CN108277254A

CN108277254A - 一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基

Info

Publication number: CN108277254A
Application number: CN201711401256.3A
Authority: CN
Inventors: 李大攀; 李书至; 李俊; 卜令军; 王文钰
Original assignee: ZHUMADIAN HUAZHONG CHIA TAI CO Ltd
Current assignee: ZHUMADIAN HUAZHONG CHIA TAI CO Ltd
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108277254B

Abstract

本发明涉及一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其中，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20～25g、黄豆饼粉6～15g、玉米淀粉100～120g、酵母粉1～5g、淀粉酶0.1～0.5g、氯化钠2～3g、硫酸铵5～8g、碳酸钙4～6g、乳酸钙2～4g、硫酸镁 0.1～0.3g、豆油 0.1～0.2g。本发明采用乳酸钙替代原配方中的部分碳酸钙，有效的螯合了发酵过程中菌株分泌于胞外的游离金霉素，解除了胞外金霉素对菌株生长代谢的抑制，提高了菌株生产金霉素的能力；同时通过与发酵过程中分泌于胞外的游离金霉素生成金霉素钙盐不溶物，减少了后续板框过滤时滤液中金霉素的损失，一方面提高了金霉素的回收率，另一方面降低了滤液中金霉素的残留。

Description

一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基。

背景技术

金霉素预混剂主要通过金色链霉菌发酵培养、发酵结束后发酵液加入碳酸钙进行混合、板框过滤获得湿滤饼、湿滤饼烘干粉碎制得。

金霉素主要是金色链霉菌的一种胞内产物。但是，在培养过程中金霉素菌株中会向胞外分泌一部分金霉素产物，正常情况下，金霉素菌株对胞外金霉素有一定的耐受范围，超过了耐受范围，胞外金霉素会抑制菌株的生长和金霉素的合成。因此，胞外分泌的金霉素，一方面会抑制菌株的生长，进而抑制金霉素的合成；另一方面，胞外分泌的金霉素会在后续板框过滤的过程中被滤掉，造成金霉素产量的损失。目前，生产工艺中针对该问题的解决办法就是在发酵培养基和发酵结束后加入碳酸钙用来螯合发酵过程中释放到胞外的金霉素，但由于碳酸钙本身是不溶于水的，在发酵液中无法释放大量用于络合金霉素的钙离子，因此，一方面导致了发酵过程中胞外金霉素对菌株产抗的抑制作用未解除；另一方面，导致了发酵液板框过滤后滤液中仍有金霉素损失。

目前，金霉素发酵行业在金霉素发酵培养基方面，普遍采用碳酸钙CaCO₃作为发酵原料之一。驻马店华中正大有限公司李书至等人关于金霉素发酵培养基及利用该培养基的金霉素发酵生产方法的专利（201310504063.6）；金河生物科技有限公司谢昌贤等人关于金霉素菌种选育培养基及菌种选育方法的专利（201510485721.0）；浦城正大生化有限公司关于一种利用精制蛋白粉的金霉素发酵生产方法的专利（201610694105.0）；宁夏泰瑞制药股份有限公司任勇等人关于一种金色链霉菌发酵生产金霉素的新型培养基和培养方法的专利（201410057535.2），驻马店华中正大有限公司李大攀等人关于一种金霉素发酵培养基及其在金霉素发酵中的应用的专利（201611183084.2）；河北圣雪大成制药有限公司赵丽红等人关于一种金霉素的发酵培养基的专利（201510687867.3）；驻马店华中正大有限公司刘娟等人关于一种金霉素发酵培养基及利用该培养基的金霉素发酵生产方法的专利（201611199651.3）；金河生物科技有限公司谢昌贤等人关于金霉素发酵培养基分消及应用方法的专利（201510295435.8）；这些专利均描述了含有唯一钙盐-碳酸钙CaCO₃的发酵培养基配方组成，这些专利无一涉及对另一种钙盐乳酸钙的研究和应用。在金霉素发酵行业，发酵培养基配方中添加钙盐的主要目的：1）补充微生物生长过程中对钙元素的需求；2）调节发酵过程中发酵液pH；3）通过钙离子络合菌株发酵过程中分泌于胞外的金霉素，减少后期提取过程中胞外金霉素的损失。尽管碳酸钙和乳酸钙均属于钙盐，但是两者的性质差异以及使用作用显著不同，碳酸钙不溶于水，乳酸钙极溶于水，碳酸钙在发酵液中基本呈不溶物的固体形式存在，这就完全限制了碳酸钙作用的发挥（这就是为什么金霉素发酵整个行业都会存在板框滤液中金霉素效价损失的现象），而乳酸钙极易溶于水，可以完全达到发酵配方中添加钙盐的真正目的，而且乳酸钙易吸收，更容易满足微生物生长过程中对钙元素的吸收需求。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其可以显著减少滤液中金霉素的损失量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其中，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20～25g、黄豆饼粉6～15g、玉米淀粉100～120g、酵母粉1～5g、淀粉酶0.1～0.5g、氯化钠2～3g、硫酸铵5～8g、碳酸钙4～6g、乳酸钙2～4g、硫酸镁 0.1～0.3g、豆油0.1～0.2g。121℃，灭菌30分钟。

