的缩合反应，同时在过程中封闭多余或未反应的基团，脱除Fmoc基团逐步将氨基酸接上，最终得到特定序列的多肽或特定氨基酸个数全部序列的多肽库。
本发明所述方法还可以在偶联有Linker的固相载体上合成肽库，并将负载多肽库的固相载体作为磁性探针通过小鼠活体注射来筛选肿瘤靶向多肽，含有多肽库的磁性纳米颗粒在肿瘤细胞处富集后，将肿瘤组织取出并粉碎，利用磁性将负载有多肽库的固相载体分离出来，切割并检测多肽序列，得到具有肿瘤细胞靶向功能的多肽序列。
本发明所述固相合成多肽的方法使用具有磁性的固相载体，便于分离及提取，同时该复合结构固相载体能够简便的合成所需特定序列的多肽，可以作为磁性探针用于多种用途。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为所述Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒透射电镜示照片；
图2为本发明所述Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒修饰Linker前后红外吸收光谱对比图；
图3为本发明所述Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒作为固相载体合成特定五肽的ESI-MS检测谱图。
具体实施方式
实施例1
将0.1g超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于100ml无水乙醇中，加入1.0ml氨水，混合均匀后再加入200μLTEOS，置于功率为100w的超声机中，超声6h，每隔2h添加200μLTEOS，共添加2次，反应结束后将产物磁性分离，使用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
取0.05g所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于30ml无水乙醇和30ml去离子水的混合溶液中，加入0.075g CTAB，置于功率为100W的超声机中超声2h，加入0.048g间苯二酚，75μLTEOS，搅拌10min后加入183μL甲醛溶液，230μL氨水，室温搅拌24h，将产物离心分离，乙醇清洗3次，得到所需的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒。
所述Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒的透射电镜图如附图1所示，所述的Fe3O4核心粒径约100nm，所述的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒粒径约为200nm。
取0.02g上述得到的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳纳米颗粒溶于15ml DMF中，并加入0.5mmol对羟甲基苯氧乙酸，以及0.5mmol HOBT、0.5mmol DIC、0.01mmol DMAP混匀，混合均匀后置于恒温水浴摇床中，25℃反应15h，反应结束后使用DMF清洗三次，得到表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的固相载体。所述Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒在表面偶联修饰有对羟甲基苯氧乙酸Linker前后的红外吸收光谱对比图见附图2所示，曲线自上向下依次为SiO2@PF、Linker、SiO2@PF-Linker。
本实施例所述合成多肽结构为甘氨酸-蛋氨酸-缬酰胺-异亮氨酸-异亮氨酸特定序列五肽，以所述偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒为固相载体进行多肽合成。
将上述制得的对羟甲基苯氧乙酸修饰的三层复合结构纳米颗粒分散于15ml DMF溶液中，并向所得溶液中加入1.5mmol Fmoc保护氨基酸、1.5mmol HOBT、1.5mmol DIC和0.05mmol的DMAP，充分溶解后放入恒温水浴摇床中25℃反应12h，反应结束后将产物磁性分离，用DMF洗涤5次，加入含有苯甲酸酐、DCC、DMAP(摩尔比3：3：0.1)的DMF溶液，反应1h，以封闭未反应的羟基；待反应结束后，使用DMF洗涤5次，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液，以脱除Fmoc保护基团，DMF洗涤5次；
向所得的接枝产物中加入15mL氨基酸活泼酯溶液，所述的氨基酸活泼酯溶液包括以下组成：1.5mmol Fmoc保护氨基酸(甘氨酸)、1.5mmol HBTU、1.5mmol HOBT、3mmol DIEA。所述的活泼酯溶液在加入到固相载体反应器之前，应至少室温活化30min。所述氨基酸活泼酯溶液与所述固相载体混合均匀后，置于恒温水浴摇床中25℃反应4h，待反应结束后，磁性分离，产物用DMF洗涤5次；
