CN108299287A - 与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物 - Google Patents

与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，其结构如式(I)所示：本发明还提供式(I)化合物的制备方法及应用。在体外竞争结合实验中，该类化合物表现出对Aβ1‑42聚集体较高的亲和力；荧光染色实验表明该类化合物特异性地与转基因小鼠和AD病人脑切片上的Aβ斑块结合；体外放射自显影实验显示99mTc标记的该类分子可特异性地结合转基因小鼠脑切片上的Aβ斑块；正常小鼠体内生物分布实验表明，部分99mTc标记的探针分子具有较高的初始脑摄取和较快的脑清除，有望开发为用于AD早期诊断的新型单光子Aβ斑块分子探针。

Description

与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物
技术领域
本发明涉及放射性药物化学和临床核医学技术领域，具体地说，涉及一种与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物及其制备方法与应用。
背景技术
据统计，至2015年全球共有超过4600万痴呆患者，平均每3秒钟就会新增一例。中国也已经步入了老龄化社会。阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease，简称AD)是痴呆最主要的病因，临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等，严重影响人的社交、职业与生活能力。AD对于患者自身、患者家庭以及整个社会都带来沉重的负担，成为严重的社会问题，是21世纪人类健康面临的最大挑战之一，亟需研究开发有效的诊断和治疗方法。然而临床上现在对AD进行确诊仍然只能依靠在显微镜下对死者脑组织进行检查，根据最主要的病理特征——老年斑(Senile Plaques,SPs)和神经纤维缠结(Neurofibrillary Tangles,NFTs)的有无来判断。因此AD的诊断目前仍然是一项世界难题。
β淀粉样蛋白(Amyloid-βPeptide,Aβ)和tau蛋白分别是老年斑和神经纤维缠结的主要成分，相关的大量研究使人们对AD有了越来越深入的了解，虽然现今还没有能够治疗AD的药物可用，但可以针对脑内的这两种生物标志物设计小分子探针，从而通过影像学手段对AD进行诊断。
针对脑内Aβ斑块已经设计研究了很多分子探针，尤其是用于PET显像的分子探针已经取得了长足的发展，已经有三个显像剂([18F]GE-067、[18F]BAY94-9172和[18F]AV-45)先后通过美国FDA批准。相比之下，SPECT显像剂的发展明显滞后，只有[123I]IMPY和[123I]ABC577等少数探针进入人体实验阶段。
相对于PET显像，SPECT设备分布更加广泛(尤其是发展中国家)，使用成本相对较低。此外，SPECT能够使用99mTc这一核素，99mTc具有合适的半衰期，适中的射线能量，并且能够方便地由发生器淋洗得到。因此，开发用于SPECT显像的99mTc标记的Aβ分子探针具有重要的实用价值和广泛的应用前景。
目前报道的99mTc标记的Aβ分子探针由于亲和力、进脑量或其他体内性质的限制始终没有找到一个理想的能够实际应用的Aβ分子探针。
发明内容
本发明的目的是提供一种与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，其特征在于，其结构如式(I)所示：
其中，n为1或2，M为Re或99mTc。
当M为Re时，式(I)所示的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，其制备方法包括以下步骤(以n＝1为例，其他均采用类似方法制备)：
1)称取4.00g一缩二乙二醇于(100mL)圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF溶解，室温下搅拌，缓慢加入叔丁醇钾3.37g，室温搅拌30min后，缓慢加入6-氯烟醛，室温反应24h，加入去离子水，二氯甲烷萃取，有机相合并后经干燥剂无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，旋蒸浓缩，硅胶柱分离得化合物Ⅱ；
2)称取2.00g化合物Ⅱ和3.40g(4-硝基苄基)磷酸二乙酯于(250mL)圆底烧瓶中，加入无水甲醇溶解，搅拌，逐滴加入5M甲醇钠甲醇溶液5.00mL(溶剂为无水甲醇)，90℃加热回流2h，旋蒸除去大部分溶剂，搅拌下加入(大量)去离子水，析出(大量)黄色固体产物，用1M盐酸调pH至8-9，抽滤，烘干得化合物Ⅲ；
