CN108310464A - 天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法 - Google Patents

天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。该方法包括：将在动物身上截取的小肠进行清洗；将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，用剪刀破坏浆膜层，剪开小肠浆膜层，用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除，翻转小肠后刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除，得到单层管状小肠脱细胞基质膜。将规格相同的单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在支架上，进行加压粘合，得到多层管状小肠脱细胞基质膜，将得到的单层及多层管状小肠脱细胞基质膜进行冻干密封、灭菌保存，得到不同厚度的天然管状小肠脱细胞基质膜。本发明的制备方法简单，得到的小肠脱细胞基质膜为天然管状。

Description

天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法。
背景技术
小肠脱细胞基质膜(ECM)生物补片，是指取自同种或者异种的组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的三维框架结构并用于修复机体组织的材料。在利用ECM生物补片进行组织器官修复或者重建时，ECM能够起到“模具”的作用。ECM生物补片对宿主的ECM受体传递生物信息，通过整合素、层粘连蛋白受体等诱导并刺激相应的组织器官细胞在其表面附着，从边缘向中心移行，并诱导细胞沿着“模具”的形状分化和生长，最终实现组织器官的再生，与此同时，ECM被逐渐降解并完全吸收，在宿主体内无残留。
ECM生物补片的临床应用范围广泛，可以应用于腹壁疝、胸膜、颅骨、神经、内脑膜、消化道以及皮肤等的修复。但是，由于天然的细胞外基质材料制成的生物补片过于柔软，机械性能差，为手术操作带来很多不便，在多种组织的修复上，细胞外基质材料很难实现降解速度与组织再生速度相一致，往往因材料降解过快而导致移植失败。近年来，随着科技的快速发展，针对ECM生物补片制备中如何避免上述问题的产生提出很多的改进。通常是对材料进行化学交联处理，国外对管状ECM生物补片制备的研究较多，在制备管状ECM生物补片时，国外多采用片状ECM生物补片缝制成管状，或者是将片状ECM生物补片像缠绷带一样围绕柱状模具缠绕成管状。但是这种通过缝制或者缠绕而成的管状ECM生物补片，其缝合缘的可靠性、管内壁的光滑性以及管壁的均匀程度都会对组织的修复或者重建造成影响。我国对ECM生物补片的研究和应用起步较晚，制备工艺比较落后，特别是针对天然管状ECM生物补片的制备和应用研究尚处于空白。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种天然管状小肠脱细胞基质膜及其制备方法，该制备方法简单，得到的小肠脱细胞基质膜为天然管状，对人工管状器官的制取起到很好的奠基作用。
本发明首先提供一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，该方法包括：
步骤一：将在动物身上截取的小肠浸入生理盐水中进行清洗；
步骤二：将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，用剪刀破坏浆膜层，剪开小肠浆膜层，然后用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除，翻转小肠后刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除，得到单层管状小肠脱细胞基质膜；
步骤三：将步骤二得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将1-4个规格相同的单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在支架上，进行加压粘合，得到多层管状小肠脱细胞基质膜；
步骤四：将步骤三得到的多层管状小肠脱细胞基质膜进行冻干密封、灭菌保存，得到不同厚度的天然管状小肠脱细胞基质膜。
优选的是，所述的步骤一的动物为猪、牛、绵羊、鼠、马。
优选的是，所述的步骤一的清洗是在4℃生理盐水中清洗。
优选的是，所述的步骤三套叠过程具体为：将步骤二得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将规格相同的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端与支架上的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端固定，再将固定于支架上的管状小肠脱细胞基质膜另一端翻转，沿支架的一端向另一端牵拉，保持同等的张力，使2段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起，按照上述方法，依次将多段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起。