待洗涤完成后，加入醋酸酐-吡啶(体积比1：1)的混合溶液10ml，进行反应1h，以封闭未反应的氨基，反应结束后进行磁性分离，所得产物用DMF洗涤5次，洗涤完成后，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液以脱除Fmoc保护，反应结束后用DMF洗涤5次，得到接枝有甘氨酸的多肽；
重复上述利用氨基酸活泼酯溶液进行氨基酸接枝的步骤，依次将蛋氨酸-缬酰胺-异亮氨酸-异亮氨酸进行接枝，得到所需氨基酸序列(甘氨酸-蛋氨酸-缬酰胺-异亮氨酸-异亮氨酸)的多肽链。将上述固定序列的五肽使用K试剂切割下来，通过ESI-MS质谱进行分析检测，其ESI-MS检测结果检测谱图见附图3所示。可见，制得所述多肽的结构与预期相符。而所述特定氨基酸序列的五肽也可以不使用K试剂切割，直接作为磁性探针使用。
实施例2
将0.1g超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于100ml无水乙醇中，加入1.0ml氨水，混合均匀后再加入200μLTEOS，置于功率为100w的超声机中，超声6h，每隔2h添加200μLTEOS，共添加2次，反应结束后将产物磁性分离，使用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
取0.05g所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于30ml无水乙醇和30ml去离子水的混合溶液中，加入0.075g CTAB，置于功率为100W的超声机中超声2h，加入0.1g间苯二酚，75μLTEOS，搅拌10min后加入366μL甲醛溶液，230μL氨水，室温搅拌24h，将产物离心分离，乙醇清洗3次，得到所需的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒。
取0.02g上述得到的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳纳米颗粒溶于15ml DCM中，并加入0.5mmol对羟甲基苯氧乙酸，以及0.5mmol HOBT、0.5mmol DIC、0.01mmol DMAP混匀，混合均匀后置于恒温水浴摇床中，25℃反应15h，反应结束后使用DCM清洗三次，得到表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的固相载体。
本实施例所述合成多肽结构为甘氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸特定序列5肽结构，以所述偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒为固相载体进行多肽合成。
将上述制得的对羟甲基苯氧乙酸修饰的三层复合结构纳米颗粒分散于15mlDCM溶液中，并向所得溶液中加入1.5mmol Fmoc保护氨基酸(甘氨酸)、1.5mmol HOBT、1.5mmolDIC和0.05mmol的DMAP，充分溶解后放入恒温水浴摇床中25℃反应12h，反应结束后将产物磁性分离，用DMF洗涤5次，加入含有苯甲酸酐、DCC、DMAP(摩尔比3：3：0.1)的DCM溶液，反应1h，以封闭未反应的羟基；待反应结束后，使用DCM洗涤5次，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DCM溶液，以脱除Fmoc保护基团，DCM洗涤5次；
向所得的接枝产物中加入15mL氨基酸活泼酯溶液，所述的氨基酸活泼酯溶液包括以下组成：1.5mmol Fmoc保护氨基酸(蛋氨酸)、1.5mmol HBTU、1.5mmol HOBT、3mmol DIEA。所述的活泼酯溶液在加入到固相载体反应器之前，应至少室温活化30min。所述氨基酸活泼酯溶液与所述固相载体混合均匀后，置于恒温水浴摇床中25℃反应4h，待反应结束后，磁性分离，产物用DCM洗涤5次；
待洗涤完成后，加入醋酸酐-吡啶(体积比1：1)的混合溶液10ml，进行反应1h，以封闭未反应的氨基，反应结束后进行磁性分离，所得产物用DCM洗涤5次，洗涤完成后，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DCM溶液以脱除Fmoc保护，反应结束后用DMF洗涤5次，得到接枝有甘氨酸-蛋氨酸的多肽；
重复上述利用氨基酸活泼酯溶液进行氨基酸接枝的步骤，依次将所需的蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等氨基酸进行接枝，得到所需氨基酸序列的多肽链。
实施例3
将0.1g超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于100ml无水乙醇中，加入1.0ml氨水，混合均匀后再加入200μL TEOS，置于功率为100w的超声机中，超声6h，每隔2h添加200μL TEOS，共添加2次，反应结束后将产物磁性分离，使用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