3)称取2.38g化合物Ⅲ于(250mL)圆底烧瓶中，加入适量无水甲醇溶解，搅拌，加入钯碳150.0mg，80％水合肼902.3mg，90℃加热回流2h，冷却，抽滤除去钯碳，收集滤液，旋蒸除去溶剂，得化合物Ⅳ；
4)称取1.02g化合物Ⅳ和1.02g多聚甲醛于(100mL)圆底烧瓶中，加入适量冰醋酸(冰醋酸浓度为99.5％)溶解，冰水浴中搅拌，缓慢加入氰基硼氢化钠1.07g，室温下反应过夜，TLC监测至反应完全，冰浴中搅拌下缓慢滴加氨水中和，抽滤，去离子水洗涤，干燥得化合物Ⅴ；
5)称取889.1mg化合物Ⅴ用二氯甲烷溶解，冰水浴中搅拌，加入三苯基膦1.42g，缓慢加入964.2mg N-溴代丁二酰亚胺(NBS)，冰水浴中反应1h，加入5mL饱和NaHSO4溶液搅拌30min，加入去离子水，加饱和NaHCO3中和，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离得化合物Ⅵ；
6)称取164.2mg化合物Ⅵ、267.5mg BAT-Boc、96.7mg碳酸钾和58.1mg碘化钾于(100mL)圆底烧瓶中，加入约40mL乙腈，90℃加热回流过夜；TLC监测反应结束后，趁热抽滤，所得滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得标记前体化合物Ⅶ；
7)称取86.1mg化合物Ⅶ于50mL圆底烧瓶中，置于冰水浴中，先加入2mL三氟乙酸，搅拌5min，再加入40μL三乙基硅烷，搅拌10min，减压除去三氟乙酸，加入66.6mg(PPh3)2ReOCl3、20mL CH2Cl2与MeOH的混合溶剂(CH2Cl2和MeOH的体积比为9:1)和无水乙酸钠100mg，90℃加热回流2h；TLC监测反应结束后，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，即得。
当M为99mTc时，式(I)所示的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，其制备方法包括以下步骤(以n＝1为例，其他均采用类似方法制备)：
1’)称取4.00g一缩二乙二醇于(100mL)圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF溶解，室温下搅拌，缓慢加入叔丁醇钾3.37g，室温搅拌30min后，缓慢加入6-氯烟醛，室温反应24h，加入去离子水，二氯甲烷萃取，有机相合并后经干燥剂无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，旋蒸浓缩，硅胶柱分离得化合物Ⅱ；
2’)称取2.00g化合物Ⅱ和3.40g(4-硝基苄基)磷酸二乙酯于(250mL)圆底烧瓶中，加入无水甲醇溶解，搅拌，逐滴加入5M甲醇钠的甲醇溶液5.00mL(溶剂为无水甲醇)，90℃加热回流2h，旋蒸除去大部分溶剂，搅拌下加入大量去离子水，析出大量黄色固体产物，用1M盐酸中和至弱碱性，抽滤，烘干得化合物Ⅲ；
3’)称取2.38g化合物Ⅲ于(250mL)圆底烧瓶中，加入适量无水甲醇溶解，搅拌，加入钯碳150.0mg，80％水合肼902.3mg，90℃加热回流2h，冷却，抽滤除去钯碳，收集滤液，旋蒸除去溶剂，得化合物Ⅳ；
4’)称取1.02g化合物Ⅳ和1.02g多聚甲醛于(100mL)圆底烧瓶中，加入适量冰醋酸(冰醋酸浓度为99.5％)溶解，冰水浴中搅拌，缓慢加入氰基硼氢化钠1.07g，室温下反应过夜，TLC监测至反应完全，冰浴中搅拌下缓慢滴加氨水中和，抽滤，去离子水洗涤，干燥得化合物Ⅴ；
5’)称取889.1mg化合物Ⅴ用二氯甲烷溶解，冰水浴中搅拌，加入三苯基膦1.42g，缓慢加入964.2mg N-溴代丁二酰亚胺(NBS)，冰水浴中反应1h，加入5mL饱和NaHSO4溶液搅拌30min，加入去离子水，加饱和NaHCO3中和，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离得化合物Ⅵ；
6’)称取164.2mg化合物Ⅵ、267.5mg BAT-Boc、96.7mg碳酸钾和58.1mg碘化钾于(100mL)圆底烧瓶中，加入约40mL乙腈，90℃加热回流过夜；TLC监测反应结束后，趁热抽滤，所得滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得标记前体化合物Ⅶ；
7’)取0.05mg化合物Ⅶ溶于100μL三氟乙酸中，室温静置5min；加入2μL三乙基硅烷，室温静置10min，氮气吹干；加入50μL无水乙醇溶解，加入新制备的5-100mCi 99mTc-GH溶液1mL，90℃加热10min后，即得。
