CN108290894A - 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途 - Google Patents

被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108290894A
CN108290894A CN201680049556.7A CN201680049556A CN108290894A CN 108290894 A CN108290894 A CN 108290894A CN 201680049556 A CN201680049556 A CN 201680049556A CN 108290894 A CN108290894 A CN 108290894A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkyl
alkoxy
compound
disease
illness
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680049556.7A
Other languages
English (en)
Inventor
D·克赖因克
R·B·西尔弗曼
J·郑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern University
Original Assignee
Northwestern University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern University filed Critical Northwestern University
Publication of CN108290894A publication Critical patent/CN108290894A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5355—Non-condensed oxazines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/008—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy comprising drug dissolved or suspended in liquid propellant for inhalation via a pressurized metered dose inhaler [MDI]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/02—Suppositories; Bougies; Bases therefor; Ovules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/12—Aerosols; Foams
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2054—Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. hydroxypropyl methylcellulose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2059—Starch, including chemically or physically modified derivatives; Amylose; Amylopectin; Dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本申请所公开的是具有4‑甲基吡咯并[1,2‑a]嘧啶‑8‑甲酰胺核结构的新型小分子及其用于调节葡糖脑苷脂酶活性的用途。还公开的是包含所述小分子的药物组合物，在治疗与葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症的方法中可以施用该药物组合物，所述疾病或病症包括神经疾病和病症，例如戈谢病和帕金森病。所述小分子可以包含荧光团或可以与荧光团缀合以便制备荧光探针用于高通量筛选方法中以经由荧光偏振鉴定葡糖脑苷脂酶活性的新调节剂。