优选的是，所述的步骤三的加压粘合具体为：将套叠好的多段天然管状小肠脱细胞基质膜置于环形管状支架上，环形撑开管状小肠脱细胞基质膜达到其管壁不叠加亦不过度抻拉变形的状态时锁定支架管径，在套叠好的管状小肠脱细胞基质膜外侧用另一环形管状支架压迫，使各层管状小肠脱细胞基质膜粘合。
优选的是，所述的步骤四冻干温度为-80℃，冻干时间为24h。
优选的是，所述的步骤四的灭菌是将密封好的多层管状小肠脱细胞基质膜经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌。
本发明还提供上述制备方法得到的天然管状小肠脱细胞基质膜。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，和现有技术缝制成管状或者是缠绕成的管状方式相对比，本发明的方法可以直接制备得到天然管状的小肠脱细胞基质膜。该管状的小肠脱细胞基质膜由于是天然的，管状的，可作为细胞生长的支架。本发明的天然管状ECM可解决片状基质膜缝合过程中，对接处由于缝合压力过大，局部基质膜过厚，不利于细胞在基质膜内生长的问题。同时可解决对接处经缝合而成，易造成局部狭窄，或局部管径过大，作为人工食管移植动物体内时易造成动物进食时梗阻或局部食物残留的问题。本发明的天然管状ECM具有管状均匀性好的特点，很好的避免了片状ECM经缝合成管状带来的一些弊端。
本发明还提供上述制备方法得到天然管状小肠脱细胞基质膜，该天然管状小肠脱细胞基质膜，就局部组织来说同片状ECM其它性能相同，所不同的是天然管状无需缝合，基质膜横向，纵向，等各个方向的拉伸变形都与小肠相同，而缝合后的ECM由于对接缝合会造成局部基质膜在不同方向拉伸过程中变形受限。因此天然管状ECM，对于人类人工食管及其他人工管状器官的制取起到入门作用，为下一步人工食管的研究奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图。
图2为本发明实施例1制备得到的单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图。
图3为本发明实施例1制备得到的单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图。
图4为本发明实施例2制备得到的双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图。
图5为本发明实施例2制备得到的双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图。
图6为本发明实施例2制备得到的双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图。
图7为本发明实施例3制备得到的四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图。
图8为本发明实施例3制备得到的四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图。
图9为本发明实施例3制备得到的四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图。
图10为本发明实施例1制备得到的单层的天然管状猪小肠脱细胞基质膜放1000倍下电镜下扫描照片。
图11为本发明实施例1制备得到的单层的天然管状猪小肠脱细胞基质膜放5000倍下电镜下扫描照片。
具体实施方式
本发明首先提供一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，该方法包括：
步骤一：将在动物身上截取的小肠浸入生理盐水中进行清洗；
步骤二：将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，用剪刀破坏浆膜层，尽可能多的均匀的剪开小肠浆膜层，然后用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除；刮除干净后，翻转小肠后再刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除，得到单层管状小肠脱细胞基质膜。
步骤三：将步骤二得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将1-4个规格相同同法制备的单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在支架上，进行加压粘合，得到多层管状小肠脱细胞基质膜；
步骤四：将步骤三得到的多层管状小肠脱细胞基质膜进行冻干密封、灭菌保存，得到不同厚度的天然管状小肠脱细胞基质膜。
按照本发明，所述的将在动物身上截取的小肠浸入生理盐水中进行清洗，优选是将小肠取出后立即浸入4℃生理盐水中进行清洗，所述的动物没有特殊限制，优选为猪、牛、绵羊、鼠或马。
按照本发明，将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，所述的支架没有特殊限制，能起到将小肠支撑的作用即可，然后用剪刀剪开小肠浆膜层，尽可能多地均匀的剪开小口，然后用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除。所述的有机玻璃板的来源为商购，有机玻璃板的边缘切口要适中，不能太过锐利，否则对基质膜有损伤，不能过于圆盾，细胞刮除不全。在用有机玻璃板进行刮除时，用力不可过猛，用力过猛会损伤基质膜，再用同法刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除。当无组织脱落时，充分冲洗标本，再行刮除，并留取刮除物，及刮取的液体，将留取的刮除物及刮取的液体离心，取离心后的沉淀物涂片，染色，高倍镜下观察，如无细胞成分，即刮除完成，得到单层管状小肠脱细胞基质膜。
