CN108290868B - 1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及其衍生物 - Google Patents

1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及其衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种式(I)的化合物或其盐和/或药学上可接受的溶剂化物，其制备方法及其用途，特别是其治疗用途，主要是用于治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的用途。

Description

1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及 其衍生物
技术领域
本发明涉及化合物1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及其衍生物，其合成方法及其用途，特别是其治疗用途，尤其是用于治疗与内源性大麻素系统活动过度相关的病症，以及其用于纯美学目的，尤其是用于减肥的用途。
背景技术
内源性大麻素系统(SEC)是一种复杂的系统，其包含大麻素受体、其内源性配体(即，内源性大麻素AEA和2-AG，更通常地分别被称为花生四烯酸乙醇胺(anandamide)和2-花生四烯酰甘油)和多种代谢酶，所述代谢酶催化内源性大麻素的形成和降解。目前公认内源性大麻素是由膜脂质前体“按需”生成的，并且它们的生物学作用更特别地通过两种具有七个跨膜结构域的G蛋白偶联受体(即，CB1和/或CB2受体)传递。
后者存在于人体的许多器官和组织中：事实上，除了大脑和免疫系统(在其中它们的表达占主导地位)以外，尤其是在肠(Di Carlo等人，2003)、膀胱(Pertwee，2001)、脂肪组织(Cota等人，2003)、肝脏(Osei-Hyiaman等人，2005)、睾丸(Gye等人，2001)、子宫(Das等人1995)、视网膜(Buckley等人，1998)、血管内皮(Liu等人，2003)和肌肉中鉴定出了CB1和CB2受体。
由于它们在组织中广泛存在，这些受体涉及许多生物学功能的调节，也涉及各种病理生理学过程。事实上，已经在多种病理中观察到由于内源性大麻素CB1和/或CB2受体或代谢内源性大麻素和/或参与内源性大麻素合成通路的酶的表达改变而导致的内源性大麻素系统的失调。在这些当中，肥胖和相关的代谢紊乱、糖尿病及其并发症、肝脏、肾脏和心血管疾病、骨质疏松症、癌症和生育问题与内源性大麻素系统的活动过度有关，而炎性肠病和精神和神经退行性疾病与所述系统的活动不足有关(Di Marzo，2008；Izzo等人，2010；Pacher等人，2013；Maccarone等人，2015)。
对于肥胖症，已经清楚地证实，内源性大麻素系统的超活化导致食欲的刺激，从而促进体重增加，同时改变代谢参数如血液胰岛素、胰岛素抵抗、血糖、血脂等(RavinetTrillou C.等人，2003；Di Marzo和Matias，2005；Despres和Lemieux，2006)。
因此，已经开发并在科学文献中全面描述了不同的治疗策略，所述治疗策略旨在通过直接作用于该系统的介质(即CB1和/或CB2受体)，来纠正这种内源性大麻素系统失调。
例如，已经显示，使用CB1受体激动剂活化内源性大麻素系统可以诱导食管暂时松弛，从而治疗胃食管反流(Beaumont等人，2009；Lehman等人，2002)，并且还可以改善与肠疾病(如肠易激综合征或胃溃疡)有关的症状，同时尤其作用于胃肠动力和炎症(Izzo等人，2001；Izzo等人，1999；Massa等人，2004)。
已经显示，使用拮抗CB1受体的作用的化合物(如利莫那班)有效治疗肥胖症和代谢综合征，其不仅通过在中枢神经系统作用于食物摄取，而且通过在外周神经系统作用于高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高血糖症和血脂异常，从而也能够降低相关的心血管风险(Ravinet Trillou C.等人，2003；Tam等人，2010；Tam等人，2012)。
在糖尿病及其并发症(肾病、肾小管病)(Jourdan等人，2014)，和纤维化的发生，特别是肝纤维化和肾纤维化(Teixeira-Clerc等人，2006)的情况下，也已经观察到针对CB1受体的拮抗作用的有益作用。
因此，大麻素受体(特别是CB1受体)的激动剂和拮抗剂对于涉及内源性大麻素系统失调的疾病具有重大的治疗意义。
然而，当长期使用这些分子，特别是当它们穿过血脑屏障时，观察到了显著的副作用。在这些分子当中，最初旨在治疗肥胖症的利莫那班，由于其对中枢CB1受体的作用而引起的抑制性精神病作用，不得不在2008年退出市场。
因此，需要开发新的CB1受体抑制剂，其在中枢神经系统中几乎不扩散或完全不扩散，以限制或甚至完全消除这些有害的精神作用。
本发明旨在使用作用于外周CB1受体的新化合物来满足这种需要。
事实上，本发明人已经令人惊讶地发现，化合物1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及其结构类似物具有物理化学特征，使其具有诱导对外周CB1受体的优先反向激动剂活性的药代动力学特性。下文公开的实验数据进一步显示，这些分子不仅对肥胖小鼠的糖类和脂类代谢、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性和体重发挥有益作用，而且对胃肠蠕动发挥有益作用，并且其没有肝毒性。因此，这些新的化合物为新的治疗策略开辟了道路，所述治疗策略不仅用于肥胖症相关的代谢紊乱和胃肠运动功能缺陷，而且也用于与优先涉及CB1受体的内源性大麻素系统活动过度有关的所有疾病。
因此，本发明提出如下所定义的涉及1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-邻苯二甲酰氮杂环丁烷-2-酮及其衍生物的式(I)的外周CB1受体的选择性反向激动剂，其合成方法及其应用尤其是治疗应用和非治疗应用。
发明内容
因此，本发明首先涉及以下通式(I)的化合物：
Figure BDA0001642003000000031
其中：
●R1和R2可以相同或不同，表示氢原子或COR3、SO2R4或CONR5R6基团；或者与携带它们的氮原子一起形成5或6元杂环，所述杂环包含至少一种另外的杂原子、C＝O基团、芳基或杂芳基；
●R3、R4、R5和R6独立地表示氢原子或芳基或杂芳基，所述基团任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)、氧代(＝O)和CF3的一种或多种基团取代；和
●R7至R26独立地表示氢原子或(C1–C6)烷基、芳基或芳基–(C1–C6)烷基，或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物。
通式(I)化合物的立体异构体也构成本发明的一部分，尤其是反式非对映异构体，以及它们的混合物。
在本发明的含义内，“立体异构体”是指几何异构体(或构型异构体)或光学异构体。
几何异构体因双键或环上的取代基的不同位置而产生，因此其可以具有Z或E构型，也被称为顺式或反式。
光学异构体特别地因包含四个不同取代基的碳原子上的取代基在空间中的不同位置而产生。因此，该碳原子构成手性或不对称中心。光学异构体包括非对映异构体和对映异构体。彼此互为镜像但不可重叠的光学异构体被称为“对映异构体”。彼此不为可重叠的镜像的光学异构体被称为“非对映异构体”。
含有等量的两种相反手性的单独对映异构体形式的混合物被称为“外消旋混合物”。
通式(I)化合物的互变异构体也构成本发明的一部分。
在本发明的含义内，“互变异构体”是指通过质子转移(即，通过氢原子的迁移和双键位置的变化)而获得的化合物的构形异构体。通常，化合物的不同的互变异构体可互相转化，并且在溶液中呈平衡状态，其比例可根据所用的溶剂、温度或pH而变化。
在本发明中，“药学上可接受的”旨在表示其用于制备通常安全、无毒且无生物学上或其他方面不期望的药物组合物，其对于兽医及人类药物用途是可接受的。
化合物的“药学上可接受的盐”是指如本文所定义的药学上可接受的盐，并且其具有母化合物的期望的药理学活性。
药学上可接受的盐特别地包括：
(1)与药学上可接受的无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的药学上可接受的酸加成盐；或者与药学上可接受的有机酸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘甲酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、2-萘磺酸、丙酸、水杨酸、琥珀酸、二苯甲酰-L-酒石酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸、三氟乙酸等形成的药学上可接受的酸加成盐，和
(2)当存在于母化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代时形成的药学上可接受的碱加成盐；或者与药学上可接受的有机碱如二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、氨丁三醇等配位形成的药学上可接受的碱加成盐；或者与药学上可接受的无机碱如氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等形成的药学上可接受的碱加成盐。
当化合物包含酸官能团时，其可以为钠盐。
可以根据常规的化学方法，由含有碱性或酸性部分的本发明的化合物与相应的酸或碱合成这些盐。
本发明化合物的药学上可接受的溶剂化物包括常规的溶剂化物，如由于溶剂的存在而在本发明化合物的最后制备步骤期间形成的那些。举例来说，可以提及由于水(水合物)或乙醇的存在而形成的溶剂化物。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
在本发明的含义内，“(C1–C6)烷基”基团是指包含1至6个，尤其是1至4个碳原子的直链或支链饱和烃链。举例来说，可以提及以下基团：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。
在本发明的含义内，“芳基”是指优选包含6至10个碳原子，并且包含一个或多个稠合环的芳香族烃基，例如苯基或萘基。有利地，其为苯基。
在本发明的含义内，“芳基–(C1–C6)烷基”是指经由如上所定义的(C1–C6)烷基链与分子的其余部分连接的如上所定义的芳基。举例来说，可以提及苄基。
在本发明的含义内，“杂芳基”是指如上所定义的芳基，其中1至4个，特别是1或2个碳原子彼此独立地被选自N、O和S的杂原子替代。
根据本发明的一个特别的实施方案，R1和R2与携带它们的氮原子一起形成5或6元杂环，所述杂环包含至少一种，优选一种或两种另外的杂原子(尤其是一个或两个氮原子(N))、C＝O基团、芳基(尤其是苯基或杂芳基，尤其是吡啶)。
优选地，R1和R2与携带它们的氮原子一起形成下式(II)或(III)的杂环：
Figure BDA0001642003000000051
其中R27表示氢原子或COR3或SO2R4基团，R3和R4如权利要求1中所定义，特别地R27表示氢原子。
根据本发明的另一个特别的实施方案：
●R1和R2可以相同或不同，表示氢原子或COR3、SO2R4或CONR5R6基团；和