其中，所述99mTc-GH溶液的制备如下：室温下，向8.0mg GH(葡庚糖酸盐)中加入新鲜的高锝酸钠注射液(5-100mCi，1mL)，摇匀，室温下放置10-15min，即得。
本发明中，所述化合物II～Ⅶ以及BAT-Boc的结构如下：
本发明还提供式(I)化合物在制备用于诊断与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病的显像剂中的应用。
所述与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病包括但不限于阿尔茨海默症。
本发明还提供式(I)化合物在制备用于AD早期临床诊断的单光子Aβ斑块显像剂中的应用。
本发明进一步提供一种用于诊断与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病的显像剂，其有效成分为式(I)所示化合物，其中，n为1或2，M为99mTc。
本发明提供一类新型的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，体外竞争结合实验和体外荧光染色实验表明，该类分子大多与Aβ1-42聚集体具有较高的亲和力，可特异性地与转基因小鼠和AD病人脑切片上的Aβ斑块结合；体外放射自显影实验表明，99mTc标记的该类分子可特异性地与转基因小鼠脑切片上的Aβ斑块结合；正常小鼠体内生物分布实验表明，部分99mTc标记的显像剂具有较高的初始脑摄取和较快的脑清除，有望成为一种新的用于AD早期临床诊断的单光子Aβ斑块显像剂。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中化合物13和14的AD转基因小鼠脑切片的荧光染色结果(A和C)及相邻切片用硫磺素-S染色的结果(B和D)。
图2为本发明较佳实施例中化合物13和14的AD人脑切片的荧光染色结果(A和B)。
图3为本发明较佳实施例中化合物[99mTc]13在AD转基因小鼠脑切片上的放射性自显影结果(A)及相同切片的硫磺素-S荧光染色结果(B)。
图4为本发明较佳实施例中化合物[99mTc]13在AD转基因小鼠(A和B)和正常对照小鼠(C)的体内放射性自显影结果及相同切片的硫磺素-S荧光染色结果(D-E)。图中比例尺表示1000μm。
图5为本发明较佳实施例中化合物[99mTc]13在6只正常恒河猴体内SPECT/CT成像结果。
图6为本发明较佳实施例中N2S2类吡啶基苯乙烯化合物的合成路线。
图7为本发明较佳实施例中N2S2类吡啶基苯乙烯化合物的99mTc标记路线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1合成中间体1
称取4.00g一缩二乙二醇(37.7mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF溶解，室温下搅拌，缓慢加入叔丁醇钾(3.37g,30.0mmol)，室温搅拌30min后，缓慢加入6-氯烟醛(30.0mmol)，室温反应24h，加入去离子水，二氯甲烷萃取，有机相合并后经无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，旋蒸浓缩，硅胶柱分离得产物，结构如下，产率：32％。
实施例2合成中间体2
由6-氯烟醛和二缩三乙二醇反应制得中间体2，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与中间体1的制备相同，结构如下，产率：33％。
实施例3合成中间体3
称取2.00g中间体1(9.48mmol)和3.40g(4-硝基苄基)磷酸二乙酯(12.32mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入无水甲醇溶解，搅拌，逐滴加入5M甲醇钠的甲醇溶液(溶剂为无水甲醇，5.00mL，25.0mmol)，90℃加热回流2h，旋蒸除去大部分溶剂，搅拌下加入大量去离子水，析出大量黄色固体产物，用1M盐酸中和至弱碱性，抽滤，烘干得产物，结构如下，产率：76％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,J＝2.4Hz,1H),8.22(d,J＝8.8Hz,2H),7.85(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.61(d,J＝8.8Hz,2H),7.19(d,J＝16.4Hz,1H),7.03(d,J＝16.4Hz,1H),6.84(d,J＝8.7Hz,1H),4.55(t,J＝4.6Hz,2H),3.88(t,J＝4.6Hz,2H),3.76(t,J＝4.5Hz,2H),3.67(t,J＝4.5Hz,2H).