Description

被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-A]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及 其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途
相关专利申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求享有2015年7月1日提交的美国临时专利申请号62/187,463的优先权的利益，通过引用将该临时专利申请的内容完整地并入本申请。
背景
本发明的领域涉及新颖小分子和该新颖小分子用于调节葡糖脑苷脂酶活性的用途。所述的新颖小分子具有被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺核结构，例如2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺核结构，并且该小分子可以被施用以治疗与异常葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病和病症，包括神经变性疾病，例如戈谢病(Gaucher)和帕金森病。
葡糖脑苷脂酶(EC 3.2.1.45)，也称为β-葡糖脑苷脂酶、β-葡糖苷酶、D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶或GCase，是具有葡糖神经酰胺酶活性的酶。裂解作为糖脂代谢中的中间体的化学葡糖脑苷脂的β-糖苷键需要葡糖脑苷脂酶。葡糖脑苷脂酶定位于溶酶体中，且葡糖脑苷脂酶基因(GBA1)中的失能突变与溶酶体中脂质的异常蓄积有关。
由GBA1中的突变引起的遗传疾病包括神经变性疾病，例如戈谢病和帕金森病。戈谢病是由GBA1基因突变引起的罕见遗传病。目前，1型戈谢病的治疗是每两周一次施用的酶替代疗法(ERT)。ERT非常昂贵，并且对戈谢病的神经病变形式无效。GBA1中的突变还通过增加PD的风险与帕金森病(PD)有关联。为了活化GCase此前已尝试了所谓的“药理学蛋白伴侣策略”。然而，在药理学蛋白伴侣策略中使用的化合物无一成功地活化GCase，推断因为它们靶向GCase的活性位点。
在本申请中，我们公开了新的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物，其调节葡糖脑苷脂酶活性。本申请中所公开的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物具有比此前报道的无活性位点GCase抑制剂更好的化学和物理学特性。(参见Goldin等人，WO，“Substituted pyrazolopyrimidines as glucocerebrosidaseactivators.”2010年12月，WO2012078855；以及Patnaik等人，“Discovery，structure-activity relationship，and biological evaluation of noninhibitory smallmolecule chaperones of glucocerbrosidase,”J.Med.Chem.2012年6月28日；55(1`2)：5734-48，通过引用将它们的内容完整地并入本申请)。所公开的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物的这些更好的化学和物理学特性包括极性表面积、溶解度、可旋转键的数量增加和潜在氢键成员的数量增加。本研究中一些被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物能够高度活化GCase。例如，一些被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物共价结合GCase，并且活化野生型GCase至多15-30倍。观察到由此被所述新颖化合物活化的GCase在酸性环境中比未活化的GCase更稳定。此外，我们发现，所述被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物可以与荧光团缀合以生成吡咯并嘧啶荧光探针，它们在荧光偏振测定法中显示出强结合亲和力。这提示这些吡咯并嘧啶荧光探针可以用于高通量筛选方法中以鉴定另外的GCase活性调节剂。
概述
本申请公开了具有被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺核结构的新型小分子和该小分子用于调节葡糖脑苷脂酶活性的用途。所述的新颖小分子优选通过与葡糖脑苷脂酶结合(任选地共价结合)并活化葡糖脑苷脂酶来调节葡糖脑苷脂酶活性。所述的新颖小分子可被配制成药物组合物，其包含该小分子或包含与该小分子缀合的活化的葡糖脑苷脂酶，在治疗和/或预防与葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症的方法中可以施用所述的组合物，所述疾病或病症包括神经疾病和病症，例如戈谢病和帕金森病。所公开的小分子也可以包含荧光团或者可以与荧光团缀合以产生荧光探针。本申请中所考虑的荧光探针可表现出荧光偏振，并可用于高通量筛选方法中以鉴定葡糖脑苷脂酶的新颖调节剂。
附图简述
图1.GCase活化剂和探针的结构。
图2.GCase活化剂1、2和4与A)4MU-Glc底物和B)红色底物的剂量响应曲线。
图3.探针3的FP曲线和与化合物1和2的竞争性测定。
图4.对于A)4MU-β-glc底物；B)Res-β-glc底物和(C)天然底物，探针4以时间依赖性方式活化GCase。
图5.皂化蛋白C以剂量依赖性方式活化wt.GCase和预活化的GCase。
图6.活化的酶和wt.酶在pH 4.7缓冲液和人血浆中的酶活性。A)通过4MU-β-glc底物酶活性测定法测试的pH 4.7缓冲液中活化GCase与wt.GCase的酶活性；B)在pH 4.7缓冲液中的酶活性的归一化；C)通过4MU-β-glc底物酶活性测定法测试的人血浆中活化GCase与wt.GCase的酶活性；D)人血浆中酶活性的归一化。
图7.细胞摄取测定(U937巨噬细胞)。A)通过4MU-β-glc底物酶活性测定法测试的活化GCase与wt.GCase的酶活性；B)蛋白质印迹：内源性的、活化的和wt.GCase。
详细描述
可以利用下文所定义的术语进一步描述所公开的主题。
除非上下文另有明确说明或显示，否则术语“a”、“an”和“the”意味着“一种(个)或多种(个)”。例如，“葡糖脑苷脂酶活性的a调节剂”应解释为意指“葡糖脑苷脂酶活性的一种或多种调节剂”。
如本申请中所使用，“大约”，“近似”，“基本上”和“显著”将被本领域普通技术人员理解，并且将在一定程度上根据其被使用的上下文而变化。如果存在鉴于被使用的上下文本领域的普通技术人员不清楚的术语使用，则“大约”和“近似”将表示特定术语的±≤10％，“基本上”和“显著”将表示特定术语的±>10％。
如本申请中所使用，术语“包括(include)”和“包括(including)”具有与术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”相同的含义。术语“包括”和“包含”应被解释为“开放式”的过渡性术语，除权利要求中所记载的要素外，其允许还包含额外的要素。术语“由......组成”和“由...构成”应被解释为“封闭式”过渡性术语，其不允许包含除权利要求中所述要素之外的额外要素。术语“基本上由...组成”应被解释为部分封闭式的并且允许仅包含不会根本上改变所要求保护的主题的性质的额外要素。
在本申请中术语“受试者”、“患者”和“个体”可以互换使用。受试者可以是人。受试者可以指具有与异常葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症的人类受试者，或指处于获得上述疾病或病症风险中的人类受试者。如本申请中所使用，术语“异常”意指相对于正常健康受试者而言更高或更低的活性。在具体的实施方案中，显示异常葡糖脑苷脂酶的受试者患有神经疾病或病症或处于获得上述疾病或病症的风险中，该疾病或病症包括与异常葡糖脑苷脂酶活性相关的退行性神经疾病或病症，例如戈谢病和帕金森病。
如本申请中所使用，短语“有效量”应意指提供特定药理学应答的药物剂量，为了药理学应答在需要所述治疗的有意义数目的患者中施用所述药物。即使这类剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量，在特定情况下给予特定患者的药物的有效量在治疗本申请中所述的病症/疾病中并非总是有效。
本申请中所考虑的术语“烷基”包括所有异构体形式的直链或支链烷基。类似地，术语“烷氧基”是指经由氧原子连接的任何烷基(即，表示为“烷基-O-*”的基团)。如本申请中所使用，星号“*”用于表示任何基团或取代基的连接点。
如本申请中所使用，术语“调节”是指降低或抑制活性和/或增加或增强活性。例如，调节葡糖脑苷脂酶活性是指降低或抑制葡糖脑苷脂酶活性和/或增加或增强葡糖脑苷脂酶活性。可以施用本申请中所公开的化合物以调节葡糖脑苷脂酶活性，例如作为蛋白伴侣或活化剂。
本申请中所公开的化合物可以称作“4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物。”可以将所述的化合物或其盐描述为具有如下的式I：
其中：
R1是氢；C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；包含1个5元或6元环的饱和或不饱和碳环或杂环；包含2个稠合5元或6元环的饱和或不饱和碳环或杂环，或烷基噻吩(例如2-甲基噻吩)；且R1任选地在一个或多个位置上被如下基团取代：C1-C6烷基；C1-C6烷氧基；卤素基团；卤代烷基；苯基(任选地被卤素取代)；苄基(其任选地被卤素取代)；三唑基(任选地被羧基取代)；2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基；氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；烷基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基；或烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基)；咪唑基；吡啶基(例如2-基、3-基或4-基，其任选地被苯氧基取代)；吡咯烷基；哌嗪基；4-烷基哌嗪基；4-苄基哌嗪基；烷基-4-烷基哌嗪基；哌啶基；4-烷基哌啶基；4-N,N,二烷基氨基哌啶基；吗啉基；烷基吗啉基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；烷基-N,N,二烷基氨基；叠氮基；羟基；烷基羟基；炔基苯基；苯基甲酮基；氧基苯基；氧基羧基；或R1具有选自如下的式：
且R3具有选自如下的式：
且R4是H、C1-C8烷基、苯基或琥珀酰亚氨基(例如，N-琥珀酰亚氨基)；且
R2是C1-C6烷基或吡啶基(例如，2-基、3-基或4-基)。公开了其中R2特别是甲基的化合物，这些化合物可以称作2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物。公开了其中R2特别是3-基-吡啶的化合物，这些化合物可以称作2-(吡啶-3-基)-4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物。
在一些实施方案中，R1选自由如下基团组成的组：
其中星号(*)表示R1与8-甲酰亚胺氮原子的连接点。
在一些实施方案中，所公开的化合物具有式IA：
其中：
R5是氢、C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；C1-C6烷氧基；卤素基团；卤代烷基；苯基；苄基；三唑基(任选地被羧基、2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基、氨基、烷基-N,N-二烷基氨基、烷基-烷氧基-氨基、烷基-烷氧基-烷氧基-氨基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基或烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基取代)；咪唑基；吡咯烷基；哌嗪基；4-烷基哌嗪基；4-苄基哌嗪基；烷基-4-烷基哌嗪基；哌啶基；4-烷基哌啶基；4-N,N,二烷基氨基哌啶基；吗啉基；烷基吗啉基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；叠氮基；羟基；烷基羟基；炔基苯基；苯基甲酮基；氧基苯基；或氧基羧酸基团。
在一些实施方案中，所公开的化合物具有式IB：
其中：
R6是羧基；2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基；烷基氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；烷基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基；以及烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基。
所公开的化合物可以包含荧光团或可以与它们缀合。在所公开化合物的一些实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5和R6的任意取代基可以包含荧光团，包括适用于荧光偏振测定法中的荧光团。如本申请中所用，“荧光团”是可以被激发(例如，通过光或化学反应)以发射荧光的化学基团。一些适合的荧光团可以被光激发以发射磷光。如本申请中所使用，“染料”可以包括荧光团。本申请中所述的二硫代化合物可以包括荧光团，其选自，但不限于：1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟基色胺)；5-羟基色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；吖啶黄素；吖啶黄素Feulgen SITSA；Alexa Fluor 350TM；Alexa Fluor 430TM；AlexaFluor 488TM；Alexa Fluor 532TM；Alexa Fluor 546TM；Alexa Fluor 568TM；Alexa Fluor594TM；Alexa Fluor 633TM；Alexa Fluor 647TM；Alexa Fluor 660TM；Alexa Fluor 680TM；茜草素络合酮；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC；AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝(Anilin Blue)；Anthrocyl硬脂酸酯；APC(别藻蓝蛋白)；APC-Cy7；APTS；Astrazon亮红4G；Astrazon橙R；Astrazon红6B；Astrazon黄7GLL；米帕林；ATTO-TAGTM CBQCA；ATTO-TAGTM FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基二唑)；硫酸黄连素；β-内酰胺酶；BFP青移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；Bimane；双苯甲酰胺；双苯甲酰胺(Hoechst)；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBOTM-1；BOBOTM-3；氟化硼二吡咯(Bodipy)492/515；氟化硼二吡咯493/503；氟化硼二吡咯500/510；氟化硼二吡咯505/515；氟化硼二吡咯530/550；氟化硼二吡咯542/563；氟化硼二吡咯558/568；氟化硼二吡咯564/570；氟化硼二吡咯576/589；氟化硼二吡咯581/591；氟化硼二吡咯630/650-X；氟化硼二吡咯650/665-X；氟化硼二吡咯665/676；氟化硼二吡咯FL；氟化硼二吡咯FL ATP；氟化硼二吡咯Fl-神经酰胺；氟化硼二吡咯R6G SE；氟化硼二吡咯TMR；氟化硼二吡咯TMR-X缀合物；氟化硼二吡咯TMR-X，SE；氟化硼二吡咯TR；氟化硼二吡咯TR ATP；氟化硼二吡咯TR-X SE；BO-PROTM-1；BO-PROTM-3；亮磺基黄素FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙CrimsonTM；钙绿；钙橙；Calcofluor白；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；Cascade蓝TM；Cascade黄；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP-蓝绿色荧光蛋白质；CFP/YFP FRET；叶绿素；色霉素A；CL-NERF(Ratio Dye，pH)；CMFDA；Coelenterazine(肠腔素)f；肠腔素fcp；肠腔素h；肠腔素hcp；肠腔素ip；肠腔素n；肠腔素O；香豆素鬼笔环肽；C-藻青素(phycocyanine)；CPM甲基香豆素；CTC；CTC甲月替；Cy2TM；Cy3.18；Cy3.5TM；Cy3TM；Cy5.1 8；Cy5.5TM；Cy5TM；Cy7TM；Cyan