●R3、R4、R5和R6独立地表示氢原子或芳基，优选苯基或杂芳基，如吡啶，所述基团任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3的一种或多种基团取代，有利地被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、OCOR15、CO2R20、OCO2R23、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3的一种或多种基团取代，有利地被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SO2R12和CF3的一种或多种基团取代；R7至R26如上所定义。优选地：
●R1和R2可以相同或不同，表示氢原子或COR3、SO2R4或CONR5R6基团；
●R3、R4和R5独立地表示芳基，优选苯基，其任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、OCOR15、CO2R20、OCO2R23、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SO2R12和CF3的基团取代，R7至R26如上所定义；和
●R6表示氢原子。
优选地，R1为氢原子，并且R2表示COR3、SO2R4或CONR5R6基团，其中R3、R4、R5和R6如上所定义。
根据本发明的另一个优选的实施方案，R1为氢原子，且R2表示COR3基团，R3为芳基，优选苯基，其任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、OCOR15、CO2R20、OCO2R23、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SO2R12和CF3，有利地卤素原子、SO2CH3和CF3的基团取代，R7至R26如上所定义。
根据本发明的另一个特别的实施方案，R1为氢原子，且R2表示SO2R4基团，R4为芳基，优选苯基，其任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、OCOR15、CO2R20、OCO2R23、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SO2R12和CF3，有利地卤素原子、SO2CH3和CF3的基团取代，R7至R26如上所定义。
根据本发明的另一个特别的实施方案，R1为氢原子，且R2表示CONR5R6基团，R6为氢原子，且R5为芳基，优选苯基，其任选被选自卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、SO2NR13R14、OCOR15、NR16COR17、NR18C(O)OR19、CO2R20、CONR21R22、OCO2R23、OCONR24R25、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SR10、S(O)R11、SO2R12、OCOR15、CO2R20、OCO2R23、COR26、硝基(NO2)、氰基(CN)和CF3，有利地卤素原子、OR7、NR8R9、SO2R12和CF3，有利地卤素原子、SO2CH3和CF3的基团取代，R7至R26如上面所定义。
本发明的化合物可以更优选地选自下文所描述的化合物IA至IF及其药学上可接受的盐和/或溶剂化物：
Figure BDA0001642003000000061
Figure BDA0001642003000000071
其中X表示氢原子、卤素或CF3。
根据本发明的一个更特别优选的实施方案，根据本发明的式(I)化合物为式(IA)化合物：
Figure BDA0001642003000000072
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物。
本发明还涉及一种用于制备根据本发明的式(I)化合物的方法。
用于制备根据本发明的式(I)化合物的方法包括以下步骤：
(i)将4-甲硫基苯甲醛与4-甲硫基苯胺缩合，以获得下式(IV)的化合物：
Figure BDA0001642003000000073
(ii)将所得的式(IV)化合物与下式(V)的烯酮进行施陶丁格环加成：
Figure BDA0001642003000000074
以获得下式(IA)的化合物：
Figure BDA0001642003000000081
(iii)任选地，优选通过甲基肼的作用，将式(IA)化合物的邻苯二甲酰化的胺官能团脱保护，以获得下式(IF)的化合物：
Figure BDA0001642003000000082
然后，任选地，将由此得到的式(IF)化合物与式R1-X和/或R2-X'的化合物偶联，其中R1-X和R2-X'为活化形式，如上所定义的基团R1和R2的酰氯、磺酰氯和芳基异氰酸酯；和
(iv)收集在步骤(ii)或步骤(iii)中获得的化合物。
作为步骤(ii)中的酰氯的示例，根据一个特别的实施方案，可以使用邻苯二甲酰基甘氨酰氯。
根据一个优选的实施方案，本发明的方法涉及对应于式(I)化合物的式(IA)化合物的制备：
Figure BDA0001642003000000083
其中R1和R2与携带它们的氮原子一起形成式(II)的杂环。
该方法包括以下步骤：
(i)将4-甲硫基苯甲醛与4-甲硫基苯胺缩合，以获得下式(IV)的化合物：
Figure BDA0001642003000000091
(ii)将在步骤(i)中获得的式(IV)化合物与下式(V)的烯酮进行施陶丁格环加成：
Figure BDA0001642003000000092
然后收集式(IA)的化合物。
缩合反应(分子间脱水)将有利地在溶剂(如甲苯)和在反应期间产生的干燥剂(如无水硫酸钠)的存在下进行。
施陶丁格环加成(也被称为烯酮-亚胺[2+2]环加成)是本领域技术人员已知的化学反应。可以在二氯乙烷(DCE)中，在室温且在惰性气氛下，如在氮气或在氩气下，优选在氮气下进行该反应。
通过碱(如三乙胺(TEA))在邻苯二甲酰甘氨酸的酰氯上的作用，可以有利地原位产生烯酮(V)。可以通过本领域技术人员已知的方法，尤其是在外部通过亚硫酰氯对市售的N-邻苯二甲酰甘氨酸的作用，或者直接在反应混合物中，在质子受体(如三乙胺)的存在下利用偶联剂(如苯基二氯磷酸酯)获得该酰氯。
在下面的方案1中更详细地阐明了该过程。
Figure BDA0001642003000000093
方案1
因此，该方法能够获得化合物(IA)，其可以用作其他式(I)化合物的制备方法中的起始试剂。
本发明还涉及一种用于制备式(I)化合物的方法，其使用式(IA)化合物作为起始物，并且其包括以下步骤：
(i)将4-甲硫基苯甲醛与4-甲硫基苯胺缩合，以获得式(IV)的化合物；
(ii)将在步骤(i)中获得的式(IV)化合物与式(V)的烯酮进行施陶丁格环加成；
(iii)优选通过甲基肼的作用，将在步骤(ii)中获得的式(IA)化合物的邻苯二甲酰化的胺官能团脱保护，以获得下式(IF)的化合物：
Figure BDA0001642003000000101
然后，任选地，将由此得到的式(IF)化合物与式R1-X和/或R2-X'的化合物偶联，其中R1-X和R2-X'为活化形式，如上所定义的基团R1和R2的酰基氯、磺酰氯和芳基异氰酸酯；和
(iv)收集在步骤(iii)中获得的化合物。
作为步骤(ii)中的酰氯的示例，根据一个特别的实施方案，可以使用邻苯二甲酰基甘氨酰氯。
根据一个特别的实施方案，使用式(IA)化合物作为起始物的用于制备式(I)化合物的方法可以包括以下步骤：
(i)将4-甲硫基苯甲醛与4-甲硫基苯胺缩合，以获得式(IV)的化合物；
(ii)在质子受体(如三乙胺)的存在下利用偶联剂(如苯基二氯磷酸酯)，将在步骤(i)中获得的式(IV)化合物与原位获得的式(V)的烯酮进行施陶丁格环加成；
(iii)优选通过甲基肼的作用，将在步骤(ii)中获得的式(IA)化合物的邻苯二甲酰化的胺官能团脱保护，以获得式(IF)的化合物，然后，任选地，在质子受体(如三乙胺)的存在下利用偶联剂(如苯基二氯磷酸酯)，将由此获得的式(IF)的化合物与N-邻苯二甲酰甘氨酸偶联，以获得式(IG)的衍生物
Figure BDA0001642003000000111
和
(iv)收集在步骤(ii)或步骤(iii)中获得的化合物。
因此，本发明的另一个方面涉及一种式(IG)的化合物(IA)的衍生物/类似物：
Figure BDA0001642003000000112
或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物。
化合物(IA)的邻苯二甲酰化的胺官能团的脱保护反应是本领域技术人员熟知的典型反应。该脱保护将有利地优选在二氯甲烷中，通过水合肼或甲基肼(优选甲基肼)对化合物(IA)的作用来进行。该反应能够获得对应于式(I)化合物的化合物(IF)，其中R1和R2各自表示氢原子。
根据一个特别的实施方案，直接收集化合物(IF)，而不发生偶联反应。
根据另一个特别的实施方案，化合物(IF)随后在方法中被用作合成中间体，以制备化合物(IA)以外的式(I)的化合物。
因此，本发明还涉及作为化合物(IA)以外的式(I)的化合物的合成中间体的化合物(IF)。
可以在本领域技术人员熟知的实验条件下，有利地在室温，在溶剂(如二氯乙烷)和碱(如三乙胺(TEA))的存在下进行偶联反应。
在本发明的含义内，化学基团的“活化形式”是指所述化学基团被修饰，从而使其对亲核试剂更具活性。这些活化形式是本领域技术人员熟知的，并且其可以特别地为酰氯、磺酰氯或芳基异氰酸酯。作为酰氯的示例，可以特别地使用邻苯二甲酰基甘氨酰氯。
如果需要，可以通过文献中描述的，本领域技术人员已知的或在实验部分中例举的任何标准操作，尤其是通过额外的官能化、环化和/或保护/脱保护反应，来补充如上描述的方法。
为了获得式(I)化合物的药学上可接受的盐和/或溶剂化物，可以在这两种方法结束时进行一个或多个额外的成盐和/或溶剂化步骤。
可以在本领域技术人员熟知的条件下，在药学上可接受的酸或碱的存在下进行成盐步骤。
当式(I)化合物处于溶剂化形式时，这种溶剂化通常在方法的最后步骤中进行，在这种情况下，溶剂化形式的溶剂为反应混合物的溶剂。
可以通过本领域技术人员熟知的方法，例如通过萃取、溶剂蒸发或通过沉淀和过滤，将通过以上提及的这两种方法之一获得的式(I)化合物从反应混合物中分离。
此外，如果需要，可以通过本领域技术人员熟知的技术，如通过重结晶(如果化合物是晶体)、通过蒸馏、通过硅胶柱色谱法或通过高效液相色谱(HPLC)，将式(I)化合物纯化。
本发明人已经证明了本发明化合物对外周内源性大麻素CB1受体的反向激动剂活性，和它们在治疗或预防与内源性大麻素系统的活动过度有关的疾病的重要性。
因此，本发明的另一个方面涉及至少一种如上所定义的式(I)化合物作为外周内源性大麻素CB1受体的反向激动剂，优选作为所述受体的选择性反向激动剂的体外用途。换言之，本发明涉及至少一种式(I)化合物降低或抑制外周内源性大麻素CB1受体的活性的用途，优选以选择性的方式降低或抑制外周内源性大麻素CB1受体的活性的用途。
如本文所使用，“反向激动剂”是指一种化合物，其与该受体的天然激动剂的同一受体相互作用，但产生相反的药理学作用，并降低或抑制所述受体的活性，特别是其基础活性。反向激动剂能够结合与天然激动剂不同的结合位点，导致受体的构象变化，从而阻止天然激动剂的结合。在本发明的上下文中，天然激动剂为内源性大麻素。
如本文所使用，“选择性反向激动剂”是指一种如上所定义的反向激动剂，其优先结合单一受体类型，而不影响或最小程度地影响其他受体，特别是相关的受体。在本发明的上下文中，根据本发明的式(I)化合物为选择性作用于内源性大麻素CB1受体的反向激动剂，即优先结合所述受体，但完全不结合或非常弱地结合内源性大麻素CB2受体。
