CN101302008B - 一种单加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法，属于化学固相合成领域。该方法包括以下步骤：将负载氨基酸的树脂与C60甲苯溶液反应，过滤C60甲苯，在树脂中加入裂解液反应，过滤树脂、洗涤、收集裂解液和洗涤液干燥后得到单加成富勒烯氨基酸。本发明的方法步骤简单，特别是在纯化步骤只需过滤，简化了分离过程。另外，氨基酸的种类任意，可以合成相同结构的各种单加成富勒烯氨基酸衍生物。该方法适于组合化学大规模合成筛选。采用该方法合成的化合物具有许多的特性，如荧光性质，生物学活性。此类化合物还可以制备成纳米材料，有作为靶向药物载体的应用前景。

Description

一种单加成富勒烯氨基酸衍生物的固相合成方法
技术领域
本发明涉及一种单加成富勒烯氨基酸的固相合成方法，属于化学固相合成领域。
背景技术
1963年美国化学家Merrifield创建固相肽合成，标志着当代固相有机合成化学时代的开始。固相合成是指反应时键连在固相载体上的底物结构处于适当的溶剂中，与外加构件分子及试剂分子在固液两相交界处进行有关的化学反应，过滤后经适当反应切断连接键得到目标产物。其特点如下：①操作简单：过滤-淋洗-再过滤；②使用过量的试剂：一般至少3倍于底物；③假稀释效应：可以避免分子间的成键。固相法合成肽的一般合成步骤为：将羧基端的氨基酸键连到功能化载体(树脂)上，得到负载氨基酸的树脂；组装各个氨基酸，进行缩合反应；目标肽的主链序列组装完全后，使用树脂裂解液脱除侧链保护基以及切除载体，纯化后得到产物。裂解时采用酸解方式，包括Fmoc策略裂解肽树脂方法和Boc策略裂解肽树脂方法，Fmoc策略裂解肽树脂方法采用以三氟乙酸为主要成分的有机试剂，配合苯甲硫醚等清除剂对树脂进行酸解。
现有合成富勒烯氨基酸衍生物方法可以分为固相合成和液相合成方法，其中固相合成纯化步骤简单，易于大规模合成。2001年Federica合成了可以用于固相肽合成的新型富勒烯谷氨酸衍生物，随后以富勒烯谷氨酸衍生物为前体通过固相合成制备了一系列富勒烯肽衍生物但采用该方法合成的富勒烯氨基酸种类有限，不能得到任意氨基酸侧链的单加成富勒烯氨基酸衍生物。
Romanova将氨基酸或二肽与C60直接反应得到以单加成富勒烯氨基酸(这些产物的红外谱图没有C60的特征吸收峰而是显示两性离子形式的氨基酸和肽组分的吸收峰。Kotelnikova等研究了此类单加成富勒烯氨基酸C60-DL-alanine和C60-DL-alanine-DL-alanine对不同膜区的通透性，结果表明它们具有很强的膜亲和力，可以很好地通过磷脂双分子层，且不会破坏膜的完整性。该方法采用液相合成，纯化麻烦，不能保证富勒烯与氨基酸的单加成。
研究发现富勒烯及其衍生物具有许多的生物学活性，包括酶活性抑制、活性氧清除与产生、DNA切割、光诱导细胞损伤等，不断增加的实验资料提示富勒烯及其衍生物在生物医药领域具有相当广泛的应用前景，如作为光动力学治疗中的光敏剂、抗衰老药物、反义核酸药物和药物载体。近年来，以未修饰的富勒烯为结构成分的富勒烯纳米颗粒与碳纳米管等纳米生物材料的研究受到了高度重视。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种单加成富勒烯氨基酸的固相合成方法，解决液相合成方法的纯化麻烦，不能保证富勒烯与氨基酸的单加成的问题。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
本发明的一种单加成富勒烯氨基酸的固相合成方法具体步骤为：
步骤一：将负载氨基酸的固相肽合成树脂加入到纯度大于99.0％的二氯甲烷或纯度大于99.0％的二甲基酰胺或两者的混和液，其中二氯甲烷和二甲基酰胺混合比例任意，且每1g树脂加入0.25mL以上的二氯甲烷和二甲基酰胺混和液。溶胀1～2小时，抽滤后得到的负载氨基酸的固相肽合成树脂备用。
步骤二：将富勒烯溶于纯度大于99.0％的甲苯，加入上述抽滤后的负载氨基酸的固相肽合成树脂，搅拌反应20h～50h，得到负载富勒烯氨基酸的树脂，过滤。其中每100mL的甲苯加入150～260mg的富勒烯。