实施例4合成中间体4
由中间体2和(4-硝基苄基)磷酸二乙酯反应制得中间体4，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与中间体3的制备相同，结构如下，产率：79％。
实施例5合成中间体5
称取2.38g中间体3(7.21mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入适量无水甲醇溶解，搅拌，加入钯碳150.0mg，水合肼(80％)902.3mg(14.42mmol)，90℃加热回流2h，冷却，抽滤除去钯碳，收集滤液，旋蒸除去溶剂，得产物，结构如下，产率：99％。
实施例6合成中间体6
由中间体4和水合肼反应制得中间体6，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与中间体5的制备相同，结构如下，产率：97％。
实施例7合成中间体7
称取1.02g中间体5(3.40mmol)和1.02g多聚甲醛(34.0mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入适量冰醋酸溶解，冰水浴中搅拌，缓慢加入氰基硼氢化钠(1.07g,17.0mmol)，室温下反应过夜，TLC监测至反应完全，冰浴中搅拌下缓慢滴加氨水中和，抽滤，去离子水洗涤，干燥得产物，结构如下，产率：81％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝2.3Hz,1H),7.77(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,2H),6.92(d,J＝16.3Hz,1H),6.82(d,J＝16.4Hz,1H),6.77(d,J＝8.6Hz,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,2H),4.50(t,J＝4.7Hz,2H),3.87(t,J＝4.7Hz,2H),3.76(t,J＝4.5Hz,2H),3.67(t,J＝4.5Hz,2H),2.98(s,6H).
实施例8合成中间体8
由中间体6和多聚甲醛反应制得中间体8，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与中间体7的制备相同，结构如下，产率：85％。
实施例9合成中间体9
称取889.1mg中间体7(2.71mmol)用二氯甲烷溶解，冰水浴中搅拌，加入三苯基膦1.42g(5.42mmol)，缓慢加入964.2mg N-溴代丁二酰亚胺(NBS,5.42mmol)，冰水浴中反应1h，加入5mL饱和NaHSO4溶液搅拌30min，加入去离子水，加饱和NaHCO3中和，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离得产物，结构如下，产率：40％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝2.4Hz,1H),7.76(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.38(t,J＝7.7Hz,2H),6.92(d,J＝16.3Hz,1H),6.82(d,J＝16.3Hz,1H),6.77(d,J＝8.6Hz,1H),6.71(d,J＝8.6Hz,2H),4.50(t,J＝4.8Hz,2H),3.89–3.85(m,4H),3.49(t,J＝6.4Hz,2H),2.98(s,6H).
实施例10合成中间体10
由中间体8和NBS反应制得中间体10，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与中间体9的制备相同，结构如下，产率：38％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝2.3Hz,1H),7.76(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),7.38(d,J＝8.8Hz,2H),6.92(d,J＝16.3Hz,1H),6.82(d,J＝16.3Hz,1H),6.76(d,J＝8.6Hz,1H),6.71(d,J＝9.0Hz,2H),4.49(t,J＝4.8Hz,2H),3.88–3.85(m,2H),3.83–3.80(m,2H),3.73–3.69(m,4H),3.48–3.44(m,2H),2.98(s,6H).
实施例11合成标记前体11
称取164.2mg中间体9(0.42mmol)、267.5mg BAT-Boc(0.35mmol)、96.7mg碳酸钾(0.70mmol)和58.1mg碘化钾(0.35mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入约40mL乙腈，90℃加热回流过夜。TLC监测反应结束后，趁热抽滤，所得滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得产物，结构如下，产率：49％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.05(d,J＝2.3Hz,1H),7.64(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),7.33–7.29(m,14H),7.20–7.15(m,12H),7.13–7.07(m,6H),6.83(d,J＝16.3Hz,1H),6.73(d,J＝16.3Hz,1H),6.67–6.62(m,3H),4.34(t,J＝4.7Hz,2H),3.63(t,J＝4.8Hz,2H),3.31(t,J＝6.1Hz,2H),2.90(s,6H),2.96–2.76(m,4H),2.43–2.36(m,2H),2.35–2.30(m,2H),2.28–2.14(m,6H),1.29(s,9H).MS(ESI):m/z calcd for C68H75N4O4S2[M+H]+:1075.5.Found:1075.5.
实施例12合成标记前体12
由中间体10和BAT-Boc反应制得标记前体12，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与标记前体11的制备相同，结构如下，产率：64％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝2.2Hz,1H),7.73(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.43–7.36(m,14H),7.29–7.22(m,12H),7.21–7.16(m,6H),6.91(d,J＝16.3Hz,1H),6.81(d,J＝16.3Hz,1H),6.74(d,J＝8.8Hz,1H),6.71(d,J＝8.8Hz,2H),4.48–4.43(m,2H),3.84–3.79(m,2H),3.66–3.62(m,2H),3.56–3.52(m,2H),3.37–3.30(m,2H),2.95(s,6H),3.05–2.81(m,4H),2.47–2.42(m,2H),2.42–2.35(m,2H),2.33–2.19(m,6H),1.36(s,9H).MS(ESI):m/z calcd for C70H79N4O5S2[M+H]+:1119.5.Found:1119.3.