按照本发明，将上述得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将规格相同的同法制备得到的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端与支架上的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端固定，再将固定于支架上的管状小肠脱细胞基质膜另一端翻转，沿支架的一端向另一端牵拉，保持同等的张力，切勿其中某一层张力过大。用此方法将2段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起，固定2段天然管状脱细胞基质膜的2端。按照上述方法，依次可将多段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起，获取不同厚度的多层天然管状脱细胞基质膜。
按照本发明，将套叠好的多段天然管状小肠脱细胞基质膜置于环形管状支架上，环形撑开管状小肠脱细胞基质膜达到其管壁不叠加亦不过度抻拉变形的状态时锁定支架管径，在套叠好的管状小肠脱细胞基质膜外侧用另一环形管状支架压迫，使各层管状小肠脱细胞基质膜粘合。
按照本发明，将上述得到的多层管状小肠脱细胞基质膜进行冻干密封、灭菌保存，得到不同厚度的天然管状小肠脱细胞基质膜。所述的冻干温度优选为-80℃，冻干时间优选为24h；所述灭菌优选是将密封好的多层管状小肠脱细胞基质膜经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌。
本发明还提供上述制备方法得到的天然管状小肠脱细胞基质膜。
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，若未特别指明，本实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 单层天然管状ECM的制备
取地产白猪1头，体重在50-100Kg，持续乙醚吸入麻醉下，选取腹中线切口，严格备皮，消毒，铺无菌巾单，切割闭合器截取猪小肠，每段长为15厘米，取出后立即浸入4℃生理盐水中，并以生理盐水洗净小肠。将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，用剪刀破坏浆膜层，尽可能多的均匀的剪开小肠浆膜层，然后用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除。刮除完成后，翻转小肠，再用同法刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除。仔细刮除以上各层，以防止细胞残留，得到单层管状小肠脱细胞基质膜。对该管状小肠脱细胞基质膜进行消毒后真空干燥。
图1为本发明单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图；图2为本发明单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图；
图3为本发明单层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图；图1至图3说明，该天然管状ECM充气后，管壁四周均匀完整，无破损，证明该方法成功制备得到了天然管状小肠脱细胞基质膜。
图10为本发明实施例1制备得到的单层的天然管状猪小肠脱细胞基质膜放1000倍下电镜下扫描照片；图11为本发明实施例1制备得到的单层的天然管状猪小肠脱细胞基质膜放5000倍下电镜下扫描照片。图10和11说明，本发明所制取的管状ECM内细胞刮除非常干净彻底。
实施例2 双层天然管状ECM的制备
选取同一头小白猪的临近两段肠管，直径和长度相同，按照实施例1的方法制备得到两个单层管状小肠脱细胞基质膜。
将上述一个单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将规格相同(长度和直径相同)同法制备得到的另一个单层管状小肠脱细胞基质膜的一端与支架上的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端固定，再将固定于支架上的管状小肠脱细胞基质膜另一端翻转，沿支架的一端向另一端牵拉，保持同等的张力，切勿其中某一层张力过大，使2段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起，固定2段天然管状脱细胞基质膜(ECM)的2端。环形撑开管状小肠脱细胞基质膜达到其管壁不叠加亦不过度抻拉变形的状态时锁定支架管径，在套叠好的管状小肠脱细胞基质膜外侧用另一环形管状支架压迫，使两层管状小肠脱细胞基质膜粘合。将上述得到的两层管状小肠脱细胞基质膜进行置于真空密闭装置内-80℃环境中冻干。24小时后塑料包装密封，然后将密封好的多层管状小肠脱细胞基质膜经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌，得到双层天然管状小肠脱细胞基质膜。
图4为本发明双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图；图5为本发明双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图；