如本文所使用，表述“内源性大麻素CB1受体”或“CB1受体”是指具有七个跨膜结构域的G-蛋白偶联受体特别是百日咳毒素敏感的Gi/0偶联受体及Gq-和Gs-蛋白偶联受体，其能够与内源性和外源性大麻素相互作用，从而能够主要作用于腺苷酸环化酶的三种细胞内信号传导通路中的至少一种，促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路和某些离子通道。因此，可以通过在将细胞与所述受体的已知激动剂(如花生四烯酸乙醇胺(AEA))接触后，测量例如cAMP浓度，来在体外评价CB1受体活性，在该内源性大麻素与受体结合后该浓度降低；在下文描述的实施例中描述了这种测试。在人中，内源性大麻素CB1受体由Cnr1基因编码，其位于6号染色体6q14-q15处(Hoehe等人，1991)，并以两种同种型呈现：CB1，其为主要的，其具有472个氨基酸的生理活性同种型；和CB1A，其为一种较短的同种型(411个氨基酸)，其表达远远低于CB1(1/10至1/100，取决于组织表达位点)(Rinaldi-Carmona等人，1996)。迄今为止，也已经在大鼠、小鼠、猫、鸟类、两栖动物和鱼类中鉴定出CB1受体，并且在脊椎动物中其蛋白质序列高度保守。
术语“外周内源性大麻素CB1受体”是指如上所定义的CB1受体，其不位于脑中(即，在中枢神经系统)。因此，在本文中使用的该术语与所谓的中枢CB1受体相反，其包括但不限于在脂肪组织、肝脏、肾脏、胃肠系统、膀胱、骨骼肌、心血管组织、睾丸、子宫、免疫系统、胰腺、视网膜细胞、内皮细胞、肾上腺、肺等中表达的CB1受体。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种根据本发明的式(I)化合物，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
如本文所使用，表述“药学上可接受的赋形剂”是指药学级化合物，其增强活性剂的递送、稳定性或生物利用度，并且其可以被代谢，且对施用了其的受试者是无毒的。根据本发明的优选的赋形剂包含在药物产品中通常使用的任何一种赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、淀粉和大豆粉末。
所述式(I)的化合物优选以足以抑制外周CB1受体活性的量存在于根据本发明的组合物中，更特别是在预防性或治疗性治疗与内源性大麻素系统的活动过度有关的疾病的情况下。特别相关的疾病在下文中描述。
优选地，本发明的组合物包含组合物的0.01wt％至10wt％，优选0.02wt％至5wt％，更优选0.05至1wt％的一种或多种根据本发明的式(I)化合物。
根据本发明的组合物可以为在本发明的上下文中可接受的任何药物形式。例如，组合物可以为适合于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、局部、本位(local)、气管内、鼻内、透皮或直肠施用的形式。药物组合物的最优选形式为经由口服途径和固体，优选胶囊或片剂形式。
根据本发明的组合物可以进一步包含一种或多种治疗剂，例如用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的治疗剂。本领域技术人员可以根据待预防或治疗的疾病，容易地确定可以与本发明的式(I)化合物组合的治疗剂。作为说明，当待预防或治疗的疾病为糖尿病及其并发症和/或与肥胖相关的代谢疾病时，所述试剂可以选自降血脂剂、降胆固醇剂、抗糖尿病剂和/或抗肥胖剂。根据本发明的降血脂剂和降胆固醇剂包括但不限于贝特类，如阿拉贝特、贝罗贝特、苯扎贝特、环丙贝特、克利贝特、安妥明、依托贝特、非诺贝特；他汀类(HMG-CoA还原酶抑制剂)，如阿托伐他汀、氟伐他汀钠、洛伐他汀、普伐他汀、罗素伐他汀、辛伐他汀，或者化合物，如阿奇霉素、烟酸铝、阿扎胆醇、考来烯胺、右旋甲状腺素、美格鲁托、烟酸戊四醇酯、尼克氯酯、尼克酸、β-谷甾醇和硫地醇。根据本发明的抗糖尿病剂包括但不限于磺酰脲类、双胍类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、美格列奈类如阿卡波糖、乙酰己酰胺、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列本脲、格列波脲、格列齐特、格列美脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列丁唑、格列嘧啶、美他己脲、二甲双胍、米格列醇、那格列奈、吡格列酮、瑞格列奈、罗格列酮、妥拉磺脲、甲苯磺丁脲和伏格列波糖。
如上所述的治疗剂还可以与根据本发明的式(I)化合物同时、分开或顺序组合施用。因此，当分开或顺序施用根据本发明的化合物和治疗剂时，可以以不同的药物形式施用它们。
因此，本发明的另一个方面涉及作为组合制剂用于同时、分开或顺序施用的根据本发明的式(I)化合物和如上所述的治疗剂。换言之，本发明涉及根据本发明的式(I)化合物和如上所述的治疗剂用于同时、分开或顺序施用的组合用途。
本发明还涉及如上所定义的式(I)化合物或药物组合物，其作为医药产品的用途。换言之，本发明涉及所述式(I)化合物或所述药物组合物作为医药产品的用途。
本发明更特别地涉及如上所定义的式(I)化合物或药物组合物，其用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的用途。换言之，本发明涉及所述式(I)化合物或所述药物组合物制备用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的药物产品的用途。更准确地，本发明涉及一种用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度有关的疾病的方法，其包括将有效量的根据本发明的式(I)化合物或组合物施用至需要其的受试者的步骤。
如本文所使用，术语“预防”(或“以预防”)和“治疗”(或“以治疗”)通常是指根据症状或感兴趣的疾病的严重程度，获得所期望的生理学或药理学作用。对于部分或完全预防症状或疾病来说，作用可以是预防性的(“预防”)，或者对于部分或完全缓解症状或疾病来说，作用可以是治疗性的(“治疗”)。术语“预防”包括在发病前避免或延迟症状或疾病发作或发展的能力。反过来，术语“治疗”包括抑制症状或疾病(即，停止其发展)，并且缓解症状或疾病(即，带来改善的消退)。在本发明的上下文中，预防旨在避免或延迟内源性大麻素系统的活动过度的发作，而治疗旨在使所述活动过度停止和/或消退。应理解，在本文中，所述治疗或所述预防优选涉及具有内源性系统大麻素的受试者，即人和动物。
本领域技术人员可以容易地确定施用至患有内源性大麻素系统活动过度的受试者的式(I)化合物的有效量。典型地，活性剂的治疗有效量为约10mg每天至约1000mg每天，优选10mg至100mg每天。
如本文所使用，表述“内源性大麻素系统的活动过度”是指内源性大麻素系统的失调，其在受影响的受试者中表现为内源性大麻素CB1和/或CB2受体的过表达和/或过度活动，和/或代谢内源性大麻素的酶的过表达和/或过度活动，和/或在内源性大麻素的合成通路失调后异常高水平的内源性大麻素(例如2AG和/或花生四烯酸乙醇胺)。在本发明的上下文中，所述活动过度优选由CB1受体介导，并且更特别地涉及外周CB1受体(与CB2受体结合或不结合)。因此，这种活动过度优先存在于表达外周CB1受体的组织中。本领域技术人员能够确定与内源性大麻素系统活动过度有关的疾病，优选由CB1受体介导的疾病。
优选地，所述疾病选自肥胖症和与肥胖症相关的代谢疾病(Di Marzo等人，2005；Blüher等人，2006；
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等人，2007)；胰岛素抵抗(Song等人，2011；Eckardt等人，2009)，优选与肥胖症相关的代谢疾病；糖尿病，优选II型糖尿病和相关并发症(Matias等人，2006；Jensen，2006)；酒精性或非酒精性肝脂肪变性(Osei-Hyiamann等人，2005；Osei-Hyiaman等人，2008；Jeong等人，2008)；肝纤维化(Teixeira-Clerc等人，2006)；肝硬化；肾纤维化(Lecru等人，2015)；肾病(Jourdan等人，2012)；心肌病(Montecucco和Di Marzo，2012；Rajesh等人，2012；Slavic等人，2013；Schaich等人，2014；Pacher和Kunos，2013)；胃轻瘫(Izzo和Sharkey，2010)；骨和/或软骨丢失，例如与骨质疏松症或牙周炎相关的骨和/或软骨丢失(Tam等人，2008)；肌肉损失，例如创伤后的肌肉损失，或自然的(年龄相关的)肌肉损失或由于遗传的肌肉损失，如肌肉萎缩症(例如杜兴氏肌营养不良等)(Iannotti等人，2014)；和生育问题，例如与低精子运动性和/或活力有关的或者与有缺陷的卵母细胞植入有关的生育问题(Amoako等人，2014)。
进一步优选地，所述疾病选自肥胖症和与肥胖症相关的代谢疾病，和胃轻瘫。更优选地，所述疾病选自与肥胖症相关的代谢疾病，和胃轻瘫。
在与肥胖症相关的代谢疾病当中，可以提及但不限于胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、血脂异常(如高甘油三酯血症和高胆固醇血症)、前驱糖尿病和肝脂肪变性。
在与糖尿病相关的并发症当中，可以提及但不限于眼病，如糖尿病性视网膜病、眼水肿和青光眼，其可以导致视力丧失；肾病，如肾衰竭、糖尿病性肾病和糖尿病性肾小球病；血管病变，如微血管病变和大血管病变、外周冠状病和动脉病；肝脂肪变性；心血管疾病；勃起功能障碍；糖尿病性胃轻瘫；神经疾病，如糖尿病性神经病、自主外周神经病和心脏神经病。
优选地，用于肥胖症和/或用于肥胖症相关代谢疾病的治疗可以与如上所描述的抗肥胖剂、降血脂剂、降胆固醇剂或抗糖尿病剂和/或用于减少热量摄入的饮食(特别是平衡的正常热量饮食)组合，从而促进体重减轻，同时改善胰岛素敏感性、葡萄糖耐受性和由根据本发明的式(I)化合物介导的脂血症。
如本文所使用，表述“平衡的正常热量饮食”是指一种饮食，其组成满足ANSES推荐的碳水化合物/脂质/蛋白质比例(分别为50-55％/35-40％/10-30％)。因此，本领域技术人员将能够根据受试者的性别、体重、身高、年龄和/或健康状况，来调整用于待治疗的受试者的平衡的正常热量饮食。
因此，根据本发明的一个优选的实施方案，特别是用于预防和/或治疗肥胖症和/或肥胖症相关的代谢疾病，使受试者接受平衡的正常热量饮食。
进一步优选地，所述受试者接受所述平衡的正常热量饮食，同时施用根据本发明的式(I)化合物或药物组合物。
根据另一个优选的实施方案，在受试者进餐前和/或期间进行根据本发明的式(I)化合物或药物组合物的施用。该实施方案可以任选地与如上所描述的平衡的正常热量饮食组合。如本文所使用，表述“进餐前”是指在进餐前最多30分钟，优选在进餐前最多15分钟，更优选刚好在进餐前进行根据本发明的式(I)化合物或药物组合物的施用。
根据下面显示的实验数据，本领域技术人员将容易地理解，根据本发明的式(I)化合物也可以用于独特的美学目的，尤其是促进体重减轻。
因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的式(I)化合物在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的非治疗性用途。
换言之，本发明涉及一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明化合物的步骤。
本文所涉及的用途不具有治疗(次要)作用，即，其并非用于预防或治疗疾病或其症状之一的用途，而仅是用于改善人的美学外观的用途。因此，应用本非治疗性方法的受试者优选为没有患内源性大麻素系统活动过度(如肥胖症)的受试者，和/或健康的受试者(即，健康的个体)。根据一个特别的实施方案，受试者相对于其身高可以是超重的，但是不肥胖。