GFP；环AMP荧光传感剂(FiCRhR)；琥珀酰亚胺酯(Dabcyl)；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰尸胺；丹磺酰氯；丹磺酰DHPE；丹磺酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3；DCFDA；DCFH(双乙酸二氯二氢荧光素酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(非-比例)；DiA(4-二-16-ASP)；双乙酸二氯二氢荧光素酯(DCFH)；DiD–亲脂性示踪物；DiD(DiIC18(5))；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiI(DiIC18(3))；二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；DNP；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；曙红；赤藓红色素；赤藓红色素ITC；溴化乙锭；乙啡啶同质二聚体-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化铕(III)；EYFP；固蓝(Fast Blue)；FDA；Feulgen(副玫瑰苯胺)；FITC；Flazo橙；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；双乙酸荧光素酯；Fluoro-Emerald；Fluoro-Gold(羟巴脒)；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43TM；FM 4-46；Fura RedTM；Fura RedTM/Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮红B；Genacryl亮黄10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer(CCF2)；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型无UV激发(wtGFP)；GFP野生型UV激发(wtGFP)；GFPuv；Gloxalic酸；颗粒蓝；血卟啉；烟酸己可碱(Hoechst)33258；烟酸己可碱33342；烟酸己可碱34580；HPTS；羟基香豆素；羟巴脒(FluoroGold)；羟基色胺；Indo-1；Indodicarbocyanine(DiD)；Indotricarbocyanine(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；雷可福(Leucophor)PAF；雷可福SF；雷可福WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/乙啡啶同质二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光黄；Lyso Tracker蓝；LysoTracker蓝-白；Lyso Tracker绿；Lyso Tracker红；Lyso Tracker黄；LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；马格达拉红(Phloxin B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；镁绿(Magnesium Green)；镁橙；孔雀绿；Marina蓝；Maxilon亮黄素10GFF；Maxilon亮黄素8GFF；Merocyanin；甲氧基香豆素；Mitotracker绿FM；Mitotracker橙；Mitotracker红；普卡霉素；溴甲烷；溴甲烷(mBBr-GSH)；Monochlorobimane；MPS(甲基绿派罗宁均二苯代乙烯)；NBD；NBD胺；尼罗红；Nitrobenzoxadidole；去甲肾上腺素；核坚牢红；核黄；Nylosan亮Iavin E8G；Oregon绿；Oregon绿488-X；Oregon GreenTM；Oregon GreenTM488；Oregon GreenTM500；OregonGreenTM514；太平洋蓝(Pacific Blue)；副玫瑰苯胺(Feulgen)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德克萨斯红[Red 613]；根皮红B(马格达拉红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；膦3R；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；樱草灵；普施安黄；碘化丙啶(PI)；PyMPO；芘；派罗宁；焦宁B；Pyrozal亮黄素7GF；QSY 7；奎纳克林氮芥；Red 613[PE-德克萨斯红]；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；碱性玫瑰精；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻青素；R-藻红蛋白(PE)；RsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；氧化铝GFP；SBFI；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红4G；Sevron亮红B；Sevron橙；Sevron黄L；sgBFPTM；sgBFPTM(超辉光BFP)；sgGFPTM；sgGFPTM(超辉光GFP)；SITS；SITS(樱草灵)；SITS(均二苯代乙烯异硫代磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿(Sodium Green)；SpectrumAqua；SpectrumGreen；SpectrumOrange；Spectrum Red；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉)；均二苯代乙烯；Sulphorhodamine B can C；Sulphorhodamine G Extra；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO84；SYTO 85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；Texas RedTM；德克萨斯红-XTM缀合物；硫杂二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑桔；硫磺素5；硫磺素S；硫磺素TCN；Thiolyte；Thiozole橙；Tinopol CBS(Calcofluor白)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸酯；真蓝；TruRed；Ultralite；荧光素B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；以及YOYO-3。如本申请中所使用，“荧光团”可以包括荧光团的盐。
在一些实施方案中，所公开的化合物具有式ID：
其中：
X是N或S；且
R4、R5、R6和R7各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和卤素。
所公开的化合物可以包括经由连接基缀合的两个被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺基团。包括两个在甲酰胺基团之间经由连接基缀合的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺基团的化合物可以举例说明如下：
在一些实施方案中，可以将所公开的具有两个经由连接基缀合的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺基团的化合物描述为具有如下的式II：
在一些实施方案中，可以将所公开的具有两个经由连接基缀合的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺基团的化合物描述为具有如下的式III：
在一些实施方案中，可以将所公开的具有两个经由连接基缀合的被取代的4-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺基团的化合物描述为具有如下的式IV：
本申请中所公开的化合物优选调节葡糖脑苷脂酶的活性。调节可以抑制或降低葡糖脑苷脂酶活性。调节还可以包括活化或增加葡糖脑苷脂酶活性。可以采用本领域中已知的方法和本申请中所公开的方法(包括本申请所提供的实施例中所公开的方法)评价葡糖脑苷脂酶活性。在一些实施方案中，所述的化合物相对于对照降低或增加葡糖脑苷脂酶活性(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)。在其它实施方案中，可以测定所述化合物在葡糖脑苷脂酶活性抑制或活化方面的AC50值或IC50值，并且优选所述化合物具有低于约10μM、5μM或1μM、0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.01μM、0.005μM或0.001μM的AC50值或IC50值。
本申请中所公开的化合物(例如，式I的化合物)可以具有几个手性中心，涉及立体异构体、差向异构体和对映异构体。对于一个或多个手性中心，化合物可以是光学纯的(例如，手性中心的一些或全部可以完全处于S构型；手性中心的一些或全部可以完全处于R构型等)。另外或可替代地，手性中心中的一个或多个可以作为构型的混合物(例如，R构型和S构型的外消旋或另一种混合物)存在。包含基本上纯化的立体异构体、差向异构体或对映异构体或它们的类似物或衍生物的组合物是本申请中所预期的(例如，包含至少约90％、95％或99％纯的立体异构体、差向异构体或对映异构体的组合物)。如本申请中所使用，未明确显示在一个或多个手性中心的取向的结构式意指涵盖所有的取向和它们的混合物。
本申请中所公开的组合物和方法中使用的化合物可以以药物组合物的形式施用，因此，掺入所述化合物的药物组合物被认为是本申请中所公开的组合物的实施方案。这样的组合物可以采取药学上可接受的任何物理形式；举例来说，它们可以是口服施用的药物组合物。这样的药物组合物含有有效量的所公开的化合物，该有效量与被施用的化合物的日剂量有关。每个剂量单位可以包含给定化合物的日剂量，或者每个剂量单位可以包含日剂量的一部分，例如剂量的一半或三分之一。每个剂量单位中包含的每种化合物的量可部分取决于为疗法而选择的具体化合物的属性和其它因素，例如给予它的适应证。通过采用众所周知的方法可以配制本申请中所公开的药物组合物以便在施用于患者之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
根据本申请中所公开的方法使用的化合物可以以单一化合物或化合物的组合的形式施用。例如，调节葡糖脑苷脂酶活性的化合物可以以单一化合物的形式施用，或以与调节葡糖脑苷脂酶活性或具有不同药理学活性的另一个化合物组合的形式施用。
如上所述，化合物的药学上可接受的盐是所预期的，并且也可用于所公开的方法中。本申请中使用的术语“药学上可接受的盐”是指对活的生物体基本上无毒的化合物的盐。典型的药学上可接受的盐包括通过使本申请中所公开的化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸或有机碱或无机碱反应而制备的那些盐。这样的盐称为酸加成盐和碱加成盐。本领域技术人员理解，本申请中所公开的化合物中的大部分或全部能够形成盐，并且通常使用药物的盐形式，通常因为它们比游离酸或碱更容易结晶和纯化。
通常用于形成酸加成盐的酸可以包括无机酸如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸等，以及有机酸如对甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，对溴苯磺酸，碳酸，琥珀酸，柠檬酸，苯甲酸，乙酸等。适合的药学上可接受的盐的实例可以包括硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，溴化物，碘化物，乙酸盐，丙酸盐，癸酸盐，辛酸盐，丙烯酸盐，甲酸盐，盐酸盐，二盐酸盐，异丁酸盐，己酸盐，庚酸盐，丙炔酸盐，草酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，辛二酸盐，癸二酸盐，富马酸盐，马来酸盐，丁炔-1,4-二酸盐，己炔-1,6-二酸盐，苯甲酸盐，氯苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，羟基苯甲酸盐，甲氧基苯甲酸盐，邻苯二甲酸盐，二甲苯磺酸盐，苯乙酸盐，苯基丙酸盐，苯基丁酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，α-羟基丁酸盐，乙醇酸盐，酒石酸盐，甲磺酸盐，丙磺酸盐，萘-1-磺酸盐，萘-2-磺酸盐，扁桃酸盐等。
碱加成盐包括衍生自无机碱的盐，例如铵氢氧化物或碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等。用于制备这类盐的碱包括氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，碳酸钾，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸氢钾，氢氧化钙，碳酸钙等。
形成本申请中所公开的化合物的任何盐的一部分的特定抗衡离子对于化合物的活性可能不是关键的，只要盐作为整体在药理学上是可接受的，并且只要抗衡离子不为整个盐贡献不期望的品质。不期望的品质可以包括不期望的溶解度或毒性。
化合物的药学上可接受的酯和酰胺也可以用于本申请中所公开的组合物和方法中。适合的酯的实例包括烷基酯、芳基酯和芳烷基酯，如甲酯、乙酯、丙酯、十二烷基酯、苄酯等。适合的酰胺的实例包括未取代的酰胺、单取代的酰胺和二取代的酰胺，如甲酰胺、二甲基酰胺、甲基乙酰胺等。
另外，本申请中所公开的方法可以使用所述化合物的溶剂合物形式或其盐、酯和/或酰胺来实施。溶剂合物形式可以包括乙醇溶剂合物、水合物等。
药物组合物可以用于治疗与葡糖脑苷脂酶活性有关的疾病或病症的方法中。例如，所述药物组合物可用于治疗患有神经疾病或病症或处于患神经疾病或病症风险中的患者，所述神经疾病或病症包括退行性神经系统疾病或疾病，例如戈谢病和帕金森病。适合的患者包括例如哺乳动物，例如人和非人灵长类动物(例如，黑猩猩)或其它哺乳动物(例如，狗、猫、马、大鼠和小鼠)。适合的人类患者可以包括例如那些先前已被确定患有或发生神经疾病或病症的风险的人，所述神经疾病或病症包括退行性神经系统疾病或疾病，如戈谢病和帕金森病。
如本申请中所使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”各自意指缓解症状，临时或永久性地消除所产生的症状的原因，和/或防止或减缓或逆转所述疾病或病症的所得症状的进展或严重程度。据此，本申请中所公开的方法涵盖治疗性和预防性施用。
如本申请中所使用，术语“有效量”是指在向受试者单次或多次剂量施用时化合物的量或剂量，其在进行诊断或治疗的受试者中提供期望的效果。所公开的方法可以包括施用有效量的所公开的化合物(例如，存在于药物组合物中)用于治疗与超氧化物歧化酶突变相关的疾病或病症，包括施用有效量的抑制超氧化物歧化酶突变形式的表达的化合物。
作为本领域技术人员的主治诊断医师通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果，可以轻易地确定有效量。在确定所施用的化合物的有效量或剂量中，主治诊断医生可以考虑许多因素，例如：受试者的物种；其尺寸、年龄和一般健康状况；涉及程度或所涉及的疾病或病症的严重程度；个体受试者的响应；所施用的具体化合物；施用模式；所施用制剂的生物利用度特征；所选择的剂量方案；伴随药物的应用；以及其它有关情况。
典型的日剂量可以含有约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.05mg/kg至约50mg/kg和/或约0.1mg/kg至约25mg/kg)的本发明治疗方法中使用的每种化合物。
可以将组合物配制成单位剂型，每个剂量单独或在单个单位剂型中含有约1至约500mg的每种化合物，例如约5至约300mg、约10至约100mg和/或约25mg。术语“单位剂型”是指适合作为患者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质，以及适合的药用载体、稀释剂或赋形剂。
口服施用是施用本申请中所公开的组合物和方法中使用的化合物的示例性途径。其它示例性的施用途径包括透皮，经皮，静脉内，肌内，鼻内，颊粘膜，鞘内，大脑内或直肠内途径。施用途径可以以任何方式变化，受所使用的化合物的物理性质和受试者和护理人员的便利性的限制。
如本领域技术人员将认识到的，适合的制剂包括适用于多于一种施用途径的制剂。例如，所述的制剂可以是适用于鞘内和脑内施用的制剂。或者，适合的制剂包括仅适用于一种施用途径的制剂以及适用于一种或多种施用途径但不适合于一种或多种其它施用途径的制剂。例如，所述制剂可以是适用于口服，经皮，透皮，静脉内，肌肉内，鼻内，颊粘膜和/或鞘内施用但不适合脑内施用的制剂。