实施例13合成铼配合物13
称取86.1mg标记前体11(0.08mmol)于50mL圆底烧瓶中，置于冰水浴中，先加入2mL三氟乙酸，搅拌5min，再加入40μL三乙基硅烷，搅拌10min，减压除去三氟乙酸，加入66.6mg(PPh3)2ReOCl3(0.08mmol)、20mL CH2Cl2：MeOH＝9:1(v:v)的混合溶剂和100mg无水乙酸钠，90℃加热回流2h。TLC监测反应结束后，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得产物，结构如下，产率：44％，熔点180.4-181.9℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝2.4Hz,1H),7.78(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,2H),6.93(d,J＝16.3Hz,1H),6.82(d,J＝16.3Hz,1H),6.72(d,J＝8.6Hz,3H),4.56–4.51(m,2H),4.30–4.22(m,1H),4.14–4.04(m,2H),3.96–3.90(m,3H),3.89–3.83(m,3H),3.80–3.76(m,1H),3.54–3.49(m,1H),3.46–3.39(m,1H),3.38–3.31(m,1H),3.20–3.16(m,2H),2.99(s,6H),3.04–2.95(m,1H),2.72–2.67(m,1H),1.78–1.70(m,1H).HRMS(ESI):m/z calcd for C25H36N4O3S2 185Re[M+H]+:689.1765.Found:689.1759.
实施例14合成铼配合物14
由标记前体和(PPh3)2ReOCl3反应制得铼配合物14，其反应的原料比例、溶剂、反应条件等均与铼配合物13的制备相同，结构如下，产率：40％，熔点151.3-152.6℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝2.3Hz,1H),7.77(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(d,J＝16.3Hz,1H),6.82(d,J＝16.3Hz,1H),6.73(d,J＝8.6Hz,3H),4.50–4.45(m,2H),4.29–4.21(m,1H),4.11–4.01(m,2H),3.91–3.84(m,6H),3.76–3.66(m,5H),3.58–3.51(m,1H),3.47–3.39(m,1H),3.36–3.29(m,1H),3.23–3.15(m,2H),2.99(s,6H),3.03–2.95(m,2H),2.74–2.68(m,1H).HRMS(ESI):m/z calcd for C27H40N4O4S2 185Re[M+H]+:733.2014.Found:733.2021.
上述N2S2类吡啶基苯乙烯化合物的合成路线如图6所示。
上述各实施例制备的化合物均可以通过现有技术中的常规方法标记放射性核素99mTc，标记反应通式如图7所示，
方法如下：取0.05mg标记前体溶于100μL三氟乙酸中，室温静置5min。加入2μL三乙基硅烷，室温静置10min，氮气吹干。加入50μL无水乙醇溶解，加入新鲜制备的5-100mCi99mTc-GH溶液1mL，90℃加热10min后即得99mTc标记配合物。
所述99mTc-GH溶液的制备如下：室温下，向8.0mg GH(葡庚糖酸盐)中加入新鲜的高锝酸钠注射液(5-100mCi，1mL)，摇匀，室温下放置10-15min，即得。
所得配合物进行HPLC检测。HPLC分析条件：Venusil MP C18柱(AgelaTechnologies,5μm,4.6×250mm)；CH3CN/H2O＝80％/20％；流速,1mL/min。
表1 99mTc标记配合物(实施例15-16)
实施例17N2S2类吡啶基苯乙烯化合物的效果实验
以下通过体外竞争结合实验、荧光染色实验和体外放射自显影实验对本发明所述化合物进行亲和力评价，充分验证它们与Aβ斑块的亲和力。通过正常小鼠体内分布实验对标记化合物进行初始脑摄取及脑清除评价。