图6为本发明双层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图；图4至图6说明，该双层天然管状ECM充气后，管壁四周均匀完整，无破损，证明该方法成功制备得到了双层天然管状小肠脱细胞基质膜。
实施例3 四层天然管状ECM的制备
选取同一头小白猪的四段肠管，直径和长度相同，按照实施例1的方法制备得到四个单层管状小肠脱细胞基质膜。
将上述一个单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将规格相同(长度和直径相同)的同法制备得到的另一个单层管状小肠脱细胞基质膜的一端与支架上的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端固定，再将固定于支架上的管状小肠脱细胞基质膜另一端翻转，沿支架的一端向另一端牵拉，保持同等的张力，切勿其中某一层张力过大，使2段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起，固定2段天然管状脱细胞基质膜(ECM)的2端。按照上述方法将另外两个单层管状小肠脱细胞基质膜进行套叠，使四段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起。环形撑开管状小肠脱细胞基质膜达到其管壁不叠加亦不过度抻拉变形的状态时锁定支架管径，在套叠好的管状小肠脱细胞基质膜外侧用另一环形管状支架压迫，使四层管状小肠脱细胞基质膜粘合。
将上述得到的四层管状小肠脱细胞基质膜置于真空密闭装置内-80℃环境中冻干，24小时后塑料包装密封。将密封好的多层管状小肠脱细胞基质膜经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌，得到四层天然管状小肠脱细胞基质膜。
图7为本发明四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气前的照片图；图8为本发明四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜充气后的照片图；
图9为本发明四层天然管状猪小肠脱细胞基质膜真空干燥后的照片图；图7至图9说明，该四层天然管状ECM充气后，管壁四周均匀完整，证明该方法成功制备得到了四层天然管状小肠脱细胞基质膜。

Claims (8)

1.一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：将在动物身上截取的小肠浸入生理盐水中进行清洗；
步骤二：将清洗干净后的小肠套置在环形管状支架上，用剪刀破坏浆膜层，剪开小肠浆膜层，然后用有机玻璃板对破坏的小肠浆膜层进行刮除，翻转小肠后刮除小肠的粘膜层、粘膜下层和肌层，对小肠基细胞进行脱除，得到单层管状小肠脱细胞基质膜；
步骤三：将步骤二得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将1-4个规格相同的单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在支架上，进行加压粘合，得到多层管状小肠脱细胞基质膜；
步骤四：将步骤三得到的多层管状小肠脱细胞基质膜进行冻干密封、灭菌保存，得到不同厚度的天然管状小肠脱细胞基质膜。
2.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤一的动物为猪、牛、绵羊、鼠、马。
3.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤一的清洗是在4℃生理盐水中清洗。
4.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤三套叠过程具体为：将步骤二得到的单层管状小肠脱细胞基质膜固定于环形管状支架上，然后将规格相同的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端与支架上的单层管状小肠脱细胞基质膜的一端固定，再将固定于支架上的管状小肠脱细胞基质膜另一端翻转，沿支架的一端向另一端牵拉，保持同等的张力，使2段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起；按照上述方法，依次将多段单层管状小肠脱细胞基质膜套叠在一起。
5.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的加压粘合具体为：将套叠好的多段天然管状小肠脱细胞基质膜置于环形管状支架上，环形撑开管状小肠脱细胞基质膜达到其管壁不叠加亦不过度抻拉变形的状态时锁定支架管径，在套叠好的管状小肠脱细胞基质膜外侧用另一环形管状支架压迫，使各层管状小肠脱细胞基质膜粘合。
6.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤四冻干温度为-80℃，冻干时间为24h。
7.根据权利要求1所述的一种天然管状小肠脱细胞基质膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤四的灭菌是将密封好的多层管状小肠脱细胞基质膜经直线加速以8000拉德放射剂量照射灭菌。
8.权利要求1-7任何一项所述的制备方法得到的天然管状小肠脱细胞基质膜。
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