取0.05g所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于30ml无水乙醇和30ml去离子水的混合溶液中，加入0.075g CTAB，置于功率为100W的超声机中超声2h，加入0.048g间苯二酚，75μLTEOS，搅拌10min后加入183μL甲醛溶液，230μL氨水，室温搅拌24h，将产物离心分离，乙醇清洗3次，得到所需的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒。
取0.02g上述得到的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳纳米颗粒溶于15mlDMF中，并加入1.0mmol对羟甲基苯氧乙酸，以及1.0mmol HOBT、1.0mmol DIC、0.02mmol DMAP混匀，混合均匀后置于恒温水浴摇床中，25℃反应15h，反应结束后使用DMF清洗三次，得到表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的固相载体。本实施例所述的制备方法得到的固相载体偶联有更多的对羟甲基苯氧乙酸，以该微球为固相载体可以制备特定序列的多肽或特定数量氨基酸的多肽库。
本实施例所述合成多肽结构为甘氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸特定序列5肽结构，以所述偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒为固相载体进行多肽合成。
将上述制得的对羟甲基苯氧乙酸修饰的三层复合结构纳米颗粒分散于15ml DMF溶液中，并向所得溶液中加入1.5mmol Fmoc保护氨基酸(甘氨酸)、1.5mmol HOBT、1.5mmolDIC和0.05mmol的DMAP，充分溶解后放入恒温水浴摇床中25℃反应12h，反应结束后将产物磁性分离，用DMF洗涤5次，加入含有苯甲酸酐、DCC、DMAP(摩尔比3：3：0.1)的DMF溶液，反应1h，以封闭未反应的羟基；待反应结束后，使用DMF洗涤5次，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液，以脱除Fmoc保护基团，DMF洗涤5次；
向所得的接枝产物中加入15mL氨基酸活泼酯溶液，所述的氨基酸活泼酯溶液包括以下组成：1.5mmol Fmoc保护氨基酸(蛋氨酸)、1.5mmol HBTU、1.5mmol HOBT、3mmol DIEA。所述的活泼酯溶液在加入到固相载体反应器之前，应至少室温活化30min。所述氨基酸活泼酯溶液与所述固相载体混合均匀后，置于恒温水浴摇床中25℃反应4h，待反应结束后，磁性分离，产物用DMF洗涤5次；
待洗涤完成后，加入醋酸酐-吡啶(体积比1：1)的混合溶液10ml，进行反应1h，以封闭未反应的氨基，反应结束后进行磁性分离，所得产物用DMF洗涤5次，洗涤完成后，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液以脱除Fmoc保护，反应结束后用DMF洗涤5次，得到接枝有甘氨酸-蛋氨酸的多肽；
重复上述利用氨基酸活泼酯溶液进行氨基酸接枝的步骤，依次将所需的蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等氨基酸进行接枝，得到所需氨基酸序列的多肽链。
实施例4
将0.1g超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于100ml无水乙醇中，加入1.0ml氨水，混合均匀后再加入200μL TEOS，置于功率为100w的超声机中，超声6h，每隔2h添加200μL TEOS，共添加2次，反应结束后将产物磁性分离，使用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
取0.05g所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于30ml无水乙醇和30ml去离子水的混合溶液中，加入0.075g CTAB，置于功率为100W的超声机中超声2h，加入0.048g间苯二酚，75μLTEOS，搅拌10min后加入183μL甲醛溶液，230μL氨水，室温搅拌24h，将产物离心分离，乙醇清洗3次，得到所需的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒。
取0.02g上述得到的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳纳米颗粒溶于15ml DMF中，并加入0.5mmol对羟甲基苯氧乙酸，以及0.5mmol HOBT、0.5mmol DIC、0.01mmol DMAP混匀，混合均匀后置于恒温水浴摇床中，25℃反应15h，反应结束后使用DMF清洗三次，得到表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的固相载体。
本实施例所述合成多肽结构为甘氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸特定序列5肽结构，以所述偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒为固相载体进行多肽合成。