1.竞争结合实验
竞争结合实验(Ki测定)：一定浓度的Aβ1-42聚集体与一定浓度的放射性配基[125I]IMPY发生结合反应，反应系统中同时加入不同浓度的待测铼配合物无与[125I]IMPY发生竞争反应，平衡后分离复合物通过测定放射性来计算抑制常数(Ki)。
1.1实验步骤：
(1)配制pH＝7.4的PBS(0.2M)缓冲液4L；
(2)放射配基[125I]IMPY按照已有方法制备；将[125I]IMPY配制成100000cpm/100μL的水溶液；
(3)将待测化合物配制成10-3至10-9mol/L连续稀释的乙醇溶液；
(4)受体Aβ1-42蛋白按照已有方法制备。将其稀释成约30nM的水溶液；
(5)玻璃纤维滤膜用含0.1％(体积分数)聚乙烯亚胺的PBS溶液浸泡0.5h；
(6)在12×75mm硼硅玻璃管中分别加入100μL不同浓度待测化合物溶液和100μL[125I]IMPY溶液、700μL PBS及100μL Aβ1-42溶液。用封口膜封好，涡旋；
(7)在37℃恒温水浴中振荡孵育2h；
(8)多头细胞收集器收集反应液，用PBS冲洗三遍，每次3mL；
(9)用γ计数仪测量计数；
(10)数据处理。
1.2实验结果：
由竞争结合实验得到的半抑制常数(IC50)以及进一步根据公式计算出的抑制常数Ki见表2。
表2本发明制备的化合物与Aβ1-42聚集体亲和力常数
通过上述的竞争结合实验可知，本发明所述的化合物均与Aβ1-42聚集体具有较好的的亲和力。
2.荧光染色实验：
2.1实验步骤：
2.1.1小鼠脑切片的荧光染色
(1)分别配制铼化合物(13和14)的40％的乙醇溶液，浓度为1μM；
(2)将12个月龄转基因小鼠脑切片(石蜡)和两片正常小鼠脑切片(石蜡)依次经过3×20min的二甲苯脱蜡，然后依次经过2×5min的100％的乙醇，2×5min的95％的乙醇，5min的80％的乙醇和5min的70％的乙醇洗涤，流水冲洗10min后，置于10mM的PBS(pH＝7.4)中；
(3)将小鼠脑切片分别浸于待测化合物溶液中10min；
(4)切片经过40％的乙醇洗涤后，采用荧光显微镜观察。
2.1.2AD患者脑切片的荧光染色
步骤及方法同上。
2.2实验结果：
实验结果如图1和图2所示，其中图1是铼配合物(13和14)的AD转基因小鼠脑切片的荧光染色结果(A和C)，很明显这些化合物都与Aβ斑块有结合，而且相邻脑切片均经过硫磺素-S染色进行对照(B和D)，均能得到良好的匹配。图2是铼配合物(13和14)的AD人脑切片的荧光染色结果(A和B)，也能很明显地观测到脑切片上的Aβ斑块。通过以上结果，充分说明本发明的化合物能与脑内Aβ斑块有效结合。
3.体外放射自显影实验：
将一定浓度的99mTc标记化合物与AD转基因小鼠脑切片中的斑块结合后，通过磷屏曝光，后用储磷屏系统分析图像。
3.1实验步骤：
(1)预处理AD转基因小鼠脑切片；
(2)在AD转基因小鼠脑切片上覆盖约50μCi的99mTc标记化合物(13)200μL，室温下孵育60分钟；
(3)用40％乙醇溶液冲洗5分钟，流水冲洗5分钟；
(4)晾干后，置于磷屏下曝光60分钟，用储磷屏系统成像。
3.2实验结果：
实验结果如图3所示，99mTc标记化合物能够特异性与脑中Aβ斑块结合，说明本发明的化合物被放射性核素标记后，可以作为Aβ斑块的显像剂。
4.正常小鼠体内分布实验
通过体内分布实验研究了99mTc标记化合物(13和14)在ICR小鼠体内的药代动力学性质。
4.1实验步骤
将5-10μCi标记化合物(100μL生理盐水溶液，含10％乙醇)由尾静脉注射入正常小鼠(ICR，雄性，20-22g)体内(n＝5)，分别于注射后2分钟、10分钟、30分钟和60分钟将其断头处死，解剖取出相关脏器，测量湿重及放射性计数。数据表示为脏器中放射性百分剂量(％ID/器官)和每克脏器中放射性百分剂量(％ID/g)。
4.2实验结果
实验结果如表3所示，本发明提供的[99mTc]13在2min的初始脑摄取较高，而且脑清除也较快，因此可能成为一种用于诊断AD的Aβ斑块显像剂。
表3 99mTc标记化合物的正常小鼠(n＝5)体内生物分布a
注：a表示％ID/g，平均值±标准偏差；b表示％ID/脏器
5.体内放射自显影实验：
将一定浓度的99mTc标记化合物注射到AD转基因小鼠和正常小鼠体内，之后将脑取出，冷冻切片，通过磷屏曝光，后用储磷屏系统分析图像。