在该用途的情况下，本领域技术人员可以容易地确定施用于受试者的式(I)化合物的有效量。典型地，有效量为10mg每天至约1000mg每天，优选10mg至100mg每天。
根据一个优选的实施方案，所述受试者接受平衡的正常热量饮食。
优选地，所述受试者接受所述平衡的正常热量饮食，同时施用根据本发明的式(I)化合物。
根据另一个优选的实施方案，在受试者进餐前和/或期间进行式(I)化合物的施用。该实施方案可以任选地与如上所描述的平衡的正常热量饮食组合。
本发明的化合物还可以被用在旨在支持纤体的组合物中。
因此，根据另一个方面，本发明涉及一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性组合物，所述组合物包含至少一种根据本发明的化合物和至少一种可接受的赋形剂。
更准确地，本发明涉及所述组合物在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的非治疗性用途。
换言之，本发明涉及一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述组合物的步骤。
所述式(I)化合物优选以足以促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的量存在于该组合物中。
优选地，所述组合物包含组合物的0.01wt％至10wt％，优选0.02wt％至5wt％，更优选0.05至1wt％的一种或多种根据本发明的式(I)化合物。
所述组合物可以为对于如本文所描述的非治疗性用途可接受的任何形式。例如，所述组合物可以为适用于口服、舌下、局部或本位施用等的形式。所述组合物的最优选形式适用于口服施用。
根据本发明的非治疗性组合物可以为粉末剂、胶囊、锭剂、片剂、丸剂、饮料、溶液剂、浓缩剂、糖浆、混悬剂、液体小瓶或分散剂的形式，和其他类似的形式。优选地，根据本发明的食品组合物为片剂、粉末剂、胶囊、丸剂和/或饮料的形式。
如本文所使用，“可接受的赋形剂”是指一种化合物，其能够增强组合物(在本文中为非治疗性的)的递送、稳定性或生物利用度，并且其可以被代谢，且对施用了其的受试者是无毒的。根据本发明的优选的赋形剂包含在美学、化妆品或膳食产品中通常使用的任何一种赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、淀粉和大豆粉末。
根据一个优选的实施方案，所述非治疗性组合物进一步包含至少一种能够促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的试剂。所述试剂(其可以在本文中被描述为纤体剂)可以为如上所描述的那些抗肥胖剂、降血脂剂、降胆固醇剂或抗糖尿病剂。
本发明的另一个方面涉及本发明的纤体组合物在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的非治疗性用途。
换言之，本发明涉及一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述组合物的步骤。
根据一个优选的实施方案，所述受试者接受平衡的正常热量饮食。
优选地，所述受试者接受所述平衡的正常热量饮食，同时施用根据本发明的非治疗性组合物。
根据另一个优选的实施方案，在受试者进餐前和/或期间进行非治疗性组合物的施用。该实施方案可以任选地与如上所描述的平衡的正常热量饮食组合。
本发明的化合物还可以与纤体剂和/或纤体饮食同时、分开或顺序组合施用。所述试剂可以为抗肥胖剂、降血脂剂、降胆固醇剂或抗糖尿病剂，而饮食可以为低热量和/或低脂饮食。
因此，当分开或顺序施用根据本发明的化合物和纤体剂时，可以以不同的形式施用它们。
因此，本发明的另一个方面涉及作为组合制剂用于同时、分开或顺序施用的根据本发明的式(I)化合物和如上所描述的能够促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的试剂。换言之，本发明涉及根据本发明的式(I)化合物和如上所描述的能够促进和/或加速体重减轻，或者减缓和/或减少体重增加的试剂用于同时、分开或顺序施用的组合用途。
本发明的另一个目的为一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的式(I)化合物，并同时、分开或顺序地使所述受试者接受平衡的正常热量饮食。
本发明的另一个目的为一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据本发明的式(I)化合物和如上所描述的纤体化合物，并同时、分开或顺序地使所述受试者接受平衡的正常热量饮食。
以下通过非限制性实施例阐明本发明。
附图说明
图1用分子JM-00.246、JM-02.003、JM-01.1006、JM-00.266或JM-00.242处理21h的ob/ob小鼠的肝外植体中CB1受体的表达。
图2通过质粒pcDNA3.1-mCB1(50ng)和pGlo(100ng)转染，并且在存在或不存在AEA的情况下经受渐增浓度的JM-02.003(图2A)、M-01.1006(图2B)和JM-00.266(图2C)的HEK293T/17细胞中的AMPc变化。
图3在野生型(分别为图3A和图3B)或CB1R KO小鼠(分别为图3C和图3D)中，腹膜内注射10mg/kg JM-02.003(M2)或JM-00.266(M6)对葡萄糖耐量的作用。
图4在野生型小鼠中，腹膜内注射10mg/kg载体或JM-00.266(M6)对OGTT期间的血浆胰岛素浓度(图4A)和胰岛素耐受性(ITT；图4B)的作用。
图5在野生型小鼠中，腹膜内注射10mg/kg载体、花生四烯酸乙醇胺(AEA)或AEA+JM-00.266(M6)对胃肠道转运的作用。
图6通过旷场测试确定的，肥胖小鼠中，用SR141716(即利莫那班)、化合物JM-00.266(M6)或载体30天长期处理，对焦虑和运动行为的作用；6A：在中心消耗的时间(以秒计)；6B：进入中心的次数；6C：总行程(以cm计)。
图7与SR141716(利莫那班)和载体相比，在用化合物JM-00.266(M6)30天长期处理期间食物摄入量(7A)和体重(7B)的变化。(7C)在处理前(D0)和处理结束时(D30)，身体组成(EchoMRI)的变化。
图8用10mg/kg SR141716(利莫那班)或JM-00.266(M6)的长期处理对肥胖小鼠的基础血糖(8A)和葡萄糖耐量(OGTT 2g/kg)(8B：用利莫那班和8C：用M6)的作用。
图9用10mg/kg SR141716(利莫那班)(9A)或JM-00.266(M6)(9B)的长期处理对肥胖小鼠的胰岛素耐量(ITT)的作用。
图10与接受低脂(LF)饮食条件下的载体(VEH+LF)或高脂(HF)条件下的载体(VEH+HF)相比，接受低脂饮食并用化合物JM-00.266(M6)处理43天(M6+LF)的肥胖小鼠的体重变化。
图11与载体(VEH+LF)相比，用化合物JM-00.266(M6)进行的43天处理(M6+LF)对接受低脂饮食的肥胖小鼠的葡萄糖耐量的作用。
图12与载体相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用(10mg/kg)处理28天的肥胖小鼠的体重变化。
图13与载体相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天对肥胖小鼠的葡萄糖耐量的作用。
图14与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠肝脏中的受体CB1R、CB2R、内源性大麻素合成酶(NAPE)、内源性大麻素降解酶(FAAH)、脂肪酸合成酶(FAS)的表达。
图15与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠肝脏中的硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)、酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)、成熟巨噬细胞标记物F4/80和葡萄糖转运蛋白GLUT2的表达。
图16与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠皮下脂肪组织中的受体CB1R、CB2R、内源性大麻素合成酶(NAPE)、内源性大麻素降解酶(FAAH)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的表达。
图17与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠皮下脂肪组织外植体中的葡萄糖转运蛋白GLUT4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和成熟巨噬细胞标记物F4/80的表达。
图18与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠内脏脂肪组织外植体中的受体CB1R、CB2R、内源性大麻素合成酶(NAPE)、内源性大麻素降解酶(FAAH)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖-6-磷酸酶的表达。
图19与载体(VEH)相比，用化合物JM-00.266(M6)与食物同时口服施用处理28天的肥胖小鼠内脏脂肪组织外植体中的葡萄糖转运蛋白GLUT4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和成熟巨噬细胞标记物F4/80的表达。
具体实施方式
实施例
I.根据本发明的化合物的合成
1.材料
利用Electrothermal IA9300装置测定熔点，其未经校正而报道。
用Bruker Avance 400光谱仪(400MHz)获得1H和13C RMN谱。以四甲基硅烷作为内标，以ppm表示化学位移(δ)。使用常规表示(s＝单峰、d＝双峰、t＝三重峰、q＝四重峰、sext＝六重峰、m＝多重峰和b＝宽峰)来描述光谱。以赫兹(Hz)表示偶合常数。
在Waters Acquity UPLC System ZaQ 2000单四极光谱仪上进行质谱(SM)分析。
在Perkin-Elmer Paragon FTIR 1000PC仪器上获得红外光谱。只显示特征吸收带；以cm-1表示波数值。
通过在硅胶60F-254(5735Merck)上的薄层色谱(CCM)，和在硅胶60(70-230目，ASTM，Merck)上的色谱纯化柱进行反应的监测。
所使用的所有试剂和溶剂都是市售产品。
2.4-甲硫基苄基-4-甲硫基苯基醛亚胺(IV)的合成
Figure BDA0001642003000000201
将5.57g(36.6mM)4-甲硫基苯甲醛和5.0g(35.92mM)4-甲硫基苯胺溶解于50mL甲苯中。搅拌下，加入3g无水硫酸钠，并加热使溶剂回流4小时。在结束时，用旋转蒸发仪在减压下去除溶剂。将收集的固体在10mL异丙基氧化物中研磨，并将获得的混悬液在烧结玻璃上过滤。由此收集到7.66g亚胺(产率＝78％)。
化学特征：
MP℃＝143–144(二异丙基氧化物)。
1H–RMN(CDCl3):δ2.51,s,3H,4–SCH3；:2.54,s,3H,4’–SCH3；7.18,d,2H,H3H5,J＝6.7Hz；7.29,d,2H,H2H6；7.30,d,2H,H3’H5’,J＝8.4Hz；7.80,d,2H,H2’H6’；8.41,s,1H,HC＝N.