将上述制得的对羟甲基苯氧乙酸修饰的三层复合结构纳米颗粒分散于15ml DMF溶液中，并向所得溶液中加入1.5mmol Fmoc保护氨基酸(甘氨酸)、1.5mmol HOBT、1.5mmolDIC和0.05mmol的DMAP，充分溶解后放入恒温水浴摇床中25℃反应12h，反应结束后将产物磁性分离，用DMF洗涤5次，加入含有苯甲酸酐、DCC、DMAP(摩尔比3：3：0.1)的DMF溶液，反应1h，以封闭未反应的羟基；待反应结束后，使用DMF洗涤5次，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液，以脱除Fmoc保护基团，DMF洗涤5次；
向所得的接枝产物中加入15mL氨基酸活泼酯溶液，所述的氨基酸活泼酯溶液包括以下组成：2mmol Fmoc保护氨基酸(蛋氨酸)、2mmol HBTU、2mmolHOBT、4mmol DIEA。所述的活泼酯溶液在加入到固相载体反应器之前，应至少室温活化30min。所述氨基酸活泼酯溶液与所述固相载体混合均匀后，置于恒温水浴摇床中25℃反应4h，待反应结束后，磁性分离，产物用DMF洗涤5次；
待洗涤完成后，加入醋酸酐-吡啶(体积比1：1)的混合溶液10ml，进行反应1h，以封闭未反应的氨基，反应结束后进行磁性分离，所得产物用DMF洗涤5次，洗涤完成后，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液以脱除Fmoc保护，反应结束后用DMF洗涤5次，得到接枝有甘氨酸-蛋氨酸的多肽；
重复上述利用氨基酸活泼酯溶液进行氨基酸接枝的步骤，依次将所需的蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等氨基酸进行接枝，得到所需氨基酸序列的多肽链。
实施例5
将0.1g超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于100ml无水乙醇中，加入1.0ml氨水，混合均匀后再加入200μL TEOS，置于功率为100w的超声机中，超声6h，每隔2h添加200μL TEOS，共添加2次，反应结束后将产物磁性分离，使用去离子水和无水乙醇交替清洗3次，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
取0.05g所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于30ml无水乙醇和30ml去离子水的混合溶液中，加入0.075g CTAB，置于功率为100W的超声机中超声2h，加入0.048g间苯二酚，75μLTEOS，搅拌10min后加入183μL甲醛溶液，230μL氨水，室温搅拌24h，将产物离心分离，乙醇清洗3次，得到所需的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳结构纳米颗粒。
取0.02g上述得到的Fe3O4@SiO2@PF三层核壳纳米颗粒溶于15ml DMF中，并加入0.5mmol对羟甲基苯氧乙酸，以及0.5mmol HOBT、0.5mmol DIC、0.01mmol DMAP混匀，混合均匀后置于恒温水浴摇床中，25℃反应15h，反应结束后使用DMF清洗三次，得到表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的固相载体。
本实施例所述合成多肽结构为甘氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、异亮氨酸组成的5肽库，以所述偶联有对羟甲基苯氧乙酸Linker的Fe3O4@SiO2@PF三层复合纳米颗粒为固相载体进行多肽合成。
将上述制得的对羟甲基苯氧乙酸修饰的三层复合结构纳米颗粒分散于15ml DMF溶液中，充分分散后等分成五份，向每份溶液中对应加入0.3mmol Fmoc保护氨基酸(分别为甘氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、异亮氨酸)、0.3mmol HOBT、0.3mmol DIC和0.02mmol的DMAP，充分溶解后放入恒温水浴摇床中25℃反应12h，反应结束后将产物磁性分离，用DMF洗涤5次，加入含有苯甲酸酐、DCC、DMAP(摩尔比3：3：0.1)的DMF溶液，反应1h，以封闭未反应的羟基；待反应结束后，使用DMF洗涤5次，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液，以脱除Fmoc保护基团，DMF洗涤5次；
将所得的五份接枝产物混合在一起，加入15mlDMF充分混合后，重新分成五份，向重新分组的五份接枝产物中分别加入3mL氨基酸活泼酯溶液，所述的氨基酸活泼酯溶液包括以下组成：1mmol Fmoc保护氨基酸(分别为甘氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、异亮氨酸)、1mmol HBTU、1mmolHOBT、2mmol DIEA。所述的活泼酯溶液在加入到固相载体反应器之前，应至少室温活化30min。所述氨基酸活泼酯溶液与所述固相载体混合均匀后，置于恒温水浴摇床中25℃反应4h，待反应结束后，磁性分离，产物用DMF洗涤5次；