药物组合物的惰性成分和配制方式是常规的。本申请中可以使用制药科学中使用的常用制剂方法。可以使用所有常用类型的组合物，包括片剂，咀嚼片，胶囊，溶液，肠胃外溶液，鼻内喷雾剂或粉末，锭剂，栓剂，透皮贴剂和混悬剂。通常，组合物总计包含约0.5％至约50％的化合物，视期望的剂量和待使用的组合物的类型而定。然而，将化合物的量最好定义为“有效量”，即为需要这类治疗的患者提供期望剂量的化合物的量。不认为用于本申请中所公开的组合物和方法中的化合物的活性在很大程度上取决于组合物的性质，因此可以主要或仅为了方便和经济而选择和配制组合物。
通过将化合物与适合的稀释剂混合并将适量的混合物填充到胶囊中来制备胶囊剂。通常的稀释剂包括惰性粉状物质(如淀粉)，粉状纤维素(特别是结晶和微晶纤维素)，糖(如果糖，甘露糖醇和蔗糖)，谷物粉和类似的可食用粉末。
可以通过直接压制、湿法制粒或干法制粒制备片剂。其制剂通常掺入稀释剂、粘合剂、润滑剂和崩解剂(除化合物外)。典型的稀释剂包括，例如不同类型的淀粉、乳糖、甘露糖醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐(例如，氯化钠)和糖粉。还可以使用粉状纤维素。典型的片剂粘合剂包括这样的物质，例如淀粉、明胶和糖(例如，乳糖、果糖、葡萄糖等)。还可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯胶、藻酸盐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。聚乙二醇、乙基纤维素和拉也可以充当粘合剂。
片剂可以用糖(例如，作为增味剂和密封剂)包衣。通过在制剂中使用大量品尝令人愉快的物质，例如甘露糖醇，也可以将化合物配制成咀嚼片。例如，也可以使用速溶片剂样制剂，以确保患者消费剂型并避免一些患者吞咽固体物体的困难。
可以在片剂中使用润滑剂以防止片剂和冲头粘附在模具中。润滑剂可以选自光滑的固体，例如滑石粉，硬脂酸镁和硬脂酸钙，硬脂酸和氢化植物油。
片剂还可以包含崩解剂。崩解剂是在润湿时溶胀以分散片剂并释放化合物的物质。它们包括淀粉，粘土，纤维素，藻胶和树胶。作为进一步的示例，可以使用玉米淀粉和马铃薯淀粉，甲基纤维素，琼脂，膨润土，木质纤维素，粉状天然海绵，阳离子交换树脂，海藻酸，瓜尔豆胶，柑橘果肉，月桂基硫酸钠和羧甲基纤维素。
可以将组合物配制成肠溶制剂，例如以保护活性成分不受胃中强酸含量的影响。这种制剂可以通过用不溶于酸性环境且可溶于碱性环境的聚合物薄膜包衣固体剂型来制备。示例性的膜包括醋酸邻苯二甲酸纤维素，邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素。
当期望将化合物作为栓剂施用时，可以使用常规的基质。示例性地，可可脂是传统的栓剂基质。可可脂可以通过添加蜡来改性以略微升高其熔点。可与水混溶的栓剂基质如各种分子量的聚乙二醇也可用于栓剂中。
透皮贴剂也可用于递送化合物。透皮贴剂可以包括其中化合物将溶解或部分溶解的树脂组合物；以及保护组合物并使树脂组合物与皮肤接触的膜。也可以使用其它更复杂的贴剂组合物，例如具有穿透多个孔的膜的药物，通过这些孔通过渗透作用泵送药物。
本领域技术人员也将理解，制剂可以用具有使制剂适合的性质(例如，纯度)的材料(例如，活性剂赋形剂，载体(例如，环糊精)，稀释剂等)制备用于对人施用。或者，所述制剂可以用具有使所述制剂适合施用于非人类受试者但不适合施用于人的纯度和/或其它性质的材料来制备。
本申请中所公开的化合物可以起葡糖脑苷脂酶的活化剂的作用。例如，本申请中所公开的化合物可以与葡糖脑苷脂酶反应以制备与化合物共价连接的活化葡糖脑苷脂酶。如此形成的活化的葡糖脑苷脂酶可以制备成药物组合物，在本领域中已知的酶替代疗法中治疗和/或预防与葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症。
下面的制剂清单是举例说明性的。这些示例性的制剂可适用于制备包含所公开的化合物作为“活性成分”的药物组合物。下面的制剂清单是举例说明性的，不应被解释为以任何方式限制本申请公开的内容或权利要求：
制剂1
使用下列成分制备硬明胶胶囊：
混合上述成分并，且以460毫克的量将其填充入硬明胶胶囊。
制剂2
掺合所述成分并且将其压制成各自重量为665毫克的片剂。
制剂3
制备包含如下成分的气雾剂溶液：
将活性化合物与乙醇混合，并且将该混合物加到部分喷射剂22中，冷却至-30℃，并且转移至填充装置。然后将所需的量进料至不锈钢容器中并且用其余的喷射剂稀释。然后将阀门单元与容器接合。
制剂4
如下制备各自包含60mg活性成分的片剂：
使活性成分、淀粉和纤维素通过美国45号目筛并且充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与得到的粉末混合，然后使其通过美国14号目筛。将由此产生的颗粒在50℃干燥并且通过美国18号目筛。然后将此前通过美国60号目筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石粉加到颗粒中，混合后，用压片机将它们压制以生成各自重量为150mg的片剂。
制剂5
如下制备各自包含80mg药剂的胶囊：
掺合活性成分、纤维素、淀粉和硬脂酸镁，使其通过45号筛，并且以200mg的量填入硬明胶胶囊。
制剂6
可以如下制备各自包含225mg活性成分的栓剂：
活性成分 225mg
饱和脂肪酸甘油酯 2,000mg
总计 2,225mg
使活性成分通过美国60号目筛并且混悬于此前已使用必须最小加热熔化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将该混合物倾入标称2g容量的栓剂塑模并且使其冷却。
制剂7
如下制备各自每5毫升剂量包含50毫克药剂的混悬液：
使药剂通过美国45号目筛并且与羧甲基纤维素钠和糖浆混合以形成调匀的糊剂。用一些水稀释苯甲酸溶液、矫味剂和着色剂并且在搅拌下添加它们。然后加入足量的水以产生所需体积。
制剂8
可以如下制备每5毫升剂量包含100毫克药剂的静脉内制剂：
实施例
下列实施例仅仅是举例说明性的，并且不想将它们用于限制所请求保护的主题的范围。
作为葡糖脑苷脂酶调节剂的吡咯并嘧啶类化合物及其应用
使用如下方案I制备了化合物：
方案I
实施例1-N-(4-乙炔基苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(1)的制 备
a.2-氨基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯的制备。在氮气气氛中，在剧烈搅拌下在22℃向乙酯基乙脒(390mg，3.0mmol)在干乙酸乙酯(20mL)中的溶液中快速加入无水氯乙醛。将该反应体系搅拌10分钟，回流加热20分钟。将该混合物冷却至室温，通过硅胶(15g)过滤。用乙酸乙酯(20mL x 5)萃取反应烧瓶中的残余物，过滤。采集滤液，减压蒸发，得到120mg(47％)，为淡黄色固体。
1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：7.92(br，1H)，6.28(t，J＝2.8Hz，1H)，6.15(dd，J＝2.0Hz，1H)，4.94(br，2H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，1.33(t，J＝7.1Hz，3H)。13C NMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：166.5，145.4，110.3，107.5，94.5，59.3，14.7。
b.2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酸乙酯的制备。在氮气气氛中，在110℃在密封试管中将戊-2,4-二酮(14.3mL，139mmol)和2-氨基-1H-吡唑-3-甲酸乙酯(19.5g，127mmol)与乙酸(200mL)一起加热过夜。减压蒸发乙酸，得到粗制产物，通过急骤色谱法纯化，得到10.0g(36％)淡黄色粉末。
1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：7.39(d，J＝3.4Hz，1H)，7.01(d，J＝3.4Hz，1H)，6.53(s，1H)，4.40(q，J＝7.1Hz，1H)，2.62(s，1H)，2.56(s，1H)，1.41(t，J＝7.1Hz，1H)。13CNMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：164.3，157.6，142.3，141.8，118.0，109.0，106.6，102.3，59.9，29.8，25.2，18.3，14.7。ESI-MS m/z：241(M+Na+)，219(M+H+)。
c.2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酸的制备。将2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酸乙酯(10.0g，45.9mmol)混悬于EtOH(200mL)，用3.4M氢氧化钠(80mL，275mmol)处理。将该混合物加热至90℃，然后搅拌1小时。将该混合物冷却至室温，用乙酸(15.7mL，275mmol)中和至pH 6-7。过滤浆液，用水洗涤固体残余物，真空干燥，得到黄色粉末(7.0g，80％)。
1H NMR：(500MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：11.67(s，1H)，7.40(d，J＝3.3Hz，1H)，7.26(d，J＝3.3Hz，1H)，6.85(s，1H)，2.61(s，3H)，2.51(s，3H)。13C NMR：(125MHz，d6-DMSO)δ(ppm)：164.1，156.8，143.6，141.3，117.0，108.8，108.5，101.0，24.1，17.6。ESI-MS m/z：213(M+Na+)，191(M+H+)。
d.N-(4-乙炔基苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(1)的制备。将2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酸(1.0g，5.2mmol)、4-乙炔基苯胺(0.61g，5.2mmol)和HATU(2.0g，5.2mmol)溶于DMF(10mL)，然后用二异丙基乙胺(2.75mL，15.8mmol)处理。将该混合物在60℃搅拌过夜。用水稀释该混合物，过滤。用水(×2)洗涤残余物，真空干燥，得到黄色固体(1.0g，66％)。
1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：10.87(s，1H)，7.74(d，J＝8.6Hz，2H)，7.56(d，J＝3.3Hz，1H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，7.07(d，J＝3.3Hz，1H)，6.53(s，1H)，3.04(s，1H)，2.63(s，3H)，2.58(s，3H)。13C NMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：162.5，155.7，142.7，140.3，139.6，133.0，119.0，117.3，116.0，108.5，107.2，105.6，84.1，76.2，24.8，18.3。ESI-MS m/z：312(M+Na+)。
实施例2-N-(4-(1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基) 苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(2)的制备
将N-(4-乙炔基苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(145mg，0.5mmol)、2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙胺(87mg，0.5mmol)和碘化亚铜(I)(20mg)在氯仿(5mL)中的混合物在室温搅拌3小时。过滤该混合物，浓缩滤液，通过急骤色谱法纯化。得到黄色泡沫体(130mg，56％)。产物为1,4-二取代的和1,5-二取代的区域异构体的混合物(4：1)。
在此报告1,4-二取代的区域异构体的数据。1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：10.82(s，1H)，7.92(s，1H)，7.83(d，J＝8.6Hz，2H)，7.80(d，J＝8.6Hz，2H)，7.55(d，J＝3.2Hz，1H)，7.05(d，J＝3.2Hz，1H)，6.51(s，1H)，4.57(t，J＝5.0Hz，2H)，3.90(t，J＝5.1Hz，2H)，3.63–3.54(m，4H)，3.45(t，J＝5.2Hz，2H)，2.82(t，J＝5.2Hz，2H)，2.63(s，3H)，2.56(s，3H)，2.15(br，2H)。13C NMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：162.5，155.6，147.8，142.6，139.6，139.5，128.2，126.4，125.5，120.4，119.6，119.3，117.3，108.4，107.1，105.9，73.5，70.8，70.3，69.7，50.4，41.8，24.8，18.3。ESI-MS m/z：464(M+H+)。
实施例3- 2-(3,6-双(二甲基氨基) 吨基 -9-基)-5-((2-(2-(2-(4-(4-(2,4- 二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰氨基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙 基)氨基甲酰基)苯甲酸酯(3)的制备
N-(4-(1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(88mg，0.19mmol)、3,6-双(二甲基氨基)吨基-9-基)(82mg，0.19mmol)和HATU(73mg，0.19mmol)溶于DMF(3mL)，然后用二异丙基乙胺(100μL，0.57mmol)处理。将该混合物在室温搅拌过夜。用水稀释该混合物，过滤。用水(×2)洗涤残余物，干燥。通过急骤色谱法纯化得到的固体，得到深红色固体(45mg，27％)。
1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：10.84(s，1H)，8.35(s，1H)，8.19(dd，J＝8.0，1.2Hz，1H)，7.92(s，1H)，7.84(d，J＝8.6Hz，2H)，7.79(d，J＝8.6Hz，2H)，7.57(d，J＝3.3Hz，1H)，7.24(d，J＝8.0Hz，1H)，7.10(t，J＝4.9Hz，1H)，7.07(d，J＝3.3Hz，1H)，6.55(d，J＝8.0Hz，2H)，6.53(s，1H)，6.46(d，J＝2.4Hz，2H)，6.35(dd，J＝8.9，2.5Hz，2H)，4.64(t，J＝5.1Hz，2H)，4.02(t，J＝5.1Hz，2H)，3.71–3.61(m，8H)，2.96(s，12H)，2.64(s，3H)，2.59(s，3H)。13C NMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：169.2，166.2，162.5，155.7，153.1，152.3，147.8，142.6，139.7，139.5，136.3，134.4，128.8，128.2，126.4，125.3，124.8，123.0，120.5，119.7，117.3，108.9，108.5，107.1，106.3，105.8，98.5，70.6，70.5，69.6，50.4，40.3，40.1，24.8，18.3。ESI-MS m/z：876(M+H+)，898(M+Na+)。
实施例4- 3-(2-(2-(4-(4-(2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰氨基)苯基)- 1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4)的制备
将N-(4-乙炔基苯基)-2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺(290mg，1.0mmol)、3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(300mg，1.0mmol)、碘化亚铜(I)(50mg)和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(5.0mg)在氯仿(15mL)中的混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂，通过急骤色谱法纯化，得到黄色粉末(480mg，82％)。