SM(ESI)m/z(％):274[M+H]+
IR(KBr,cm–1):1552.53(νC＝N).
3.邻苯二甲酰甘氨酸的酰氯的合成
Figure BDA0001642003000000211
将2g(9.75mM)N-邻苯二甲酰甘氨酸溶解于20mL亚硫酰氯中，并回流3小时。在结束时，用旋转蒸发仪减压蒸发亚硫酰氯。将获得的产物溶解于50mL甲苯中三次，并且每次都在减压下进行蒸发。在第三次蒸发结束时，将获得的产物保持在真空下持续30分钟，然后再次溶解于20mL干燥二氯乙烷中，并这样储存直至使用。
4.反式-1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-N-邻苯二甲酰基-氮杂环丁烷-2-酮(化合物IA＝在下文中也被称为JM-00.266或M6)的合成
Figure BDA0001642003000000212
(IA，即，JM–00.266)
在250mL圆底烧瓶中，将2.73g(10.0mM)亚胺(IV)溶解于50mL干燥二氯甲烷中。加入5mL三乙胺，并将整体置于搅拌下。然后，缓慢引入邻苯二甲酰甘氨酸(9.75mM)的酰氯溶液，同时保持混合物的温度低于10℃。当添加完成时，允许混合物恢复至室温，并使其保持原样，同时通过CCM监测反应的进展。在3小时结束时，反应不再进行；将反应混合物倒入100mL水中，并用分液漏斗收集有机相。再用相同量的水洗涤所述有机相，然后用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发溶剂至干。然后，通过用二氯甲烷洗脱，在二氧化硅柱上色谱分离所得残余物，能够获得2.39g化合物(IA)(产率＝53％)。
化学特征：
MP℃＝118–120(乙醚)
1H–RMN(CDCl3):δ2.44,s,3H,CH 3；2.49,s,3H,CH 3；5.26,d,1H,Ha；5.33,d,1H,Hb(JHaHb＝2.4Hz)；7.18,d,2芳香.H,(J＝8.4Hz)；7.25–7.30,m,4芳香.H；7.78,m,2H,H4”–H5”；7.88,m,2H,H3”–H6”.
13C–RMN(100.6MHz,CDCl)16.45(CH3)；16.50(CH3)；60.99(Cb)；62.77(Ca)；118.15(2C)；123.85(C3”–C6”)；126.63(2C)；127.00(2C)；127.91(2C)；131.65(C2”–C7”)；132.10(C1)；134.14(C4–C1’)；134.61(C4”–C5”)；140.11(C4’)；161.75(C1”–C8”)；166.65(Cc).
SM(ESI)m/z(％):461.6[M+H]+
IR(KBr,cm–1):3064,νCH芳香；2974,2922,2835,νCH脂肪；1759,1714,νC＝O.
5.测试的其他化合物
Figure BDA0001642003000000221
Figure BDA0001642003000000231
6.用于反式-1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-N-邻苯二甲酰基-氮杂环丁烷-2-酮(化合物IA＝在下文中也被称为JM-00.266或M6)的可选合成途径
开发了用于化合物JM-00.266的另一种合成途径。其包括使亚胺(化合物IV)与N-邻苯二甲酰甘氨酸接触，并在作为质子受体的三乙胺的存在下，利用偶联剂苯基二氯磷酸酯原位生成乙烯酮。这种方法的优点是避免了使用亚硫酰氯，亚硫酰氯的处理和去除是棘手的。
根据一个程序，在搅拌下将1.38g亚胺(化合物IV)(5mM)溶解于20mL二氯甲烷中；加入3mL三乙胺，然后加入1.128g N-邻苯二甲酰甘氨酸。然后，向混合物中滴加1.5mL(2.11g，即10mM)苯基二氯磷酸酯，并将反应在室温下保持3h。在结束时，用水洗涤反应混合物，收集有机相，干燥并减压浓缩。通过用二氯甲烷洗脱，在硅胶柱上色谱分离所得的残余物。因此，以66％的产率收集到1.51g化合物IA(JM-00.266反式；反应混合物中不存在顺式异构体)。
7.以反式-1,4-二-(4-甲硫基苯基)-3-N-邻苯二甲酰基-氮杂环丁烷-2-酮(化合物IA＝在下文中也被称为JM-00.266或M6)为起始的胺官能团的脱保护
此外，进行化合物JM-00.266上的邻苯二甲酰化的胺官能团的脱保护。通过甲基肼在二氯甲烷中的反应成功地完成胺官能团的释放。
根据一个程序，将0.1mL(2.18mM)甲基肼加入到0.44g化合物IA JM-00.266(0.955mM)在20mL二氯甲烷(DCM)中的溶液中；首先在室温搅拌混合物，然后缓慢升高温度至DCM回流，同时通过CCM监测反应的进展。当反应完成时(4h)，用水洗涤反应混合物，然后干燥并通过蒸发浓缩至干。利用短柱(直径＝30mm，长度＝70mm)并通过用乙酸乙酯洗脱，在硅胶上色谱分离得到的残余物。因此，用优化的合成和纯化过程收集到221mg期望的胺(化合物1F，在下文中也被称为HR-0131反式)，产率为70至81％。
Figure BDA0001642003000000241
化合物HR-0131的物理化学特征：
经验式：C17H18N2S2O；分子量：330.47；F＝134℃(AcOEt).
IR(KBr,cm–1):3350–3061(νCH芳香)；2981–2835(νCH脂肪)；1728(vC＝O).
1H–RMN,δ(ppm),DMSO–d6:2.43,s,3H,SCH3(苯醛)；2.49,s,3H,SCH3(苯胺)；3.66,2H,NH 2；3.92,d,1H,(NCH内酰胺)；4.73,d,1H,(COCH内酰胺),J＝2.0Hz；7.18–7.34,m,8H芳香.
13C–RMN,δ(ppm),DMSO–d6:14.73；15.54；65.41；70.82；117.75；124.31；126.41；126.91；127.52；128.91；132.41；132.51；133.08；134.30；135.01；138.14；168.80.
SM(ESI)m/z(％):331[M+H]+
8.以胺HR-0131为起始的衍生物的合成
以前面制备的胺为起始，设想合成化合物JM-00266的优异的同源衍生物(HR-0133)。由邻苯二甲酰甘氨酸对HR-0131的缩合产生该衍生物，并且其表示一种结构，其中在内酰胺环和邻苯二甲酰基取代基之间引入了空间。
Figure BDA0001642003000000242
根据一个程序，将144mg(0.7mM)N-邻苯二甲酰甘氨酸和1mL三乙胺加入至183mg(0.55mM)HR-0131在15mL二氯甲烷中的溶液中。然后，滴加169mg(0.8mM)苯基二氯磷酸酯，并将混合物搅拌3h。在结束时，蒸发溶剂，并通过用乙醚洗脱在硅胶柱上色谱分离所得的残余物。获得61mg期望的产物(HR-0133反式)(产率＝21％，通过优化合成和纯化过程可以改进产率)。
化合物HR-0133的物理化学特征：
经验式：C27H23N3S2O4；分子量：517.63；F＝190–192℃(iPrOiPr).
IR(KBr,cm–1):3348(νCH芳香)；2998–2918(νCH脂肪)；1728,1693(vC＝O).
1H–RMN,δ(ppm),DMSO–d6:2.43,s,3H,SCH 3(苯醛)；2.49,s,3H,S CH 3(苯胺)；4.37,s,2H,CH 2；4.72,dd,1H,(COCH内酰胺),J＝2.4Hz,J＝7.6Hz；5.05,d,1H,(NCH内酰胺),J＝2.4Hz；7.18,d,2H,H2H6苯醛,J＝8.8Hz；7.23,d,2H,H3H5苯醛,J＝8.8Hz；7.29,d,2H,H3H5苯胺,J＝8.4Hz；7.40,d,2H,H2H6苯胺,J＝8.4Hz；7.90–7.98,m,4H,Ft芳香H,9.20,d,1H,NH,J＝7.6Hz.
13C–RMN,δ(ppm),DMSO–d6:14.62；15.39；40.33；61.49；65.08；117.86(2C)；123.44(2C)；126.34(2C)；127.35(2C)；127.39；131.88；133.09(2C)；133.19(2C)；134.40；134.80(2C)；141.00；163.98；166.98；167.59(2C).
SM(ESI)m/z(％):518[M+H]+.