待洗涤完成后，加入醋酸酐-吡啶(体积比1：1)的混合溶液10ml，进行反应1h，以封闭未反应的氨基，反应结束后进行磁性分离，所得产物用DMF洗涤5次，洗涤完成后，加入15ml体积分数为20％的二乙胺/DMF溶液以脱除Fmoc保护，反应结束后用DMF洗涤5次，得到接枝有二肽库的多肽；
重复上述利用氨基酸活泼酯溶液进行氨基酸接枝的步骤，每次都均分成五份，向其中分别加入五种氨基酸活泼酯溶液进行接枝，得到所需氨基酸数量的多肽库。
将得到的具有全部5种氨基酸序列的多肽库，可以通过将磁性微球注射进患肿瘤的小鼠体内，或者直接在肿瘤细胞的培养基上进行筛选，对富集在肿瘤细胞处的固相载体进行分离，通过K试剂将固相载体表面的多肽切割下来，分析检测其氨基酸序列，得到具有肿瘤靶向能力的多肽序列。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种固相合成多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)制备表面带有酚羟基的复合固相载体；
(b)在所述复合固相载体的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸作为Linker；
(c)以步骤(b)制得的表面偶联有对羟甲基苯氧乙酸的Linker作为固相载体，以Fmoc氨基保护的氨基酸作为单体，将氨基酸接枝在固相载体上，进行多肽的合成。
2.根据权利要求1所述的固相合成多肽的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述复合固相载体为Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球。
3.根据权利要求2所述的固相合成多肽的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球的制备包括如下步骤：
(a-1)取超顺磁性Fe3O4纳米颗粒分散于无水乙醇中，加入氨水混匀后，再加入TEOS进行反应，反应结束后将产物进行磁性分离，得到Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
(a-2)将得到的Fe3O4@SiO2纳米颗粒分散于乙醇溶液中，并加入CTAB进行反应，随后加入间苯二酚、TEOS、甲醛溶液及氨水进行反应，将反应产物离心分离，即得所需的Fe3O4@SiO2@PF三层磁性核壳结构的微球。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固相合成多肽的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，具体包括：取步骤(a)中得到的表面带有酚羟基的复合固相载体分散于DMF或DCM中，并加入对羟甲基苯氧乙酸，在HOBT/DIC/DMAP体系下进行反应。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固相合成多肽的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，所述多肽的合成包括特定序列多肽的合成，具体包括如下步骤：
(c-1)将步骤(b)得到的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸的复合固相载体分散于DMF或DCM溶液中，备用；
(c-2)向上述溶液中加入Fmoc保护氨基酸进行反应，将产物进行磁性分离，洗涤后加入封羟基端溶液进行反应，以封闭未反应的羟基，待反应结束后，洗涤并脱除Fmoc保护基团，洗涤，备用；
(c-3)向步骤(c-2)所得的产物中加入含有待连接氨基酸的活泼酯溶液，与固相载体混合均匀进行反应，并对产物进行磁性分离，备用；
(c-4)向产物中加入封氨基端溶液进行反应，以封闭未反应的氨基，反应结束后产物进行磁性分离，洗涤并脱除Fmoc保护；
(c-5)重复上述步骤(c-3)-(c-4)，以得到预定氨基酸序列的多肽链。
6.根据权利要求1-4任一项所述的固相合成多肽的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，所述多肽的合成包括随机序列多肽库的合成，具体包括如下步骤：
(c’-1)将步骤(b)得到的表面偶联对羟甲基苯氧乙酸的复合固相载体，根据欲合成的多肽库的数量分为若干份，并分散于DMF或DCM溶液中，备用；
(c’-2)分别向上述备用溶液中加入有Fmoc保护的不同氨基酸进行反应，并将产物进行磁性分离，洗涤后加入封羟基端溶液进行反应，以封闭未反应的羟基，待反应结束后，洗涤并脱除Fmoc保护基团，备用；
(c’-3)分别向步骤(c’-2)所得的产物中加入含有不同待连接氨基酸的活泼酯溶液，与固相载体混合均匀进行反应，并对产物进行磁性分离，备用；
(c’-4)分别向各产物中加入封氨基端溶液进行反应，以封闭未反应的氨基，反应结束后产物进行磁性分离，洗涤并脱除Fmoc保护；
(c’-5)将步骤(c’-4)得到的全部接枝有不同氨基酸的固相载体混合，并再次分为所需份数，并重复上述步骤(c’-3)-(c’-4)的步骤，以得到由不同氨基酸组成的全部序列的多肽库。