1H NMR：(500MHz，CDCl3)δ(ppm)：10.82(s，1H)，7.95(s，1H)，7.83(s，4H)，7.56(d，J＝3.3Hz，1H)，7.06(d，J＝3.4Hz，1H)，6.52(s，1H)，4.59(t，J＝5.0Hz，2H)，3.91(t，J＝5.1Hz，2H)，3.83(t，J＝6.0Hz，2H)，3.64(s，4H)，2.86(t，J＝6.0Hz，2H)，2.78(s，4H)，2.64(s，3H)，2.57(s，3H)。13C NMR：(125MHz，CDCl3)δ(ppm)：169.1，166.9，162.4，155.7，147.7，142.6，139.6，139.5，126.4，125.6，120.6，119.6，117.2，108.4，107.0，105.8，70.9，70.6，69.8，65.9，50.5，32.4，25.7，24.8，18.3。ESI-MS m/z：590(M+H+)，612(M+Na+)。
实施例5-使用蓝色底物和红色底物的葡糖脑苷脂酶活性测定法
将化合物的DMSO溶液0.5微升/孔转至黑色96孔板(最终滴度为24nM至50μM，12个浓度，2倍稀释)。将33.5μL酶溶液(7.5nM终浓度)转至各孔。在室温温育5分钟后，通过添加33微升/孔蓝色底物或66.5微升/孔红色底物启动酶反应。蓝色底物(4MU-Glc)和红色底物(Res-Glc)的终浓度分别为1.5mM和30μM。在37℃，每隔20秒在Biotek Synergy H1多模式读板器中用Ex＝573nm和Em＝610nm测定红色底物反应30分钟。在37℃温育30分钟后，通过添加33微升/孔终止溶液(1M NaOH和1M甘氨酸混合物，pH 10)终止蓝色底物反应。用读板器在Ex＝365nm和Em＝440nm测定荧光。
实施例6–使用天然底物的葡糖脑苷脂酶活性测定
将化合物的DMSO溶液(0.5微升/孔)转至黑色96孔板。最终滴度为24nM至50μM，12个浓度，2倍稀释。将33.5μL酶溶液转至各孔(7.5nM终浓度)。在室温温育5分钟后，通过添加16微升/孔天然底物启动酶反应。天然底物(葡糖神经酰胺)的终浓度为100μM。在37℃将板温育30分钟，加入Amplex Red葡萄糖/葡糖氧化酶测定缓冲液(50微升/孔)。在37℃每隔20秒用具有Ex＝573nm和Em＝610nm的Biotek Synergy H1多模式读板器测定板30分钟。
实施例7–荧光偏振测定法
使用Labcyte Echo 550液体处理机系统将荧光探针3(25毫微升/孔，50nM终浓度)转移至384孔黑色平板。将用GCase酶活性缓冲液稀释的25微升/孔酶稀释液加到平板上，在室温在黑暗中振摇20分钟。最终滴度为5nM至10μM，10个浓度，2倍稀释。在MolecularDevices Analyst GT中测定了荧光偏振，Ex＝535nm，Em＝580nm，G因子＝1.05。
实施例8–通过荧光偏振进行化合物高通量筛选(HTS)
将在GCase酶活性缓冲液中的酶(25微升/孔)加到384孔黑色平板上。使用LabcyteEcho 550液体处理机系统将荧光探针3(25毫微升/孔，50nM终浓度)转移至384孔黑色平板。将DMSO储备溶液中的化合物(50nL)转移至平板上。将该平板在室温在黑暗中振摇20分钟。最终浓度为19.5nM至10μM，10个浓度，2倍稀释。在Molecular Devices Analyst GT中测定了荧光偏振，Ex＝535nm，Em＝580nm，G因子＝1.05。
实施例9-化合物-活化的葡糖脑苷脂酶的制备
向在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的重组野生型酶(22μM，95μL，1当量)中一次加入在DMSO中的3-(2-(2-(4-(4-(2,4-二甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰氨基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4)(0.89mM，5μL，2当量)，即刻涡旋5秒。在指示的时间点，将反应溶液(2μL)采样，稀释(1：3125稀释)入测定缓冲液(50mM柠檬酸、176mM K2HPO4和0.01％吐温-20，pH 5.9)。2小时后，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)将该反应溶液透析3次。将酶调整至相同浓度，并进行活性采样。用3种底物，试卤灵底物、4-MU底物和天然底物，采用上述实施例5和实施例6中的方法，但不添加化合物测定稀释溶液。
实施例10–另外的化合物的合成和测试
根据上述实施例中提供的方法制备和测试另外的化合物。制备剂量响应曲线以测定IC50或AC50。结果如表1中所示。
表1
实施例11–用于酶替代疗法的活化剂修饰的葡糖脑苷脂酶
前言
戈谢病(GD)是由导致多器官功能障碍的葡糖脑苷脂酶(酸性β-葡糖苷酶，GCase)的功能缺陷引起的罕见遗传溶酶体贮存病(Futerman和van Meer 2004)。发现GCase中的杂合突变为帕金森病(PD)的主要危险因素(Sidransky，Nalls等人2009，Sidransky和Lopez2012，Lin and Farrer 2014，Schapira，Olanow等人2014)。葡糖脑苷脂(GCase的底物)在神经元中的蓄积促进毒性α-突触核蛋白寡聚体的形成，导致PD(Mazzulli，Xu等人2011)。认为GCase活性的增强是GCase相关的突触核蛋白病(包括PD)的潜在治疗策略(Sardi，Clarke等人2013，Sybertz和Krainc 2014)。
GD的治疗包括通过抑制葡糖神经酰胺合酶的酶替代疗法(ERT)或底物减少疗法(Bennett和Mohan 2013)。最近发现受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)是GD的新兴治疗靶标(Vitner，Salomon等人2014)。20年间已证明ERT是安全和有效的，并且器官体积的减小、血液学参数的改善和骨痛的改善已经显著改善了许多患者的生活质量(Futerman，Sussman等人2004，Weinreb，Goldblatt等人2013，Souza，Muniz等人2014)。当前有三种可用于治疗GD的具有相似活性的重组酶：伊米苷酶，维拉苷酶(velaglucerase)α和taligluceraseα(Bennett和Mohan2013)(Tekoah，Tzaban等人2013)。但是，由于这些GCase的有效性有限，所以ERT的费用从每年10万美元到每年超过25万美元(Grabowski 2008)，这给患者带来了负担。改造更稳定的酶或具有更高催化活性的酶可以减少输注的次数并且也可能降低成本(Futerman，Sussman等人2004)。
自2007年以来报道了非亚氨基糖抑制性调节剂(Zheng，Padia等人2007)和非抑制性调节剂1(图1)(Patnaik，Zheng等人2012)的几种不同骨架。提示这些调节剂结合在活性位点以外的其它位点并稳定酶(Zheng，Padia等人2007)(Patnaik，Zheng等人2012)。调节剂1可以活化纯化的wt.GCase，其AC50为5.2μM和约为100％的最大活化活性(Patnaik，Zheng等人2012)。在本研究中为了提高GCase酶活性和ERT的稳定性并研究调节剂的活化机制，我们首次报道了高活化活化剂和活化剂共价修饰的GCase。
结果
高度活化活化剂的发现。为了开发有效且高活化活化剂，对1的吡唑并嘧啶环进行修饰以产生表现出更高酶活性的吡咯并嘧啶骨架化合物。通过点击反应使苯环上的炔基与带有聚乙二醇(PEG2)连接基的叠氮化物偶联，得到2(方案1)。在4MU-Glc底物酶活性测定法中(图2A)，2具有约14倍的最大活性和6.31μM的AC50，据我们所知，是所鉴定的最有效的活化剂之一。此外，2在50μM高度活化(10倍)Res-β-glc底物水解，而先导化合物1在Res-β-glc底物酶活性测定法中没有显示任何活化活性。与此前的报道(Patnaik，Zheng等人2012)一致，在本体外天然底物测定法中这些化合物中无一证实任何活化活性。
用于荧光偏振测定法中的荧光探针的设计。为了促进活化剂结合亲和力的检测，使化合物2与荧光团偶联，得到探针3(方案1)。荧光偏振(FP)信号随着酶浓度的增加而逐渐饱和(图3A)。观察到探针3具有有效的结合亲和力，其Kd值为0.71μM，表明探针3可以直接与GCase结合。为了测定活化剂的结合亲和力，探针3分别与不同浓度的化合物1和2竞争。在该测定法中化合物1表现出非常弱的活性，而化合物2表现出高得多的活性(图3B)。
亲电探针4的设计和共价结合试验。设计和合成了探针4，以通过NHS酯与伯胺的反应靶向结合位点周围的赖氨酸残基(方案1)。在4MU-Glc(20倍)和红色底物(10倍)酶活性测定法二者中探针4也显示出高活化活性(图2A和2B)。
使探针4经受针对GCase的共价结合试验。谨慎调整反应条件，包括缓冲液pH值，蛋白质和探针的浓度以及反应温度，以达到最大活化。在优化的反应条件下，酶活性以时间依赖性方式被活化(图5)。探针4可以活化该酶，在4MU-Glc底物(图5A)和红色底物(图5B)酶活性测定法中与wt.GCase相比它分别具有约22和28倍的活性。令我们惊奇的是，该共价活化的酶在天然底物测定法中也证实了16倍活性提高(图5C)。在三种底物测定法中透析后酶活性没有显著降低，表明该酶已经被探针4共价修饰。高分辨率LC-MS光谱确认了这一结果，表明尽管在蛋白质上存在二十二个赖氨酸残基，但是GCase被1-3个配体修饰。
与探针4预活化的GCase的皂化蛋白C竞争性试验。wt.GCase可以被GCase的天然辅因子皂化蛋白C以剂量依赖性方式活化(Tamargo，Velayati等人2012)，其AC50值为100nM(图5)。然而，皂化蛋白C的结合位点和结合模式仍然未知。为了研究皂化蛋白C和探针4是否共有相同的结合位点，用皂化蛋白C滴定共价活化的GCase，并且在4MU-Glc底物酶活性测定法中测试了酶活性。预活化的酶可以被皂化蛋白C以剂量依赖性方式进一步活化，其AC50值为71nM(图5)。似乎活化剂和皂化蛋白C以协同模式调节酶活性，这提示探针4和皂化蛋白C的结合位点不同。
pH 4.7缓冲液和人血浆中的酶稳定性测定。为了测试探针4是否改变GCase的酶稳定性，我们使用了两种环境进行GCase活性稳定性测定(Tekoah，Tzaban等人2013)。第一种是柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，其pH值为4.7。在这种条件下，在第4天wt.GCase仅剩下约15％的活性(图6A和6B)，这与此前的研究(Tekoah，Tzaban等人2013)类似。一个有趣的发现是，即使在第10天，活化的GCase仍剩有超过20％的活性。这一结果提示，活化的GCase不仅每天具有更高的绝对GCase活性，而且在低pH缓冲液中归一化后显示出强烈的活性降低延迟。在低pH缓冲液中酶活性更高的一个可能原因是活化的GCase被共价化合物稳定，并且更难伸展。
然后我们测试了人血浆(pH 7.4)中的活化的GCase和wt.GCase。令我们惊奇地，即使活化的GCase在各个时间点具有更高的活性，在归一化后，活化的GCase和wt.GCase显示出类似的酶活性稳定性曲线(图6C和6D)。这一结果提示探针4不影响人血浆中GCase的降解。
U937巨噬细胞摄取试验。我们提出的以下问题是人巨噬细胞(GD的靶细胞)是否能够正常摄取活化的GCase。在PMA诱导后，我们用活化的GCase和wt.GCase处理U937细胞系(Tekoah，Tzaban等人2013)。尽管活化的GCase和wt.GCase的蛋白质摄取水平相等(图7B)，但是与内源性GC相比活化的GCase显示出超过25倍的活性，而wt.GCase只有约3倍的活性(图7A)。这些结果表明，探针4不会影响GCase被摄入巨噬细胞，但它可以提高细胞中的GCase酶活性。
讨论
二十多年来，酶替代疗法(ERT)在治疗遗传性溶酶体贮积病，例如戈谢病(Futerman，Sussman等人2004)、法布里(Fabry)病(Pisani，Visciano等人2012)和庞皮(Pompe)病(Angelini和Semplicini 2012)中已经取得了巨大成功。然而，ERT的主要问题是酶处理的成本(Grabowski 2008)，这阻碍了许多患者获得这种疗法。在本研究中，我们发现了高活化化合物，并将它们用于重组葡糖脑苷脂酶的特异性修饰以改善酶活性和稳定性。
2012年先导化合物1作为非抑制性蛋白伴侣被发现(Patnaik，Zheng等人2012)。根据我们的SAR研究，经过我们发现有效活化剂的努力，发现一种新的吡咯并嘧啶骨架具有比1更高的活化活性和结合亲和力。因为这些活化剂在水溶液中的溶解度低，所以发现用带有PEG连接基的三唑环对苯环的对位进一步修饰以呈现更高的活化活性和更好的溶解性。发现具有PEG2连接基的化合物2在这些系列的活化剂中产生最高活化。
为了评价这些活化剂的SAR，需要结合试验来评价它们的结合亲和力。关于GCase和活化剂的结合所报道的唯一检测方法是微量热迁移(MST)(Patnaik，Zheng等人2012)。尝试其它一些生物物理学技术，例如等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)和荧光热位移，以查明GCase活化剂的结合。令人遗憾地的是，在我们的研究中这些方法没有得到任何阳性结果。荧光偏振(FP)测定法是一种均质方法，其可以对多种多样的分子相互作用和酶活性进行快速和定量的分析(Rossi和Taylor 2011)。设计和合成了荧光探针以测定探针和GCase的结合亲和力。测定探针3具有约0.71uM的Kd值，表明该探针与GCase紧密结合。用这种FP测定法，我们可以检测所述的化合物与GCase的结合，不管它们是活化剂、抑制剂或仅仅是结合剂。因此这种方法可以进一步用于高通量筛选(HTS)中以发现更多种作为GCase的调节剂的化合物。
由于我们拥有了高活化活化剂，所以我们假定一旦GCase被我们的化合物共价修饰，因为活化剂的局部浓度高，所以酶活性将被增强至最大活性。大多数蛋白质表面上存在的高反应性基团赖氨酸残基的伯胺可以被许多不同的化学物质修饰(Nakamura，Kawai等人2009，Choi，Connelly等人2010)。在大量生物学研究中将NHS酯用于与赖氨酸反应(Nanda和Lorsch 2014)。基于我们的SAR研究，我们发现PEG2连接基是获得最大酶活性的适合长度。在共价结合试验中，wt.GCase被探针4以时间依赖性方式修饰和活化。通过在pH 7.2一小时内使用两个当量的4可以获得最大酶活性。较高pH值或探针4的比率增加可以降低酶活性，这提示探针4的非特异性结合将影响酶活性。考虑到我们在共价结合试验中使用的条件，这一结果证明酶活性升高来自配体的骨架以及酶的特异性共价修饰。
研究了皂化蛋白C结合模式并建模(Atrian，Lopez-Vinas等人2008)。如果活化的酶不能被皂化蛋白C活化，则活化剂和皂化蛋白C的结合位点将是相同的。实际上，活化的GCase可被皂化蛋白C进一步活化。活化剂的修饰不干扰皂化蛋白C相互作用，表明活化剂的结合位点不同于皂化蛋白C。结果也提示我们高活化的GCase可能不需要皂化蛋白C进一步活化。该酶可用于具有皂化蛋白C突变的患者。
为了评价活化的酶是否可用于ERT中，我们考察了酶稳定性和细胞摄取特性。活化的酶在酸性缓冲液中显示高得多的稳定性，并且在人血浆中显示与wt.GCase相同的稳定性。在U937摄取试验中，与wt.GCase相比，PMA诱导的U937巨噬细胞可以摄取相同量的活化的GCase，这表明化合物修饰不影响GCase摄取过程。如本研究中所证实的，活化的GCase在酸性条件下具有高得多的酶活性和稳定性，我们可以建议该酶的注射剂量减少可能用于GD的ERT中。
另外，更多不同的重组溶酶体酶，例如α-1-艾杜糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶和艾杜糖醛酸硫酸酯酶已被批准用于治疗它们各自的缺陷疾病(MPS I、法布里病、庞皮病、MPS VI和MPS II)(Desnick和Schuchman 2012，Valayannopoulos 2013)。我们的活化剂修饰的酶方法的广泛应用具有改善其它溶酶体贮积病中的治疗的潜力。
方法
生物学
4-甲基伞形酮基β-D-吡喃葡萄糖苷(4MU-β-glc)(蓝色-荧光底物)、试卤灵β-D-吡喃葡萄糖苷(Res-β-glc)(红色-荧光底物)和缓冲液成分购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。天然底物葡糖神经酰胺购自Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，Alabama)。Amplex Red葡萄糖/葡糖氧化酶测定试剂盒购自Invitrogen(Eugene，OR)以测定葡糖脑苷脂酶裂解葡糖神经酰胺时产生的葡萄糖的量。
重组wt.酶维拉西酶α(Shire Human Genetic Therapies，Inc.)从临床输注后的残留溶液中获得。GCase活性测定缓冲液由50mM柠檬酸、176mM K2HPO4和0.01％吐温-20组成，pH 5.9。1M氢氧化钠和1M甘氨酸的溶液用作4MU-β-glc底物测定法的终止溶液。