步骤三：将过滤后负载富勒烯氨基酸的树脂在20～70℃下用纯度大于99.0％的甲苯抽滤洗涤树脂2次以上，再以纯度大于99.0％的二氯甲烷洗涤3次以上。其中每次洗涤时，每1g树脂加入0.5mL以上的甲苯，每1g树脂加入0.5mL以上的二氯甲烷。
步骤四：在室温下将洗涤后所得负载富勒烯氨基酸的树脂与树脂裂解液反应1.5～2.5h，过滤裂解液后备用；再用洗涤液洗涤树脂2次以上，过滤洗涤液备用。其中裂解液为体积百分比40％以上纯度大于99.0％的三氟乙酸，体积百分比1％～30％的清除剂，其余为纯度大于99.0％的二氯甲烷或纯度大于99.0％二甲基酰胺。其中清除剂是苯甲硫醚、硫代甲基醚、二巯基乙醚中的一种或几种。洗涤液为含纯度大于99.0％的三氟乙酸的所有有机溶剂。每1g树脂加入0.25mL以上的裂解液，每1g树脂加入0.5mL以上的洗涤液。
步骤五：收集上述所有裂解液和洗涤液混合，在0℃以下加入纯度大于99.0％的甲基叔丁基醚，放于低于0℃的温度10h以上，离心，得到含杂质的目标产物，其中甲基叔丁基醚、裂解液和洗涤液的之间的体积比1∶1∶1至30∶1∶2。在本步骤中在加入甲基叔丁基醚之前也可以通入氩气，以使目标产物更快的从液体中析出。
步骤六：在-20℃～0℃的温度下用纯度大于99.0％的甲基叔丁基醚洗涤3次以上，干燥后得到目标产物，其中每次洗涤时，每1g树脂加入1mL以上的甲基叔丁基醚。
有益效果
本发明的方法步骤简单，特别是在纯化步骤只需过滤，简化了分离过程。另外，氨基酸的种类任意，可以合成相同结构的各种氨基酸富勒烯衍生物。该方法适于组合化学大规模合成筛选。
具体实施例
实施例一：
1.将0.55mmol/g的H-Cys(Trt)-2Cl-Trt树脂0.6g加入纯度为99.0％的二氯甲烷溶胀2h，抽滤备用。
2.在35℃下将240mg C60溶于100ml纯度为99.0％的甲苯搅拌超声溶解后，加入上述抽滤后的树脂50℃搅拌反应40h。
3.用砂芯漏斗将树脂从反应液中分离，在50℃下用纯度为99.0％的甲苯抽滤洗涤树脂，再以二氯甲烷洗涤6次，每次2min，抽滤得到固体树脂。
4.将所得树脂与5ml裂解液室温反应2h，用砂芯漏斗过滤裂解液后备用，再用纯度为99.0％的三氟乙酸洗涤树脂两次，用砂芯漏斗过滤洗涤液备用，该裂解液为纯度均为99.0％的二巯基乙醚、苯甲硫醚、三氟乙酸、二氯甲烷，体积比为1％、5％、44％、50％。。
5.收集上述裂解液和洗涤液并混合，向其中通氩气15min后加入15mL纯度为99.0％的甲基叔丁基醚，放于-20℃的冰箱15h，离心后所得固体沉淀在-20℃下用纯度为99.0％的甲基叔丁基醚洗涤4次后过滤出沉淀，干燥后得目标产物C60(H)NHCH(COOH)CH2SH，产率为10％。
实施例二：
1.将0.55mmol/g的H-Cys(Trt)-2Cl-Trt树脂0.6g加入纯度为99.0％的二氯甲烷溶胀2h，抽滤备用。
2.在35℃下将240mg C60溶于100ml纯度为99.0％的甲苯搅拌超声溶解后，加入上述抽滤后的树脂50℃搅拌反应20h。
3.用砂芯漏斗将树脂从反应液中分离，在50℃下用纯度为99.0％的甲苯抽滤洗涤树脂，再以纯度为99.0％的二氯甲烷洗涤6次，每次2min，抽滤得到固体树脂。
4.将所得树脂与5ml裂解液室温反应2h，用砂芯漏斗过滤裂解液后备用，再用纯度为99.0％三氟乙酸洗涤树脂两次，用砂芯漏斗过滤洗涤液备用，该裂解液为纯度均为99.0％的二巯基乙醚、苯甲硫醚、三氟乙酸、二氯甲烷，体积比为1％、5％、44％、50％。。
5.收集上述裂解液和洗涤液并混合，向其中通氩气15min后加入15mL纯度为99.0％的甲基叔丁基醚，混匀后放于-20℃的冰箱15h，离心后所得固体沉淀在-20℃下用纯度为99.0％的甲基叔丁基醚洗涤4次后过滤出沉淀，干燥后得目标产物C60(H)NHCH(COOH)CH2SH，产率为5％。
实施例三：
1.将0.6mmol/g的H-Lys(Boc)-Wang树脂0.5g，加入纯度为99.0％的二氯甲烷和纯度为99.0％的二甲基酰胺(1∶9，体积比)溶胀1h，抽滤备用。
2.在35℃下将240mg C60溶于100ml纯度为99.0％甲苯搅拌超声溶解后，加入上述抽滤后的树脂50℃搅拌反应30h。