进一步优选的，所述的乳酸钙为L-乳酸钙，所述的乳酸钙替代原配方中碳酸钙的比例为25～50%（W/W）。

金霉素发酵行业普遍采用碳酸钙CaCO₃作为发酵原料之一，这种普遍性从1948年金霉素的发现者Duggar教授发表世界上第一篇金霉素论文开始，就从未改变。申请人认为主要的原因是：这么多年来大家一直热衷于对金霉素发酵配方中大宗原料、成本高的原料进行研究，忽略了对无机盐这种低成本、用量少的原料进行研究。其实，恰恰是这种小成分是影响整个发酵过程的关键。张雪峥等人关于一种添加金属离子提高金霉素产量的发酵工艺的专利（201310504063.6）公开了一种添加硫酸锌和三氯化铁提高金霉素产量的方法，尽管钙盐同属于金属离子的范畴，但是本发明并非强调的是一种添加钙盐提高金霉素产量方法，而是强调对行业现有传统工艺（添加碳酸钙钙盐）的实质改进。碳酸钙是一种无机化合物，化学式是CaCO₃，呈中性，不溶于水。乳酸钙是一种有机化合物，易溶于热水，具有溶解度高、溶解速度快、生物利用率高的特点，L-乳酸钙为左旋乳酸钙，极易溶于水，溶解效果显著优于乳酸钙。常温下几种钙盐的溶解度：L-乳酸钙＞乳酸钙＞柠檬酸钙＞葡萄糖酸钙＞磷酸钙＞碳酸钙。由于乳酸钙具有很高的溶解度，可以提供高浓度的钙离子，而钙离子具有较强的络合作用，因而乳酸钙是一种优秀的络合剂。

本发明解决的技术问题在于：金霉素发酵过程中碳酸钙无法有效络合胞外金霉素，一方面导致了发酵过程中胞外金霉素对菌株产抗的抑制作用；另一方面导致了发酵液板框过滤后滤液中仍有大量的金霉素损失，造成废水中金霉素的残留问题。和现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1）本发明采用乳酸钙替代原发酵培养基配方中的部分碳酸钙，有效的螯合了发酵过程中菌株分泌于胞外的游离金霉素，解除了胞外金霉素对菌株生长代谢的抑制，提高了菌株生产金霉素的能力；

2）本发明采用乳酸钙替代原发酵培养基配方中的部分碳酸钙，通过与发酵过程中分泌于胞外的游离金霉素生成金霉素钙盐不溶物，减少了后续板框过滤时滤液中金霉素的损失，一方面提高了金霉素的回收率，另一方面降低了滤液中金霉素的残留；

3）碳酸钙是一种无机化合物，基本上不溶于水，而乳酸钙是一种有机化合物，溶解度高、生物利用度对高。因此，采用乳酸钙替代原配方中的部分碳酸钙，可以更有效的满足菌株在生长代谢过程中对钙的营养需求。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

对照例：

金霉素发酵培养基：每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20g、黄豆饼粉12g、玉米淀粉120g、酵母粉1g、淀粉酶0.5g、氯化钠2g、硫酸铵8g、碳酸钙8g、硫酸镁 0.15g、豆油 0.1g。

操作工序：是由金色链霉菌作为出发菌株，经过纯种培养、三级发酵生成金霉素，具体工艺步骤包括：砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、金霉素发酵液制备工序，具体如下：

1）砂土孢子制备：将河沙用10%盐酸浸泡水洗后，烘干过60目筛；将土用水浸泡，烘干后过80目筛。砂和土按2：1质量比混合均匀，分装于12×100mm小试管中，装量高度约1cm，纱布棉塞封口，121℃、1小时间歇灭菌三次，烘干做无菌试验，检查无菌后备用；

将分离筛选到的金色链霉菌孢子在无菌条件下接入上述经检查无染菌的砂土管中，贴上标签，记上砂土名称及埋藏日期，置于放有干燥剂的容器中，盖紧密封，置于4℃冰箱中保存备用；