使用4MU-β-glc底物和Res-β-glc底物的化合物活性测定法。将化合物的DMSO溶液0.5微升/孔的转移至黑色96孔板(最终滴定度为24nM至50μM，12个浓度)。将33.5μL酶溶液(7.5nM终浓度)转移到孔中。在室温温育5分钟后，通过加入33微升/孔4MU-Glc底物或66.5微升/孔红色底物来启动酶反应。4MU-Glc底物和Res-Glc底物的终浓度分别为1.5mM和30μM。在37℃下每隔20秒在Biotek Synergy H1多模式读板器中用Ex＝573nm和Em＝610nm测定红色底物反应30分钟。在37℃温育30分钟后，通过加入33微升/孔终止溶液(1M NaOH和1M甘氨酸混合物，pH 10)终止4MU-Glc底物反应。然后在读板器中用Ex＝365nm和Em＝440nm测定荧光。
使用天然底物的化合物活性测定法。通过使用此前所述的稍微改进的方法(Motabar，Goldin等人2012)用天然底物测试了化合物。将化合物的DMSO溶液0.5微升/孔转移至黑色96孔板(最终滴定度为24nM至50μM，12个浓度)。将33.5μL酶溶液转移至各孔中。在室温温育5分钟后，通过加入16微升/孔天然底物来启动酶反应。天然底物(葡糖神经酰胺)的终浓度为100μM。将板在37℃温育30分钟，并加入Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶测定缓冲液(50微升/孔)。在37℃，在Biotek Synergy H1多模式读板器中，用Ex＝573nm和Em＝610nm每隔20秒测定板30分钟。
荧光偏振(FP)测定法。使用Labcyte Echo 550Liquid Handler系统将荧光探针3(25毫微升/孔，50nM终浓度)转移至384孔黑板。将在GCase酶活性缓冲液中的25微升/孔酶稀释液(最终滴定5nM至10μM，10个浓度，2倍稀释)加到板中，并在室温在黑暗中振摇20分钟。在Molecular Devices Analyst GT中用Ex＝535nm，Em＝580nm、G因子＝1.05，测定荧光偏振。
使用FP测定法的结合亲和力测试。将GCase酶活性缓冲液中的酶(25微升/孔)添加到384孔黑色板中。使用Labcyte Echo 550液体处理系统将荧光探针3(25毫微升/孔，50nM终浓度)转移到384孔黑色板中。将化合物1和2的DMSO储备溶液(50nL)(最终滴定为19.5nM至10μM，10个浓度)转移至板。将板在室温下黑暗中振摇20分钟。在Molecular DevicesAnalyst GT中用Ex＝535nm、Em＝580nm、G因子＝1.05测定荧光偏振。
使用4MU-Glc底物的皂化蛋白C活化试验。将皂化蛋白C(0.5微升/孔)添加至黑色96孔板(最终滴度为1.72nM至1.76μM，12个浓度)。将在测定缓冲液(50mM柠檬酸、176mMK2HPO4、0.01％吐温-20、0.01％(g/mL)磷脂酰丝氨酸，pH 4.7)中的化合物4活化的酶和wt.酶(33.5微升/孔，7.5nM终浓度)分别加到孔中。在室温温育5分钟后，通过加入33微升/孔4MU-Glc底物来启动酶反应。4MU-Glc底物的终浓度是1.5mM。在37℃温育30分钟后，通过加入33微升/孔终止溶液(1M NaOH和1M甘氨酸混合物，pH 10)终止反应。然后在读板器中用Ex＝365nm和Em＝440nm测定荧光。
高分辨率HPLC-MS光谱。如上所述，在pH 7.2用化合物4处理酶60分钟。样品用0.1MTris pH 7.2缓冲液透析，在配备C8柱的Agilent 6210A LC-TOF质谱仪上分析。
人U937巨噬细胞的分化。通过向单核细胞培养物中加入75ng/ml PMA 3天(在75cm2烧瓶中)，使人单核细胞细胞系U937最佳地分化成巨噬细胞(Brumshtein，Salinas等人2010)。通过与培养板粘附使巨噬细胞富集，并通过形态学和受体染色鉴定巨噬细胞。
巨噬细胞中的GCase摄取研究。根据所报道的方法(Tekoah，Tzaban等人2013)，稍加改进，进行了该试验。如上所述用化合物4或DMSO在pH 7.2处理酶60分钟，然后用PBS透析。将分化后的U937细胞(～1.6*106细胞)与60μg/ml活化的酶和wt.酶在F12K培养基中在5％CO2、37℃的温育箱中温育10分钟。然后将细胞用富含甘露聚糖(1mg/ml)的冰冷的PBS洗涤两次。为了进一步确保与膜非特异性结合的任何蛋白质的释放，用冰冷甘氨酸缓冲液(0.8％NaCl、0.038％KCl、0.01％MgCl2、0.01％CaCl2、0.7％甘氨酸[pH 3])洗涤一半细胞，然后再进行两次冷PBS洗涤。另一半细胞用作测定总酶活性的对照(结合的和摄入的酶)。通过加入β-葡糖脑苷脂酶活性缓冲液(60mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液；0.15％Triton X-100；0.125％牛磺胆酸钠，pH5.5)裂解细胞，然后移液和一次冷冻/融化循环。使用如上详述的比色法对获得的裂解物进行酶活性的测定。将总酶活性归一化为通过Bradford测定法所测定的总可溶性蛋白质。将有效摄取计算为细胞内活性在对照的总酶活性中的百分比。
化学
使用商购试剂和溶剂，没有进一步纯化。如本实施例中和上述实施例中所示合成和分析了化合物。全部反应通过薄层色谱法(TLC)、采用0.25mm Silicycle超硬250μM TLC板(60F254)监测。通过急骤色谱法、采用使用Silicycle硅胶柱(4g、12g、24g、40g或80g)的Agilent971-FP急骤纯化系统进行反应产物的纯化。全部化合物的纯度均超过95％，并且使用Agilent 1260Infinity HPLC系统进行分析。使用Bruker Avance III 500MHz系统(500MHz，1H NMR；以及125MHz，13C NMR)光谱仪得到1H NMR光谱和13C NMR。报告化学位移：(δ＝7.26)1H NMR和氯仿(δ＝77.16)13C NMR；或二甲亚砜(δ＝2.50)1H和二甲亚砜(δ＝39.52)13C NMR。将数据报告为(br＝宽峰，s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰)。使用Bruker AmaZon SL系统得到质谱。
参考文献
Angelini，C.and C.Semplicini(2012)."Enzyme replacement therapy forPompe disease."Curr Neurol Neurosci Rep 12(1)：70-75.
Atrian，S.et al.(2008)."An evolutionary and structure-based dockingmodel for glucocerebrosidase-saposin C and glucocerebrosidase-substrateinteractions-relevance for Gaucher disease."Proteins 70(3)：882-891.
Bennett，L.L.and D.Mohan(2013)."Gaucher disease and its treatmentoptions."Ann Pharmacother 47(9)：1182-1193.
Brumshtein，B.et al.(2010)."Characterization of gene-activated humanacid-beta-glucosidase：crystal structure，glycan composition，andinternalization into macrophages."Glycobiology 20(1)：24-32.
Choi，S.et al.(2010)."Chemoselective small molecules that covalentlymodify one lysine in a non-enzyme protein in plasma."Nature Chemical Biology6(2)：133-139.
Desnick，R.J.and E.H.Schuchman(2012)."Enzyme replacement therapy forlysosomal diseases：lessons from 20years of experience and remainingchallenges."Annu Rev Genomics Hum Genet 13：307-335.
Futerman，A.H.et al.(2004)."New directions in the treatment of Gaucherdisease."Trends in Pharmacological Sciences 25(3)：147-151.
Futerman，A.H.and G.van Meer(2004)."The cell biology of lysosomalstorage disorders."Nat Rev Mol Cell Biol 5(7)：554-565.
Grabowski，G.A.(2008)."Phenotype，diagnosis，and treatment of Gaucher'sdisease."Lancet 372(9645)：1263-1271.
Lin，M.K.and M.J.Farrer(2014)."Genetics and genomics of Parkinson'sdisease."Genome Medicine 6.
Mazzulli，J.R.et al.(2011)."Gaucher disease glucocerebrosidase andalpha-synuclein form a bidirectional pathogenic loop in synucleinopathies."Cell 146(1)：37-52.
Motabar，O.et al.(2012)."A high throughput glucocerebrosidase assayusing the natural substrate glucosylceramide."Anal Bioanal Chem402(2)：731-739.
Nakamura，T.et al.(2009)."Covalent modification of lysine residues byallyl isothiocyanate in physiological conditions：plausible transformation ofisothiocyanate from thiol to amine."Chem Res Toxicol22(3)：536-542.
Nanda，J.S.and J.R.Lorsch(2014)."Labeling a Protein with FluorophoresUsing NHS Ester Derivitization."Laboratory Methods in Enzymology：Protein Pt A536：87-94.
Patnaik，S.et al.(2012)."Discovery，structure-activity relationship，andbiological evaluation of noninhibitory small molecule chaperones ofglucocerebrosidase."J Med Chem 55(12)：5734-5748.
Pisani，A.et al.(2012)."Enzyme replacement therapy in patients withFabry disease：state of the art and review of the literature."Mol Genet Metab107(3)：267-275.
Rossi，A.M.and C.W.Taylor(2011)."Analysis of protein-ligandinteractions by fluorescence polarization."Nat Protoc 6(3)：365-387.
Sardi，S.P.et al.(2013)."Augmenting CNS glucocerebrosidase activity asa therapeutic strategy for parkinsonism and other Gaucher-relatedsynucleinopathies."Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 110(9)：3537-3542.
Schapira，A.H.V.et al.(2014)."Slowing of neurodegeneration inParkinson's disease and Huntington's disease：future therapeuticperspectives."Lancet 384(9942)：545-555.
Sidransky，E.and G.Lopez(2012)."The link between the GBA gene andparkinsonism."Lancet Neurology 11(11)：986-998.
Sidransky，E.et al.(2009)."Multicenter analysis of glucocerebrosidasemutations in Parkinson's disease."N Engl J Med361(17)：1651-1661.
Souza，A.M.et al.(2014)."Study of enzyme replacement therapy forGaucher Disease：comparative analysis of clinical and laboratory parameters atdiagnosis and after two，five and ten years of treatment."Rev Bras HematolHemoter 36(5)：345-350.
Sybertz，E.and D.Krainc(2014)."Development of targeted therapies forParkinson's disease and related synucleinopathies."J Lipid Res 55(10)：1996-2003.
Tamargo，R.J.et al.(2012)."The role of saposin C in Gaucher disease."Mol Genet Metab 106(3)：257-263.
Tekoah，Y.et al.(2013)."Glycosylation and functionality of recombinantbeta-glucocerebrosidase from various production systems."Bioscience Reports33：771-U272.
Toja，E.et al.(1986)."Pyrrolopyridine Analogs of Nalidixic-Acid.1.Pyrrolo[2,3-B]Pyridines."Journal of Heterocyclic Chemistry 23(5)：1555-1560.
Valayannopoulos，V.(2013)."Enzyme replacement therapy and substratereduction therapy in lysosomal storage disorders with neurologicalexpression."Handb Clin Neurol 113：1851-1857.
Vitner，E.B.et al.(2014)."RIPK3as a potential therapeutic target forGaucher's disease."Nature Medicine 20(2)：204-208.
Weinreb，N.J.et al.(2013)."Long-term clinical outcomes in type1Gaucher disease following 10years of imiglucerase treatment."J Inherit MetabDis 36(3)：543-553.
Zheng，W.et al.(2007)."Three classes of glucocerebrosidase inhibitorsidentified by quantitative high-throughput screening are chaperone leads forGaucher disease."Proc Natl Acad Sci U S A 104(32)：13192-13197.
实施例12–另外的被取代的喹唑啉化合物的合成和测试
根据上述实施例中提供的方法制备和测试了另外的化合物。结果如表2中所示。
表2.
对于本领域技术人员明显的是，可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下对本申请中所公开的发明做出取代和修饰的改变。可以在缺乏本申请中没有具体公开的任何要素或技术特征的存在下实施本申请中所示例描述的发明。所使用的术语和表述作为描述的词语而不是限制的词语使用，且在这类术语和表述的应用中不想排除所示和所述特征的任何等效方案或其部分，而是认为各种变型可能在本发明的范围内。因此，应当理解，尽管通过具体实施方案和任选的特征举例说明了本发明，但是本领域技术人员可以将本申请中所公开的概念的变型和/或改变再分类，并且认为这类变型和改变在本发明的范围内。
本申请引用了许多专利和非专利参考文献。通过参考将所引用的参考文献整体并入本申请。在本说明书中某个术的语定义与所引用的参考文献中该术语的定义之间存在不一致的情况下，应当基于本说明书中的定义解释该术语。