5.1实验步骤：
将0.6mCi标记化合物[99mTc]13(200μL生理盐水溶液，含10％乙醇)由尾静脉注射入AD转基因小鼠(APPswe/PSEN1，雄性，24月龄)和正常对照小鼠(C57BL6，雄性，24月龄)体内，于注射后30分钟将其断头处死，解剖取出脑，用OTC包埋剂包埋后冷冻切片。晾干后，置于磷屏下曝光12小时，用储磷屏系统成像。
5.2实验结果：
实验结果如图4所示，[99mTc]13能够穿过小鼠血脑屏障并在活体内特异性与脑中Aβ斑块结合，充分说明本发明的化合物被放射性核素标记后，可以作为Aβ斑块的显像剂。
6.正常恒河猴体内SPECT/CT成像：
将99mTc标记化合物注射到正常恒河猴体内，然后进行SPECT/CT成像，考察化合物在灵长类动物体内的分布和脑摄取情况。
6.1实验步骤：
恒河猴(共6只)用速眠新Ⅱ(0.1mL/kg)肌内注射和氯胺酮(0.1ml/kg)肌内注射联合麻醉，将猴固定于SPECT/CT仪中，固定器旁放置放射药物标准品([99mTc]13，0.2％ID)。静脉注射[99mTc]13(约10mCi，共4mL，含10％乙醇)，于给药后立即进行SPECT/CT大脑成像(10分钟一次，共连续采集6次)，然后进行SPECT/CT全身成像。用CT图像在矢状位上选取ROI，转移到SPECT图像上进行半定量计算全脑摄取百分数(ID％)。
6.2实验结果：
实验结果如表4和图5所示，[99mTc]13能够有效穿过恒河猴血脑屏障并在其体内有适中的清除速率，说明本发明的化合物被放射性核素标记后，有潜力作为临床应用的Aβ斑块显像剂。
表4[99mTc]13在正常恒河猴脑内的摄取值(半定量结果，ID％)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.与Aβ斑块具有高亲和力的N2S2类吡啶基苯乙烯化合物，其特征在于，其结构如式(I)所示：
其中，n为1或2，M为Re或99mTc。
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，当M为Re、n为1时，所述化合物的制备方法包括以下步骤：
1)称取4.00g一缩二乙二醇于圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF溶解，室温下搅拌，缓慢加入叔丁醇钾3.37g，室温搅拌30min后，缓慢加入6-氯烟醛，室温反应24h，加入去离子水，二氯甲烷萃取，有机相合并后经干燥剂无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，旋蒸浓缩，硅胶柱分离得化合物Ⅱ；
2)称取2.00g化合物Ⅱ和3.40g(4-硝基苄基)磷酸二乙酯于圆底烧瓶中，加入无水甲醇溶解，搅拌，逐滴加入5M甲醇钠的甲醇溶液5.00mL，90℃加热回流2h，旋蒸除去大部分溶剂，搅拌下加入去离子水，析出黄色固体产物，用1M盐酸调pH至8-9，抽滤，烘干得化合物Ⅲ；
3)称取2.38g化合物Ⅲ于圆底烧瓶中，加入适量无水甲醇溶解，搅拌，加入钯碳150.0mg，80％水合肼902.3mg，90℃加热回流2h，冷却，抽滤除去钯碳，收集滤液，旋蒸除去溶剂，得化合物Ⅳ；
4)称取1.02g化合物Ⅳ和1.02g多聚甲醛于圆底烧瓶中，加入适量冰醋酸溶解，冰水浴中搅拌，缓慢加入氰基硼氢化钠1.07g，室温下反应过夜，TLC监测至反应完全，冰浴中搅拌下缓慢滴加氨水中和，抽滤，去离子水洗涤，干燥得化合物Ⅴ；
5)称取889.1mg化合物Ⅴ用二氯甲烷溶解，冰水浴中搅拌，加入三苯基膦1.42g，缓慢加入964.2mg N-溴代丁二酰亚胺，冰水浴中反应1h，加入5mL饱和NaHSO4溶液搅拌30min，加入去离子水，加饱和NaHCO3中和，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离得化合物Ⅵ；
6)称取164.2mg化合物Ⅵ、267.5mg BAT-Boc、96.7mg碳酸钾和58.1mg碘化钾于圆底烧瓶中，加入40mL乙腈，90℃加热回流过夜；TLC监测反应结束后，趁热抽滤，所得滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得标记前体化合物Ⅶ；