2）母瓶斜面孢子制备：在无菌条件下从砂土管中挑取适量砂土接于母瓶斜面培养基上，要求菌落分布稍稀疏，标识后，放于温度32℃，湿度65%的恒温室培养4天，孢子成熟后放于4℃冰箱保存备用；母瓶斜面培养基各原料的质量百分比含量为：麸皮 2.6%，琼脂2%，蛋白胨0.6%，余量水；

3）子瓶斜面孢子制备：从母瓶上挑取孢子丰满、无白点的单菌落10只，于约5ml无菌水中，搅匀配成孢子液，然后用玻璃铲挑孢子液接入子瓶斜面培养基上，要求菌落分布较密，同时做露碟和肉汤无试检查。接好的斜面标识后放于温度32℃，湿度65%的恒温室培养4天，成熟后放于4℃冰箱保藏备用；子瓶斜面培养基各原料的质量百分比含量为：麸皮 3.2%，琼脂2%，蛋白胨0.6%，余量水；

4）一、二级种子制备：在无菌条件下，在合格的4瓶子瓶斜面孢子内加150ml无菌蒸馏水，以火焰法接种到一级种子罐中，温度控制在26-33℃，罐压控制在0.04—0.06Mpa，搅拌转速在110-140rpm条件下培养时间22小时；然后接种至二级种子罐中，二级种子液培养时间6小时，种子生长良好可移入发酵罐；一、二级种子培养基各原料的质量百分比含量均为：玉米淀粉30%，玉米浆2%，轻质碳酸钙0.6%，硫酸铵0 .5%，淀粉酶0 .05%；氯化钙0 .2%，余量水；

5）发酵制备：将上述金霉素发酵培养基121℃灭菌30分钟，当培养基灭菌完成温度降至35℃时，将培养好的二级种子液移入发酵罐，移种后发酵生产采取变温控制，培养压力控制在 0.01Mpa—0.04Mpa，发酵培养粘度控制在 1-35 秒，发酵周期为 110 小时。发酵完成后送到提炼车间进行板框过滤，同时测定滤液中的金霉素含量，结果见下表。

实施例1：

一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其采用L-乳酸钙25%替代对照例中金霉素发酵培养基中的碳酸钙；具体的，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20g、黄豆饼粉12g、玉米淀粉120g、酵母粉1g、淀粉酶0.5g、氯化钠2g、硫酸铵8g、碳酸钙6g、L-乳酸钙2g、硫酸镁 0.15g、豆油 0.1g。其它操作工序同对照例，试验的对比结果如下：

。

实施例2：

一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其采用L-乳酸钙37.5%替代对照例中金霉素发酵培养基中的碳酸钙；具体的，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20g、黄豆饼粉12g、玉米淀粉120g、酵母粉1g、淀粉酶0.5g、氯化钠2g、硫酸铵8g、碳酸钙5g、L-乳酸钙3g、硫酸镁 0.15g、豆油 0.1g。其它操作工序同对照例。试验的对比结果如下：

--- ：表示未检测到效价。

实施例3：

一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其采用L-乳酸钙50%替代对照例中金霉素发酵培养基中的碳酸钙；具体的，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20g、黄豆饼粉12g、玉米淀粉120g、酵母粉1g、淀粉酶0.5g、氯化钠2g、硫酸铵8g、碳酸钙4g、L-乳酸钙4g、硫酸镁 0.15g、豆油 0.1g。其它操作工序同对照例，试验的对比结果如下：

--- ：表示未检测到效价。

综上，通过实施例与对照例的比较分析发现：采用L-乳酸钙25～50%替代对照例中的碳酸钙可以有效提高金霉素的生产发酵水平（提高幅度＞15%），而且还可以减少制造过程中金霉素的损失和废水中金霉素的残留。针对于企业，本发明不仅提高了金霉素的发酵产量和金霉素回收率，而且降低了废水处理成本，具有显著的经济意义；社会层面，本发明解决了废水排放中金霉素残留的问题，具有重大的环保意义。

Claims

1.一种减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基水溶液中含有花生饼粉20～25g、黄豆饼粉6～15g、玉米淀粉100～120g、酵母粉1～5g、淀粉酶0.1～0.5g、氯化钠2～3g、硫酸铵5～8g、碳酸钙4～6g、乳酸钙2～4g、硫酸镁 0.1～0.3g、豆油 0.1～0.2g。

2.如权利要求1所述减少滤液中金霉素损失的金霉素发酵培养基，其特征在于，所述的乳酸钙为L-乳酸钙。