Claims (20)

1.具有式I的化合物或其盐或溶剂合物：
其中：
R1是氢；C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；包含1个5元或6元环的饱和或不饱和碳环或杂环，包含2个稠合5元或6元环的饱和或不饱和碳环或杂环，或烷基噻吩；且R1任选地在一个或多个位置上被如下基团取代：C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤素基团、卤代烷基、任选地被卤素取代的苯基、任选地被卤素取代的苄基、任选地被羧基取代的三唑基、2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基、氨基、烷基-N,N-二烷基氨基、烷基-烷氧基-氨基、烷基-烷氧基-烷氧基-氨基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基、烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基或烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基；咪唑基；任选地被苯氧基取代的吡啶基；吡咯烷基、哌嗪基、4-烷基哌嗪基、4-苄基哌嗪基、烷基-4-烷基哌嗪基；哌啶基；4-烷基哌啶基；4-N,N,二烷基氨基哌啶基；吗啉基；烷基吗啉基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；叠氮基；羟基；烷基羟基；炔基苯基；苯基甲酮基；氧基苯基；氧基羧基，或R1具有选自如下的式：
且R3具有选自如下的式：
且R4是H、C1-C8烷基、苯基或琥珀酰亚氨基；且
R2是C1-C6烷基或吡啶基(例如，2-基、3-基或4-基)。
2.权利要求1的化合物，其中R1选自由如下基团组成的组：
3.权利要求1的化合物，它具有式IA：
其中：
R2是氢；C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；C1-C6烷氧基；卤素基团；卤代烷基；苯基；苄基；任选地被羧酸基团取代的三唑基；2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基；氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；烷基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基；以及烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基；咪唑基；吡咯烷基；哌嗪基；4-烷基哌嗪基；4-苄基哌嗪基；烷基-4-烷基哌嗪基；哌啶基；4-烷基哌啶基；4-N,N,二烷基氨基哌啶基；吗啉基；烷基吗啉基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；叠氮基；羟基；烷基羟基；炔基苯基；苯基甲酮基；氧基苯基；或氧基羧酸基团。
4.权利要求1的化合物，它具有式IB：
其中：
R3是羧基；2,5-二氧代吡咯烷基-1-基-甲酸酯基；烷基氨基；烷基-N,N-二烷基氨基；烷基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-氨基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-吗啉基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-1-烷基吡咯烷基；烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环己基；以及烷基-烷氧基-烷氧基-甲酰胺-烷基-环丁基。
5.权利要求1的化合物，其中R1、R2和R3中的任意一个包含荧光团。
6.权利要求1的化合物，它具有式ID：
其中：
X是N或S；且
R4、R5、R6和R7各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和卤素。
7.药物组合物，它包含权利要求1的化合物和药用载体。
8.治疗与葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症的方法，该方法包括施用权利要求7的组合物。
9.权利要求8的方法，其中所述的疾病或病症是神经疾病或病症。
10.权利要求9的方法，其中所述的神经疾病或病症是变性神经疾病或病症。
11.权利要求10的方法，其中所述的变性神经疾病或病症是戈谢病。
12.权利要求10的方法，其中所述的变性神经疾病或病症是帕金森病。
13.荧光探针，它包含权利要求5的化合物。
14.筛选与葡糖脑苷脂酶结合的化合物的方法，该方法包括使葡糖脑苷脂酶与权利要求13的荧光探针接触并且观察荧光偏振。
15.活化的葡糖脑苷脂酶，它包含与权利要求1的化合物共价结合的葡糖脑苷脂酶。
16.药物组合物，它包含权利要求15的活化的葡糖脑苷脂酶和药用载体。
17.治疗与葡糖脑苷脂酶活性相关的疾病或病症的方法，该方法包括施用权利要求16的组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述的疾病或病症是神经疾病或病症。
19.权利要求18的方法，其中所述的疾病或病症是变性神经疾病或病症。
20.权利要求19的方法，其中所述的变性神经疾病或病症是戈谢病。
CN201680049556.7A 2015-07-01 2016-06-30 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途 Pending CN108290894A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562187463P 2015-07-01 2015-07-01
US62/187,463 2015-07-01
PCT/US2016/040471 WO2017004408A1 (en) 2015-07-01 2016-06-30 Substituted 4-methyl-pyrrolo[1.2-a]pyrimidine-8-carboxamide compounds and uses thereof for modulating glucocerebrosidase activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108290894A true CN108290894A (zh) 2018-07-17