II.所合成的化合物的生物活性
1.材料和方法
1.1.体外研究
1.1.1.肝脏外植体培养
在戊巴比妥钠麻醉下(50mg/kg)，用氧饱和的汉克介质(pH 7.4)原位灌注小鼠的肝脏。然后，在相同的介质中，使用Brendel/Vitron切片机(Tucson，AZ，美国)将肝脏切片。然后，在受控的气氛(5％CO2)中，将肝脏切片(约200μm)在充氧的威廉介质E(WME)中温育21h，所述威廉介质E补充有灭活的胎牛血清(10％)和抗生素/抗真菌混合物(1％)，向所述肝脏切片中加入待测试的拮抗剂或载体。
1.1.2.基因表达
用Tri Reagent(Euromedex，法国)进行总信使ARN(ARNm)的提取，并用Bio-RadiScripttm逆转录超级混合试剂盒(Bio-Rad，法国)由1μg ARNm进行互补ADN(ADNc)的连续合成。
通过半定量实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)评价基因表达。使用Primer3Plus软件(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)设计所使用的引物，并通过MWG-Biotech(TATA盒结合蛋白：正义acggcacaggacttactcca、反义gctgtctttgttgctcttccaa；CB1R：正义ccgcaaagatagtcccaatg、反义aaccccacccagtttgaac)合成所述引物。通过考虑每种PCR的功效，并在用报告基因TATA盒结合蛋白标准化后，获得基因表达的半定量。
1.1.3.GloSensor cAMP测试
将HEK293T/17(ATCC)细胞在DMEM 10％SVF中培养，然后以30000个细胞/孔接种于96孔板中。在24h后，通过含有或不含百日咳毒素(PTX)的pcDNA3.1-mCB1(50ng)和pGlo(100ng)质粒，通过FuGENE HD(Promega)使细胞接受瞬时转染。对于对照测试，用含有或不含PTX的空pcDNA3(VV)和pGlo载体转染细胞。在48h(转染后24h)，用含10％SVF的不依赖CO2的介质中的2％GloReagent(80μL/孔)将细胞负载2h。
然后，通过在t＝0时加入10μL/孔的终浓度1μM的毛喉素(FSK)来处理细胞，以增加基础AMPc浓度。监测AMPc出现的动力学持续10分钟。在t＝10时，加入待测试的分子，并测量AMPc变化持续20分钟。在RLU中测量光信号，并且其被表示为相对于在t＝10min时读取的信号的％响应(FSK 1μM)。通过在加入待测分子后t＝10min(因此总计t＝20min)时，测量随分子浓度变化的光信号百分比来获得S形曲线。使用Sigma绘图软件进行4PL回归，并且能够获得EC50(1次实验，n＝3)。
1.2.短期体内研究：急性测试
1.2.1.胃肠转运
经由口服施用混悬在阿拉伯树胶中的植物炭(作为不可吸收标记物在本文中使用)，来测量通过胃和肠的转运。简言之，在短暂禁食后，将C57BL/6小鼠腹膜内(i.p.)注射含有或不含感兴趣的分子JM-00.266(即化合物IA)(10mg/kg)的花生四烯酸乙醇胺(10mg/kg)，然后口服施用木炭。在25分钟后，通过颈椎脱臼将动物处死，以完全去除肠。测量了幽门起始点与木炭推注位置间的距离。
1.2.2.口服葡萄糖耐量测试(OGTT)
为了评价利莫那班样分子的短期作用以及它们对CB1R的选择性，在腹膜内注射载体或JM-02.003或JM-00.266(即化合物IA)(10mg/kg)后10min，使野生型C57BL/6小鼠和CB1R-/-小鼠进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT，2g/kg)。在口服施用葡萄糖后t＝0、t＝15min、t＝30min、t＝45min、t＝60min、t＝90min和t＝120min时，使用
Figure BDA0001642003000000263
TS血糖监测仪(型号81574201，Bayer HealthCare)和反应条(参考号81574274，Bayer HealthCare)测量血糖。
1.2.3.胰岛素耐量测试(ITT)
在胰岛素耐量测试期间，测量分子JM-00.266(即化合物IA)对胰岛素敏感性的短期作用。为此目的，在腹膜内注射载体或JM-00.266(即化合物IA)(10mg/kg)后10min，向野生型C57BL/6小鼠腹膜内注射速效胰岛素(0.5IU/kg；参考号YT60088，
Figure BDA0001642003000000264
)。在腹膜内注射胰岛素后t＝0、t＝15min、t＝30min、t＝45min、t＝60min、t＝90min和t＝120min时，使用血糖监测仪测量血糖。
1.2.4.血浆胰岛素
根据供应商的说明，使用ALPCOTM小鼠胰岛素ELISA试剂盒(参考号AKRIN-011T，ALPCO Diagnostics)进行血浆胰岛素的测定。在OGTT期间，在口服施用葡萄糖(2g/kg)后t＝0、t＝30、t＝60、t＝120min时收集血液样品。
1.3.长期体内研究：慢性施用
1.3.1.动物的饮食、食物摄入和身体组成
为了确定感兴趣的分子的长期作用，利用高蔗糖、高脂肪饮食(HSHF：30％粗脂肪，33.5％碳水化合物；参考号E15126-34；参考号E15126-34，SSNIFF，Soest，德国)持续20周使C57BL/6小鼠肥胖。然后，使这些小鼠每天接受腹膜内注射利莫那班、JM-00.266(即化合物IA)或载体持续30天的时间。平行地，在处理开始后每两天监测体重和食物摄入。
使用EchoMRITM扫描仪测量处理对身体组成的长期作用，所述扫描仪允许在不麻醉的情况下通过核磁共振(RMN)对活体动物进行脂肪量、瘦体重和体液组成的非侵入性分析。
1.3.2.行为研究：旷场测试
在用利莫那班或分子JM-00.266(即化合物IA)的长期处理结束时，通过红外监测系统测量小鼠的运动活动。为此目的，将动物单独置于43×43cm的有机玻璃盒(MEDassociates)中持续20min。将两个系列的16个脉冲红外光束置于对侧壁间隔2.5cm，以记录100ms分辨率的动态X-Y运动。中心被定义为中央的32×32cm的正方形。除了运动活动信息以外，该测试还能够预测对新奇事物或焦虑形成环境的抗焦虑活性。在旷场测试中测量的变量为总动态活动(以cm计)，进入中心区域的次数和在中心区域消耗的时间，以及在中心穿过的距离除以所穿过的总距离。
1.3.3.血浆测试
使用合适的试剂，通过Dimension Vista智能实验室系统(Siemens，Saint–Denis，法国)测定总胆固醇、甘油三酯和肝脏标记物。
1.3.4.口服葡萄糖耐量测试和胰岛素耐量测试
为了评价处理对血糖控制的长期作用，在处理前和处理后评价葡萄糖耐量(OGTT)和胰岛素敏感性(ITT)。因此，对于OGTT，向小鼠强制喂食葡萄糖(2g/kg)，对于ITT，使小鼠接受胰岛素腹膜内注射(0.5IU/kg)。在两种情况下，在葡萄糖摄入后t＝0、t＝15min、t＝30min、t＝45min、t＝60min、t＝90min和t＝120min时，使用
Figure BDA0001642003000000271
TS血糖监测仪(参考号81574201，Bayer HealthCare)和反应条(参考号81574274，Bayer HealthCare)测量血糖。
1.4.长期体内研究：在肥胖小鼠中施用化合物IA和减少能量供应
1.4.1高脂肪饮食、与低脂肪饮食相关的食物摄入和动物体重
为了确定感兴趣的化合物JM-00.266(即化合物IA)的长期作用，利用高脂肪饮食(30％粗脂肪，33.5％碳水化合物；参考号E15126-34，SSNIFF，Soest，德国)持续15周使C57BL/6小鼠肥胖。然后，在43天的时间内，使小鼠经受低脂肪饮食(5％脂质；标准饮食AO4；UAR，Epinay-sur-Orge，法国)，并在每天中午接受口服剂量的JM-00.266(即化合物IA)或载体。从处理开始起每两天测量一次动物的体重。
1.4.2葡萄糖耐量测试
为了评价处理对血糖控制的长期作用，在处理期结束时评价葡萄糖耐量。使小鼠接受腹膜内注射葡萄糖(2g/kg)，然后在葡萄糖注射后t＝0、t＝15min、t＝30min、t＝45min、t＝60min、t＝90min和t＝120min时，使用My Life Pura血糖监测仪(Ypsomed，巴黎，法国)测量血糖。
1.5长期体内研究：在保持高脂肪饮食的肥胖小鼠中同时施用化合物IA和食物摄 入
这种方法的选择是有道理的，因为前面的结果表明，当M6的施用在葡萄糖负荷之前时，糖耐量非常明显地改善。
1.5.1高脂肪饮食、化合物与食物摄入同时施用和动物体重
利用高脂肪饮食(35％粗脂肪，25.3％碳水化合物；参考号E15742-34，SSNIFF，Soest，德国)持续15周使C57BL/6小鼠肥胖。然后，在43天的时间内，使保持相同饮食的小鼠每天接受掺入饲料中的口服剂量的JM-00.266(即化合物IA)或载体。从处理开始起每两天测量一次动物的体重。
1.5.2葡萄糖耐量测试
为了评价处理对血糖控制的长期作用，在处理期结束时评价葡萄糖耐量。使小鼠接受腹膜内注射葡萄糖(2g/kg)，然后在葡萄糖注射后t＝0、t＝15min、t＝30min、t＝45min、t＝60min、t＝90min和t＝120min时，使用My Life Pura血糖监测仪(Ypsomed，巴黎，法国)测量血糖。
1.5.3基因表达
用Tri Reagent(Euromedex，法国)进行总信使ARN(ARNm)的提取，并用Bio-RadiScripttm逆转录超级混合试剂盒(Bio-Rad，法国)由1μg ARNm进行互补ADN(ADNc)的连续合成。通过半定量实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)评价基因表达。使用Primer3Plus软件(http://www.bioinformatics.nl/cgi-25bin/primer3plus/primer3plus.cgi)选择下面描述的所使用的引物，其由MWG-Biotech合成。通过考虑每种PCR的功效，并在用报告基因TATA盒结合蛋白(TBP)标准化后，获得基因表达的半定量。
所使用的引物：
Figure BDA0001642003000000291
通过测量1)受体CB1R和CB2R，2)内源性大麻素合成酶，N-酰基磷脂酰乙醇胺磷脂酶D(NAPE-PLD)和3)内源性大麻素降解酶，脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的基因表达，来评价处理对内源性大麻素系统活性的影响。
脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)和甘油磷酸酰基转移酶(GPAT2)是表达变化反映脂肪生成的活性的酶。
在本文中使用肝脏中的葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和葡萄糖转运蛋白GLUT2和GLUT4作为新生血管发生标记物。
F4/80为成熟巨噬细胞标记物。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种促炎细胞因子，其影响许多生物过程的调节，如免疫功能、细胞分化和能量代谢。
2.结果
2.1.化合物JM-00.246、JM-02.003、JM-01.1006、JM-00.242和JM-00.266(即化合物IA)的短期体外和体内实验(急性注射)
2.1.1.在Ob/Ob小鼠中候选分子JM-00.246、JM-02.003、JM-01.006、JM-00.266(即 化合物IA)和JM-00.242对CB1R的肝脏表达的作用