7.根据权利要求5或6所述的固相合成多肽的方法，其特征在于：
所述步骤(c-2)和(c’-2)中，所述加入Fmoc保护氨基酸进行反应的步骤是在HOBT/DIC/DMAP体系下进行反应；
所述步骤(c-3)和(c’-3)中，所述活泼酯溶液为HOBT/HBTU/DIEA溶剂体系。
8.根据权利要求5-7任一项所述的固相合成多肽的方法，其特征在于：
所述步骤(c-2)和(c’-2)中，所述封羟基端溶液为含有苯甲酸酐、DCC、DMAP的DMF或DCM溶液；
所述步骤(c-4)和(c’-4)中，所述封氨基端溶液为醋酸酐-吡啶混合液。
9.由权利要求1-8任一项所述方法制备得到的特定序列的多肽磁性微球或随机序列多肽库。
10.权利要求9所述的多肽磁性微球或所述的随机序列多肽库用于制备肿瘤靶向磁性探针的用途。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0231728B1 (en) * 1986-02-07 1991-05-22 SCLAVO S.p.A. Synthetic peptide with human interleukin 1 activity
CN102784615A (zh) * 2012-08-17 2012-11-21 中国科学院电工研究所 一种磁性铜离子印迹硅胶材料的制备方法
CN102688760B (zh) * 2012-06-07 2014-04-02 北京科技大学 Fe3O4/CuO/pSiO2催化剂及其制备方法
CN103965285A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 北京大学 一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法
CN104907042A (zh) * 2015-05-14 2015-09-16 河南师范大学 一种碳-Fe3O4磁性活性炭的制备方法
CN106782986A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 齐鲁工业大学 一种介孔双壳层核壳结构的磁性复合材料及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0231728B1 (en) * 1986-02-07 1991-05-22 SCLAVO S.p.A. Synthetic peptide with human interleukin 1 activity
CN102688760B (zh) * 2012-06-07 2014-04-02 北京科技大学 Fe3O4/CuO/pSiO2催化剂及其制备方法
CN102784615A (zh) * 2012-08-17 2012-11-21 中国科学院电工研究所 一种磁性铜离子印迹硅胶材料的制备方法
CN103965285A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 北京大学 一种以超顺磁纳米颗粒为固相进行多肽合成及同步构建多肽磁纳米探针的方法
CN104907042A (zh) * 2015-05-14 2015-09-16 河南师范大学 一种碳-Fe3O4磁性活性炭的制备方法
CN106782986A (zh) * 2017-01-23 2017-05-31 齐鲁工业大学 一种介孔双壳层核壳结构的磁性复合材料及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEI YOU 等: "Biopanning and characterization of peptides with Fe3O4 nanoparticles-binding capability via phage display random peptide library technique", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》 *
LI ZHU 等: "Mixed hemimicelles SPE based on CTAB-coated Fe3O4/SiO2 NPs for the determination of herbal bioactive constituents from biological samples", 《TALANTA》 *
SHI-RUI GUO 等: "Biocompatible, Luminescent Silver@Phenol Formaldehyde Resin Core/Shell Nanospheres: Large-Scale Synthesis and Application for In Vivo Bioimaging", 《ADV. FUNCT. MATER.》 *
马武伟: "具有不同结构的磁性杂化微球的制备及性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

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