Family

ID=57609246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680049556.7A Pending CN108290894A (zh) 2015-07-01 2016-06-30 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途

Country Status (5)

Country Link
US (5) US9802942B2 (zh)
EP (1) EP3317282B1 (zh)
JP (1) JP2018522872A (zh)
CN (1) CN108290894A (zh)
WO (1) WO2017004408A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115246842A (zh) * 2022-06-15 2022-10-28 深圳湾实验室 一类靶向去泛素化酶usp25和usp28的小分子抑制剂

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6734860B2 (ja) 2014-11-06 2020-08-05 リソソーマル・セラピューティクス・インコーポレイテッドＬｙｓｏｓｏｍａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 置換ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンおよび医療疾患の治療におけるその使用
ES2958391T3 (es) 2014-11-06 2024-02-08 Bial R&D Invest S A Imidazo[1,5-a]pirimidinas sustituidas y su uso en el tratamiento de trastornos médicos
EP3215509B1 (en) 2014-11-06 2020-02-26 Lysosomal Therapeutics Inc. Substituted pyrrolo[1,2-a]pyrimidines and their use in the treatment of medical disorders
CN108290894A (zh) * 2015-07-01 2018-07-17 西北大学 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途
WO2017004405A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Northwestern University Substituted quinazoline compounds and uses thereof for modulating glucocerebrosidase activity
CA3020287A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Lysosomal Therapeutics Inc. Pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl carboxamide compounds and their use in the treatment of medical disorders
MX2018012208A (es) 2016-04-06 2019-03-28 Lysosomal Therapeutics Inc Compuestos a base de imidazo [1,5-a] pirimidinil carboxamida y su uso en el tratamiento de trastornos médicos.
JP7034935B2 (ja) * 2016-04-06 2022-03-14 リソソーマル・セラピューティクス・インコーポレイテッド ピロロ［１，２－ａ］ピリミジニルカルボキサミド化合物および医学的障害の処置におけるその使用
WO2017192930A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Lysosomal Therapeutics Inc. SUBSTITUTED IMIDAZO[1,2-b]PYRIDAZINES, SUBSTITUTED IMIDAZO[1,5-b]PYRIDAZINES, RELATED COMPOUNDS, AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF MEDICAL DISORDERS
WO2017192931A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Lysosomal Therapeutics Inc. SUBSTITUTED IMDAZO[1,2-α]PYRIDINES, SUBSTITUTED IMIDAZO[1,2-α]PYRAZINES, RELATED COMPOUNDS, AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF MEDICAL DISORDERS
JP7317721B2 (ja) * 2018-01-31 2023-07-31 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
JP7081865B2 (ja) * 2018-03-23 2022-06-07 ベキシオン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド サポシンｃ薬学的組成物および癌を治療する方法
US10882865B2 (en) 2018-08-31 2021-01-05 Northwestern University Pyrrolopyrimidine compounds and uses thereof for modulating glucocerebrosidase activity
US11912647B2 (en) 2020-05-22 2024-02-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Diversity-oriented synthesis of N,N,O-trisubstituted hydroxylamines from alcohols and amines by N—O bond formation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103534255A (zh) * 2010-12-08 2014-01-22 美国健康及人类服务部 作为葡萄糖脑苷脂酶激活剂的取代的吡唑并嘧啶
CN103917094A (zh) * 2011-03-18 2014-07-09 建新公司 葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂
WO2016073891A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Lysosomal Therapeutics Inc. Substituted pyrrolo[1,2-a]pyrimidines and their use in the treatment of medical disorders

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6276076A (ja) * 1985-09-30 1987-04-08 Toshiba Corp デイスク記憶装置
JP4742273B2 (ja) 2004-01-06 2011-08-10 大正製薬株式会社 ピロロピリミジン及びピロロトリアジン誘導体
EA018036B1 (ru) * 2006-11-27 2013-05-30 Х. Лундбекк А/С Гетероариламидные производные
JP6276037B2 (ja) 2014-01-10 2018-02-07 旭化成株式会社 中空糸膜モジュール、及びろ過方法
CN108290894A (zh) * 2015-07-01 2018-07-17 西北大学 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途
WO2017161137A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Lysosomal Therapeutics Inc. Methods and compositions for treating a neurodegenerative disorder in a sphingotyped subject
JP7034935B2 (ja) 2016-04-06 2022-03-14 リソソーマル・セラピューティクス・インコーポレイテッド ピロロ［１，２－ａ］ピリミジニルカルボキサミド化合物および医学的障害の処置におけるその使用
EP3452045A1 (en) 2016-05-04 2019-03-13 Lysosomal Therapeutics Inc. Methods of treatment and combination therapies using gcase activator heterobicyclic and related compounds

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103534255A (zh) * 2010-12-08 2014-01-22 美国健康及人类服务部 作为葡萄糖脑苷脂酶激活剂的取代的吡唑并嘧啶
CN103917094A (zh) * 2011-03-18 2014-07-09 建新公司 葡萄糖基神经酰胺合酶抑制剂
WO2016073891A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Lysosomal Therapeutics Inc. Substituted pyrrolo[1,2-a]pyrimidines and their use in the treatment of medical disorders

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115246842A (zh) * 2022-06-15 2022-10-28 深圳湾实验室 一类靶向去泛素化酶usp25和usp28的小分子抑制剂
WO2023241640A1 (zh) * 2022-06-15 2023-12-21 深圳湾实验室 一类靶向去泛素化酶usp25和usp28的小分子抑制剂
CN115246842B (zh) * 2022-06-15 2024-05-24 深圳湾实验室 一类靶向去泛素化酶usp25和usp28的小分子抑制剂

Also Published As

Publication number Publication date
US20190152980A1 (en) 2019-05-23
US20170002013A1 (en) 2017-01-05
US9802942B2 (en) 2017-10-31
US20180037586A1 (en) 2018-02-08
US10227352B2 (en) 2019-03-12
US10040799B2 (en) 2018-08-07
EP3317282B1 (en) 2020-12-09
US10442812B2 (en) 2019-10-15
WO2017004408A1 (en) 2017-01-05
EP3317282A4 (en) 2018-12-26
EP3317282A1 (en) 2018-05-09
US20180305367A1 (en) 2018-10-25
JP2018522872A (ja) 2018-08-16
US20200010474A1 (en) 2020-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108290894A (zh) 被取代的4-甲基-吡咯并[1,2-a]嘧啶-8-甲酰胺类化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途
CN108290855A (zh) 被取代的喹唑啉化合物及其调节葡糖脑苷脂酶活性的用途
EP1949902B1 (en) USE OF COMBINATION OF ANTI-ANGIOGENIC SUBSTANCE AND c-kit KINASE INHIBITOR
HUE028129T2 (en) New preparations for the prevention and / or treatment of lysosomal storage disorders
US7807399B2 (en) Methods for detecting thiol-containing nucleotide diphosphates with thiol-reactive fluorescent reagents
EP2491922B1 (en) Immediate-release tablet formulations of a thrombin receptor antagonist
KR20110033852A (ko) 도파민 수용체 리간드를 함유하는 약학적 제형
US10882865B2 (en) Pyrrolopyrimidine compounds and uses thereof for modulating glucocerebrosidase activity
EP3661919A1 (en) Substituted fused pyrimidine compounds and uses there
US20060052386A1 (en) Sigma ligands for neuronal regeneration and functional recovery
CN105418506B (zh) 乙酰苄胺哌嗪类衍生物及其作为脑神经保护剂的应用
Cheng et al. Bioevaluation of sixteen ADMDP stereoisomers toward alpha-galactosidase A: Development of a new pharmacological chaperone for the treatment of Fabry disease and potential enhancement of enzyme replacement therapy efficiency
CN110193012A (zh) 一种氧代吡啶酰胺类衍生物的药物组合物及其制备方法
Trapero et al. Adamantane substituted aminocyclitols as pharmacological chaperones for Gaucher disease
US20210096129A1 (en) Methods and Compositions for Spacial and Temporal Measurement of Catalytic Activity
CN103221396B (zh) 双胍衍生化合物
WO2024040241A1 (en) Pharmaceutical formulations, processes for preparation, and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20211026

AD01 Patent right deemed abandoned