先前在实验室进行的研究表明，能够在存在激动剂或拮抗剂的情况下培养的肝脏外植体中调节CB1R表达(Jourdan等人，2012)。例如，在用SR141716(即利莫那班)处理后，肝脏外植体中的CB1R表达降低。因此，在本文中使用该体外模型，基于候选分子改变CB1R表达的能力来预选择所述候选分子。
基于用SR141716(即利莫那班)获得的这些先前的结果，在相同的肝脏外植体模型中测试每种化合物降低CB1R表达的能力。
只有分子JM-02.003、JM-01.006和JM-00.266(即化合物IA)引起肝脏CB1R表达的显著降低，即，与在先前用SR141716(即利莫那班)的研究中观察到的作用可相比的作用(图1)。分子JM-00.246和JM-00.242未被选择用于研究的其余部分。
2.1.2.预选择的分子JM-02.003、JM-01.1006和JM-00.266对CB1受体活性的作用
通过测量AMPc变化(GloSensor cAMP测试)，在CB1R转染的细胞模型中测试JM-02.003、JM-01.006和JM-00.266(即化合物IA)拮抗CB1R的能力。
首先，通过使用这种体外模型验证了激动剂(在这种情况下为AEA)对受体的活化，确实导致了细胞内AMPc浓度的降低(数据未显示)。结果表明，在不存在激动剂(AEA)时，在用JM-02.003和JM-00.266(即化合物IA)处理的细胞中AMPc浓度增加，而JM-01.006没有作用(图2)。这些数据证实，只有分子JM-02.003和JM-00.266(即化合物IA)是CB1R配体，并且对该受体发挥反向激动剂作用。因此，分子JM-01.1006未被选择用于研究的其余部分。
2.1.3.在野生型C57B1/6J小鼠中用分子JM-02.003和JM-00.266(即化合物IA)的 短时间处理对葡萄糖耐量的作用
为了评价所选分子的体内作用，本发明人试图确定单次腹膜内注射是否可以调节小鼠中的碳水化合物代谢。事实上，最近的工作显示，响应于单次腹膜内注射AEA(CB1R激动剂)的CB1R活化改变了葡萄糖耐量和胰岛素抵抗(Liu等人，2012)。
为此目的，在2g/kg的口服葡萄糖负荷前10min，使野生型C57B1/6J小鼠接受腹膜内注射10mg/kg拮抗剂JM-02.003或JM-00.266(即，化合物IA)。这些结果显示，与接受载体的小鼠相比，这两种分子的腹膜内注射改善了葡萄糖耐量(图3A和图3B)。
当在CB1R KO小鼠中重复这些实验时，观察到葡萄糖耐量的改善在用JM-00.266(即化合物IA)处理的小鼠中消失，而其在用JM-02.003处理的小鼠中仍存在(图3C和图3D)。这证实了只有分子JM-00.266(即化合物IA)发挥特异的CB1R反向激动剂作用。因此，分子JM-02.003未被选择用于研究的其余部分。
2.1.4.在野生型C57B1/6J小鼠中用JM-00.266(即化合物IA)的短时间处理对的胰 岛素敏感性和生成的作用
为了了解响应于腹膜内注射JM-00.266(即，化合物IA)所观察到的血糖控制的改善是否可能是由于胰岛素分泌增加和/或更好的胰岛素敏感性所致，在口服葡萄糖丸剂后进行血浆胰岛素测定以及胰岛素耐量测试(ITT)。
结果显示，由施用葡萄糖诱导的胰岛素生成不被JM-00.266刺激(图4A)。相反，在用JM-00.266(即化合物IA)处理的小鼠中，在t＝30min时的血液胰岛素更低，表明利用葡萄糖的能力得到改善。ITT还揭示，与对照动物(图4B)相比，在用JM-00.266(即化合物IA)初次处理的动物中，胰岛素对血浆葡萄糖清除发挥更强的作用。
这些数据提示分子JM-00.266(即化合物IA)通过增加胰岛素敏感性来改善葡萄糖耐量。
2.1.5.在野生型C57B1/6J小鼠中用JM-00.266(即化合物IA)的短时间处理对胃肠 道转运的作用
文献中清楚地显示CB1R活化强烈抑制胃肠动力(Di Marzo等人，2008)。在此基础上，本发明人试图通过测量通过强制喂食施用的不可吸收木炭团块沿消化道的体内推进，来了解分子JM-00.266(即化合物IA)是否能够改善由CB1R激动剂(AEA)诱导的胃轻瘫。在测试的实验模型中，转运如预期一样被AEA强烈抑制。令人感兴趣的是，事先注射JM-00.266(即化合物IA)完全消除了激动剂的作用，并使胃肠道转运正常化(图5)。这些数据表明，首先，消化道是JM-00.266(即化合物IA)的靶点，其次，该分子能够消除激动剂对CB1R的作用，即，能够发挥对受体的拮抗作用。
2.2.在肥胖小鼠中用化合物JM-00.266的长期体内实验(慢性注射)
为了确定化合物JM-00.266(即化合物IA)的长期作用，利用高蔗糖、高脂肪饮食施用持续20周使C57BL/6小鼠肥胖。然后，这些小鼠每天接受腹膜内注射SR141716(即利莫那班)(10mg/kg)、JM-00.266(即化合物IA)(10mg/kg)或载体持续30天的时间。
2.2.1.用化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性处理对肝脏损伤标记物的作用
肝脏的酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肠碱性磷酸酶(ALPI)、γGT和总胆红素是细胞损伤的标记物。在血浆中测量这些标记物，以检测化合物JM-00.266(即化合物IA)的可能的肝脏毒性。
表1.与载体(对照)相比，在用SR141716(利莫那班)或化合物JM-00.266(化合物IA，也被称为M6)的30天慢性处理结束时，肝脏标记物的血浆浓度。
ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；ALPI：肠碱性磷酸酶。
对照 SR141716 JM–00.266
γGT(U/L) <3 <3 <3
ALT(U/L) 62.0±24.9 21.6±2.3* 34.3±10.5
AST(U/L) 131.2±47.0 46.4±3.1* 60.8±13.4
ALPI 52.7±7.8 37.4±2.4 47.3±3.6
总胆红素(μmol/L) <2 <2 <2
表1中所示的结果显示，与对照相比，用SR141716(即利莫那班)或JM-00.266(即化合物IA)的30天慢性处理不引起肝脏损伤标记物的增加。相反，SR141716(即利莫那班)显著降低了在肥胖小鼠的血浆中检测到的ALT和AST浓度，并且用JM-00.266(即化合物IA)观察到了相同的趋势。
总之，结果提示，不仅化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性施用不引起肝脏毒性，而且其还减少由肥胖引起的细胞损伤。
2.2.2.用化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性处理对与中枢CB1R的活化有关的 某些行为参数的作用
旷场测试在于通过红外线系统，测量动物在代表压力环境的照明围栏中的行动。在旷场中测量的变量为总动态活动和进入中心区域的次数及在中心区域消耗的时间。除了测量运动活力以外，该测试还能够了解动物的焦虑状态。
试验结果表明，一方面SR141716(即利莫那班)和JM-00.266(即化合物IA)的施用均对在场地中心(最焦虑的区域)消耗的时间没有显著作用，提示肥胖小鼠的焦虑状态在30天的处理结束时没有改变(图6)。另一方面，应当注意，SR141716(即利莫那班)增加运动活力，而化合物JM-00.266(即化合物IA)对该参数没有作用，提示JM-00.266(即化合物IA)不发挥中枢作用。
2.2.3.用化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性处理对食物摄入量、体重和身体 组成的作用
在整个处理中，每两天测量一次食物摄入和体重。图7A显示，与接受载体的对照小鼠的食物摄入相比，用JM-00.266(即化合物IA)的处理没有改变经处理动物的食物摄入。只有接受SR141716(即利莫那班)的小鼠短暂地减少其食物摄入。
平行于食物摄入，每两天监测一次响应于处理的体重变化(图7B)。结果显示，用SR141716(即利莫那班)处理的小鼠体重减轻，这与观察到的减少的食物摄入相一致。用JM-00.266(即化合物IA)处理的动物的体重相对于对照小鼠没有降低。
在处理结束时，通过RMN分析小鼠的身体组成(脂肪量、瘦体重)。图7C显示，与对照小鼠相比，只有用SR141716(即利莫那班)处理的小鼠脂肪量更低且瘦体重更高。
在该研究中观察到的SR141716(即利莫那班)的作用已经在文献中被描述，并且通过SR141716对CB1R的中枢作用解释，所述中枢作用导致食物摄入的快速(但短暂)的减少，随后体重减轻(Ravinet Trillou等人，2003)。化合物JM-00.266(即化合物IA)在测试的时间范围内对食物摄入或体重没有作用的事实证实了化合物的作用确实限于外周CB1受体。
2.2.4.用化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性处理对血糖和葡萄糖耐量的作用
为评价化合物JM-00.266(即化合物IA)对碳水化合物代谢的长期作用，在处理前和处理结束时进行葡萄糖耐量测试(OGTT 2g/kg)。结果表明，在用JM-00.266和SR141716(即利莫那班)处理30天后，肥胖小鼠的基础血糖(图8A)和葡萄糖耐量显著改善(图8B)。
2.2.5.用化合物JM-00.266(即化合物IA)的慢性处理对血胰岛素和胰岛素敏感性 的作用
为了解慢性施用化合物JM-00.266(即化合物IA)诱导的血糖控制的改善是否与胰岛素抵抗的改善相关，使用ITT来测量处理对胰岛素敏感性的作用。该测试显示，在施用SR141716(即利莫那班)和JM-00.266(即化合物IA)30天后，在处理开始前检测到的肥胖小鼠的胰岛素抵抗得到改善(图9)。应当注意的是，与用SR141716(即利莫那班)处理的小鼠相比，在用JM-00.266(即化合物IA)处理的小鼠中由胰岛素注射诱导的血糖降低更显著。
2.3.在肥胖小鼠中长期施用化合物IA(也被称为M6或JM-00.266)并减少能量供应的体内作用
2.3.1.对体重的作用
如图10中的图所示的结果显示：
-当肥胖小鼠(46.21±1.18g)保持高脂肪饮食(30％粗脂肪，33.5％碳水化合物)(VEH+HF)时，它们的体重保持稳定；
-当肥胖小鼠(46.01±0.84g)被喂食低脂肪饮食(5％脂质)(VEH+LF)而不是含30％粗脂肪的高脂肪饮食时，它们的体重减轻；
-当肥胖小鼠(45.83±0.82g)被喂食含5％脂质的低脂肪饮食并接受化合物M6(M6+LF)时，它们的体重更加显著地下降。
因此，观察到在首先通过高脂肪饮食变肥胖的小鼠中，施用作为低脂肪饮食添加剂的化合物M6增强了由热量限制引起的体重减轻。
2.3.2.对葡萄糖耐量的作用
如图11中的图所示的结果显示：在每天一次口服施用(10mg/kg)化合物M6(JM-00.266)或载体43天的处理后，与相应的对照、载体和低脂肪饮食(VEH+LF)和载体和高脂肪饮食(VEH+HF)相比，接受低脂肪饮食(M6+LF)的小鼠表现出更好的葡萄糖耐量。
2.4.在肥胖小鼠中长期同时施用化合物IA(也被称为M6或JM-00.266)和食物的体内作用
2.4.1.对体重的作用
如图12中的图所示的结果显示：当在进餐期间以每天施用一次的速度用化合物M6处理接受高脂肪饮食(35％粗脂肪)的肥胖小鼠(46.81±3.02g)(M6)时，它们比用载体处理的小鼠(VEH)减轻更多的重量。
因此，在进餐期间施用化合物M6促进小鼠体重减轻，所述小鼠通过高脂肪饮食变肥胖，并且在处理期间接受相同的饮食。考虑到当在施用葡萄糖前10分钟急性施用化合物M6时观察到的化合物M6对血糖控制的作用(参见上文第2.1.3节)，预期刚好在进餐前施用化合物M6也有类似的结果。
2.4.2.对葡萄糖耐量的作用
如图13中的图所示的结果显示：在进餐同时施用化合物M6的28天处理后，小鼠表现出比在进餐同时施用载体处理的小鼠更好的葡萄糖耐量。
2.4.3.对标记物的基因表达的作用
用M6的处理导致所测试的组织中NAPE-PLD的表达减少，提示内源性大麻素减少。