3.用砂芯漏斗将树脂从反应液中分离，在50℃下用纯度为99.0％的甲苯洗涤树脂。再以纯度为99.0％的二氯甲烷洗涤6次每次1分钟，抽滤得到固体树脂。
4.将所得树脂与4ml裂解液室温反应2h，用砂芯漏斗过滤裂解液后备用，用纯度为99.0％三氟乙酸洗涤树脂两次，用砂芯漏斗过滤洗涤液备用，该裂解液为纯度均为99.0％的三氟乙酸、苯甲硫醚、二氯甲烷，体积比为95％、2.5％、2.5％混合。。
5.收集上述裂解液和洗涤液并混合，在-20℃下向其中加入20mL纯度为99.0％的甲基叔丁基醚置于冰箱20h，离心后所得固体沉淀在-20℃下用甲基叔丁基醚洗涤5次后再过滤出沉淀，干燥后得目标产物C60(H)NHCH(COOH)(CH2)4NH2，产率为7％。
实施例四：
1.0.6mmol/g H-Lys(Boc)-Rink树脂0.5g，加二氯甲烷和二甲基酰胺(1∶9，体积比)溶胀1h，抽滤备用。
2.在35℃下将240mg C60溶于100ml纯度为99.0％的甲苯搅拌超声溶解后，加入上述抽滤后的树脂50℃搅拌反应30h。
3.用砂芯漏斗将树脂从反应液中分离，在50℃下用纯度为99.0％的甲苯洗涤树脂。再以纯度为99.0％的二氯甲烷洗涤6次每次1分钟，抽滤得到固体树脂。
4.将所得树脂与4ml裂解液室温反应2h，用砂芯漏斗过滤裂解液后备用，用纯度为99.0％的三氟乙酸洗涤树脂两次，用砂芯漏斗过滤洗涤液备用，该裂解液为纯度均为99.0％的三氟乙酸、苯甲硫醚、二氯甲烷按体积比95％、2.5％、2.5％混合。。
5.收集上述裂解液和洗涤液并混合，在-20℃下向其中加入为15mL纯度为99.0％的甲基叔丁基醚置于冰箱20h，离心后所得固体沉淀在-20℃下用纯度为99.0％的甲基叔丁基醚洗涤5次后再过滤出沉淀，干燥后得目标产物C60(H)NHCH(COOH)(CH2)4NH2，产率为12％。

Claims (6)

1.一种单加成富勒烯氨基酸的固相合成方法，其特征在于：
具体制备步骤如下：
步骤一：将负载氨基酸的固相肽合成树脂加入到纯度大于99.0％的二氯甲烷或纯度大于99.0％的二甲基酰胺或两者的混和液，溶胀1～2小时，抽滤后得到的负载氨基酸的固相肽合成树脂备用；
步骤二：将富勒烯溶于纯度大于99.0％的甲苯，加入上述抽滤后的负载氨基酸的固相肽合成树脂，搅拌反应20h～50h，得到负载富勒烯氨基酸的树脂，过滤；
步骤三：将过滤后负载富勒烯氨基酸的树脂在20～70℃下用纯度大于99.0％的甲苯抽滤洗涤树脂2次以上，再以纯度大于99.0％的二氯甲烷洗涤3次以上；
步骤四：在室温下将洗涤后所得负载富勒烯氨基酸的树脂与树脂裂解液反应1.5～2.5h，过滤裂解液后备用；再用洗涤液洗涤树脂2次以上，过滤洗涤液备用；
步骤五：收集上述所有裂解液和洗涤液混合，在0℃以下加入纯度大于99.0％的甲基叔丁基醚，放于低于0℃的温度10h以上，离心，得到含杂质的目标产物；
步骤六：在-20℃～0℃的温度下用纯度大于99.0％的甲基叔丁基醚洗涤3次以上，干燥后得到目标产物；
其中裂解液为体积百分比40％以上纯度大于99.0％的三氟乙酸、体积百分比1％～30％的清除剂，其余为纯度大于99.0％的二氯甲烷或纯度大于99.0％二甲基酰胺；清除剂为苯甲硫醚、硫代甲基醚、二巯基乙醚中的一种或几种；
洗涤液为含纯度大于99.0％的三氟乙酸的所有有机溶剂；
其中，每1g树脂加入0.25mL以上的裂解液，每1g树脂加入0.5mL以上的洗涤液；甲基叔丁基醚、裂解液和洗涤液的之间的体积比1∶1∶1至30∶1∶2。
2.如权利要求1所述的步骤一，其特征在于：其中二氯甲烷和二甲基酰胺混合比例任意，且每1g树脂加入0.25mL以上的二氯甲烷和二甲基酰胺混和液。
3.如权利要求1所述的步骤二，其特征在于：其中每100mL的甲苯加入150～260mg的富勒烯。
4.如权利要求1所述的步骤三，其特征在于：其中每次洗涤时，每1g树脂加入0.5mL以上的甲苯，每1g树脂加入0.5mL以上的二氯甲烷。
5.如权利要求1所述的步骤五，其特征在于：在加入甲基叔丁基醚之前也可以通入氩气，以使目标产物更快的从液体中析出。
6.如权利要求1所述的步骤六，其特征在于：其中每次洗涤时，每1g树脂加入1mL以上的甲基叔丁基醚。
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