7)称取86.1mg化合物Ⅶ于50mL圆底烧瓶中，置于冰水浴中，先加入2mL三氟乙酸，搅拌5min，再加入40μL三乙基硅烷，搅拌10min，减压除去三氟乙酸，加入66.6mg(PPh3)2ReOCl3、20mL CH2Cl2与MeOH的混合溶剂和无水乙酸钠100mg，90℃加热回流2h；TLC监测反应结束后，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化，即得；其中，所述CH2Cl2与MeOH的混合溶剂中，CH2Cl2和MeOH的体积比为9:1；
其中，所述化合物II～Ⅶ以及BAT-Boc的结构如下：
3.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，当M为99mTc、n为1时，所述化合物的制备方法包括以下步骤：
1’)称取4.00g一缩二乙二醇于圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF溶解，室温下搅拌，缓慢加入叔丁醇钾3.37g，室温搅拌30min后，缓慢加入6-氯烟醛，室温反应24h，加入去离子水，二氯甲烷萃取，有机相合并后经干燥剂无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂，旋蒸浓缩，硅胶柱分离得化合物Ⅱ；
2’)称取2.00g化合物Ⅱ和3.40g(4-硝基苄基)磷酸二乙酯于圆底烧瓶中，加入无水甲醇溶解，搅拌，逐滴加入5M甲醇钠的甲醇溶液5.00mL，90℃加热回流2h，旋蒸除去大部分溶剂，搅拌下加入大量去离子水，析出大量黄色固体产物，用1M盐酸中和至弱碱性，抽滤，烘干得化合物Ⅲ；
3’)称取2.38g化合物Ⅲ于圆底烧瓶中，加入适量无水甲醇溶解，搅拌，加入钯碳150.0mg，80％水合肼902.3mg，90℃加热回流2h，冷却，抽滤除去钯碳，收集滤液，旋蒸除去溶剂，得化合物Ⅳ；
4’)称取1.02g化合物Ⅳ和1.02g多聚甲醛于圆底烧瓶中，加入适量冰醋酸溶解，冰水浴中搅拌，缓慢加入氰基硼氢化钠1.07g，室温下反应过夜，TLC监测至反应完全，冰浴中搅拌下缓慢滴加氨水中和，抽滤，去离子水洗涤，干燥得化合物Ⅴ；
5’)称取889.1mg化合物Ⅴ用二氯甲烷溶解，冰水浴中搅拌，加入三苯基膦1.42g，缓慢加入964.2mg N-溴代丁二酰亚胺，冰水浴中反应1h，加入5mL饱和NaHSO4溶液搅拌30min，加入去离子水，加饱和NaHCO3中和，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离得化合物Ⅵ；
6’)称取164.2mg化合物Ⅵ、267.5mg BAT-Boc、96.7mg碳酸钾和58.1mg碘化钾于圆底烧瓶中，加入40mL乙腈，90℃加热回流过夜；TLC监测反应结束后，趁热抽滤，所得滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得标记前体化合物Ⅶ；
7’)取0.05mg化合物Ⅶ溶于100μL三氟乙酸中，室温静置5min；加入2μL三乙基硅烷，室温静置10min，氮气吹干；加入50μL无水乙醇溶解，加入新制备的5-100mCi99mTc-GH溶液1mL，90℃加热10min后，即得；其中，所述99mTc-GH溶液的制备如下：室温下，向8.0mg葡庚糖酸盐中加入5-100mCi新鲜的高锝酸钠注射液1mL，摇匀，室温下放置10-15min，即得；
其中，所述化合物II～Ⅶ以及BAT-Boc的定义同权利要求2所述。
4.权利要求1所述化合物在制备用于诊断与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病的显像剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病包括阿尔茨海默症。
6.权利要求1所述化合物在制备用于AD早期临床诊断的单光子Aβ斑块显像剂中的应用。
7.一种用于诊断与β-淀粉样沉积相关中枢神经系统疾病的显像剂，其特征在于，其有效成分为式(I)所示化合物：
其中，n为1或2，M为99mTc。
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