在所测试的任何组织中，处理没有改变CB1R和内源性大麻素降解酶(脂肪酸酰胺水解酶，FAAH)的表达。在用M6处理的动物的组织中，CB2R的表达也较低。CB2R主要在免疫细胞中表达，可能该结果反映了较低的巨噬细胞浸润。
脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1)和甘油磷酸酰基转移酶(GPAT2)是表达变化反映脂肪生成活性的酶。因此，在用M6处理的动物的肝脏中SCD-1和GPAT的表达降低和脂肪组织中FAS的表达降低提示这些组织中的脂质合成较低。
在本文中使用肝脏中的葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和葡萄糖转运蛋白GLUT2和GLUT4作为新生血管发生标记物。结果提示，用M6的处理可能与更低的肝脏葡萄糖产生有关。
在用M6处理的小鼠的脂肪组织中G6P和GLUT4表达的减少可能反映了参与脂肪生成通路的葡萄糖的使用的减少。
F4/80为成熟巨噬细胞标记物。F4/80表达在肝脏和脂肪组织中明显减少，提示较低的巨噬细胞浸润。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种促炎细胞因子，其影响许多生物过程的调节，如免疫功能、细胞分化和能量代谢。已经认可浸润肥胖小鼠脂肪组织的巨噬细胞是TNF-α产生增加的原因。在本研究中，观察到脂肪组织中TNF-α表达减少的趋势，以及M6降低F4/80表达的趋势。这些结果似乎与CB2R表达的减少相一致，所述CB2R基本位于免疫细胞上。
III.结论
肥胖症与内源性大麻素系统(SEC)的内源性大麻素1受体(CB1R)依赖性超活化有关。因此，CB1R失活构成了用于对抗肥胖症相关的代谢疾病的治疗策略。CB1R反向激动剂SR141716(利莫那班)是第一个上市的抗肥胖剂，但是由于阻断中枢CB1R导致神经精神性副作用，其被迅速从市场上撤下。然而，针对外周CB1R的作用可以凭借自身能力构成用于治疗肥胖症和某些肥胖症相关疾病的治疗方案。事实上，即使食物摄入减少似乎是体重减轻和代谢参数改善的主要原因，几项在动物和人中的研究表明，外周CB1R也可以参与脂质和葡萄糖代谢的调节(Nogueiras等人，2008；Osei-Hyiaman等人，2008)。因此，已经提示内源性大麻素系统失活的长期有益作用是由于对食物摄入的中枢作用及对脂肪组织、肝脏、骨骼肌和胰腺的外周作用。Tam等人在2010年的工作已经清楚地显示外周CB1R的作用，表明在肥胖小鼠中通过外周拮抗剂阻断这些受体降低了心脏代谢风险。最近的两项研究也同意这个观点。第一项研究提示，内脏脂肪组织中内源性大麻素系统活性的降低与脂肪细胞代谢的正常化有关，这有利于在肥胖小鼠中观察到的肝脂肪变性的逆转(Jourdan等人，2010)。第二项研究通过体外方法显示，肝脏CB1R的失活导致脂肪酸β-氧化的激活(Jourdan等人，2012)。因此，在具有显著的公共健康影响的疾病(如代谢综合症)中，在控制食物摄入的调节和碳水化合物及脂质代谢的调节方面，作为内源性大麻素CB1受体(CB1R)拮抗剂的化合物的使用无疑是令人关注的。此外，开发保留对外周CB1R的活性但不穿过血脑屏障的化合物将能够规避临床使用利莫那班生成分子的困难。
这些基于“体外”、“短期体内”和“长期体内”的三种方法的结果显示，在所测试的五种新分子中，仅有化合物JM-00.266具有：
(1)对于CB1受体的反向激动剂性质，
(2)限制性外周作用，因此不可能产生如过去的开发尝试中产生的化合物那样的有害精神性副作用，
(3)在肥胖症的情况下，通过特别地改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性和通过降低血液甘油三酯的对碳水化合物-脂质代谢的有益作用，和
(4)防止花生四烯酸乙醇胺(天然的CB1R激动剂)对胃肠动力的抑制作用的能力，其显示化合物在体内的强烈拮抗作用，以及其在治疗胃轻瘫中的功用。
在肥胖小鼠体内化合物JM-00.266根据施用方式对体重和某些生物学参数的作用也能够揭示以下：
-在通过高脂肪饮食变肥胖的小鼠中，作为低脂肪饮食添加剂施用的该化合物增强由热量限制引起的体重减轻，并改善葡萄糖耐量。这些结果能够设想将这种类型的化合物与正常热量饮食和/或已知负向调节食物摄入的化合物组合的治疗；
-在进餐期间施用的该化合物促进小鼠体重减轻并改善葡萄糖耐量，所述小鼠通过高脂肪饮食变肥胖，并且在处理期间接受相同的饮食。这些结果能够设想用于优选在进餐前和/或进餐期间施用感兴趣的化合物的方案；
-该化合物对内源性大麻素系统活性、脂肪生成活性和巨噬细胞浸润的不同标记物的体内作用尤其提示内源性大麻素的减少、组织中较低的脂质合成、参与脂肪生成通路的葡萄糖使用的减少和较低的巨噬细胞浸润。
此外，这种新化合物的结构及其药物调节的能力使得能够获得在中枢神经系统中很少或根本不扩散的分子，所述分子由如上所述的式(I)化合物所代表。
考虑到在本研究的情况下观察到的性质，根据本发明的式(I)化合物不仅对肥胖症相关疾病，而且对于在不同外周组织中已显示CB1R参与的疾病具有毫无疑问的治疗意义。因此，通过根据本发明的化合物的外周CB1R失活使得能够治疗胰岛素抵抗(Song等人，2011；Eckardt等人，2009)、II型糖尿病(Matias等人，2006；Jensen，2006)、非酒精性肝脏脂肪变性(Osei-Hyiamann等人，2005；Osei-Hyiaman等人，2008；Jeong等人，2008)、肝纤维化(Teixeira-Clerc等人，2006)、肾病(Jourdan等人，2012)、肾纤维化(Lecru等人，2015)、心肌病(Montecucco和Di Marzo，2012；Rajesh等人，2012；Slavic等人，2013；Schaich等人，2014；Pacher和Kunos，2013)、胃轻瘫(Izzo和Sharkey，2010)、骨生长和软骨发育(Tam等人，2008；Wasserman等人，2015)、肌肉发育(Iannotti等人，2014)、生育能力(尤其是男性精子运动性和活力(Amoako等人，2014)和女性的卵母细胞植入(Wang等人，2006))。
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Claims (21)

1.一种下式(I)的化合物：
Figure FDA0002927235880000011
其中：
·R1和R2可以相同或不同，表示氢原子或COR3、SO2R4或CONR5R6基团；或者与携带它们的氮原子一起形成5或6元杂环，所述杂环包含至少一种另外的杂原子、C＝O基团或苯基；
·R3、R4和R5独立地表示苯基，其任选被选自卤素原子、CF3和SO2R12的基团取代，其中R12表示(C1–C6)烷基；和
·R6表示氢原子，
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R2与携带它们的氮原子一起形成下式(II)或(III)的杂环：
Figure FDA0002927235880000012
其中R27表示氢原子或COR3或SO2R4基团，R3和R4如权利要求1中所定义。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中R27表示氢原子。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R3、R4和R5独立地表示苯基，其任选被选自卤素原子、CF3和SO2R12的基团取代，其中R12表示(C1–C6)烷基。
5.根据权利要求1或4所述的化合物，其中所述卤素原子为Cl或F。
6.根据权利要求1或4所述的化合物，其中R12表示甲基。
7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1为氢原子，并且R2表示COR3、SO2R4或CONR5R6基团，其中R3、R4、R5和R6如权利要求1或4之一所定义。
8.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于其选自以下化合物：
Figure FDA0002927235880000021
或其药学上可接受的盐，
其中X表示氢原子、卤素或CF3。
9.一种用于制备根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物的方法，其包括以下步骤：
(i)将4-甲硫基苯甲醛与4-甲硫基苯胺缩合，以获得下式(IV)的组分：
Figure FDA0002927235880000031
(ii)将所得的式(IV)的组分与下式(V)的烯酮进行施陶丁格环加成反应：
Figure FDA0002927235880000032
以获得下式(IA)的组分：
Figure FDA0002927235880000033
(iii)任选地，将式(IA)化合物的邻苯二甲酰化胺官能团脱保护，以获得下式(IF)的组分：
Figure FDA0002927235880000034
然后，任选地，将由此得到的式(IF)化合物与式R1-X和/或R2-X'的化合物偶联，其中R1-X和R2-X'为在权利要求1中所定义的基团R1和R2的活化形式，所述活化形式选自酰氯、磺酰氯和芳基异氰酸酯；和
(iv)收集在步骤(ii)或步骤(iii)中获得的化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤(III)中，任选地，通过甲基肼的作用，将式(IA)化合物的邻苯二甲酰化胺官能团脱保护。
11.至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物在制备外周内源性大麻素CB1受体的反向激动剂中的用途。
12.一种药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
13.一种非治疗性组合物，其包含至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物，和至少一种可接受的赋形剂。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物或者根据权利要求12所述的药物组合物在制备用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于所述疾病选自肥胖症和与肥胖症相关的代谢疾病、胰岛素抵抗、糖尿病和相关并发症、肝脏脂肪变性、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肾病、心肌病、胃轻瘫、骨和/或软骨丢失、肌肉损失和生育问题。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其特征在于受试者接受平衡的正常热量饮食。
17.根据权利要求14或15所述的用途，其特征在于在受试者进餐前和/或进餐期间向所述受试者施用所述化合物或所述组合物。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物和用于预防或治疗与内源性大麻素系统的活动过度相关的疾病的治疗剂，在制备用于同时、分开或顺序施用的组合制剂中的用途。
19.一种用于在受试者中促进和/或加速体重减轻，或者用于减缓和/或减少体重增加的非治疗性方法，其包括施用有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的式(I)的化合物或根据权利要求13所述的组合物。
20.根据权利要求19所述的非治疗性方法，其中所述受试者接受平衡的正常热量饮食。
21.根据权利要求19或20所述的非治疗性方法，其中在受试者进餐前和/或进餐期间向所述受试者施用所述化合物或所述组合物。
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