CN108276392A - 亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法以及运用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法。首先制备半抗原：以溴丁烷和金属镁为原料在无水乙醚中制备出溴丁烷格氏试剂，再以溴丁烷格氏试剂与和3,4‑亚甲二氧苯甲腈为原料经过羰基化、溴化及吡咯醇胺基化，制备出吡咯环上连有羟基的亚甲基二氧吡咯戊酮，最后用丁二酸酐与吡咯环上羟基反应制得含有长臂羧基的半抗原。半抗原与蛋白偶联合成人工抗原：通过碳二酰亚胺催化的活性酯工艺，将半抗原与牛血清蛋白偶联制备出亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原。所制备的人工抗原可进行动物免疫，得到相应的抗体，用于各类亚甲基二氧吡咯戊酮免疫分析法的研究以及作为亚甲基二氧吡咯戊酮免疫层析试剂盒生产的关键原料。

Description

亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法以及运用
技术领域
本发明属于生物化工及免疫检测技术领域，具体涉及一种亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法。
背景技术
亚甲基二氧吡咯戊酮是一种卡西酮类的人工合成兴奋剂,分子式:C16H21NO3,英文名称：Methylenedioxypyrovalerone，简称MDPV，常以其盐酸盐形式存在，外观为白色至黄褐色的结晶粉末，有少许酮类微甜气味，易吸潮结块。结构式为：
亚甲基二氧吡咯戊酮和4-甲基甲卡西酮是新型毒品“浴盐”(Bath Salts)的两种主要成分，是化学合成的兴奋剂，对人体有相当的危害。“浴盐”并不是指某种特定的毒品，而是一类“策划药(designer drug)”或者叫合成兴奋剂，是被非法制造出来的，用以模拟具有精神活性等作用的合成药物。在国际社会对传统兴奋剂的严格管制之下，含有甲基苯丙胺和MDMA成分的迷幻药正逐渐退出毒品消费市场，卡西酮类和合成大麻类等新型毒品正成为滥用者娱乐时的新宠。
2012年5月26日，美国迈阿密一名裸体男子在公路堤道上攻击一名流浪汉，并啃掉他半张脸。警方称，凶手当时可能吸食了一种名为“浴盐”的新型街头毒品。这种新兴毒品“浴盐”外观与洗澡用的浴盐看似相同，容易易让食用者躲避掉警方检查。在美洲、欧洲、澳洲和东南亚一些国家，“浴盐”经常以“象牙色波浪”、“紫色波浪”、“香草天空”、“天赐之福”、“雄蜂”、“能量1号”、“红鸽子”、“雪豹等具有诱惑性的商品名出售，对青少年具有一定的诱惑力，近年来在一些狂欢聚会、酒吧及舞厅中吸食“浴盐”的青少年人数呈上升趋势。
滥用者娱乐时的“浴盐”的滥用方式为鼻吸和静脉注射，能产生出类似苯丙胺、MDMA、可卡因、阿拉伯茶和迷幻药(LSD)的效果，长期或大量服用亚甲基二氧吡咯戊酮可以形成依赖性。亚甲基二氧吡咯戊酮的药物不良反应有剧烈头痛、妄想、焦虑、惊厥、甚至忧郁症等。亚甲基二氧吡咯戊酮的急性效应包括:在生理上，可致心率加快、血压上升、血管
收缩、出汗等；在心理上，增加警觉和知觉、增加觉醒度、焦虑、激动、对食物和睡眠需要的感觉度减少。
亚甲基二氧吡咯戊酮，早在上世纪六十年代年就被人工合成，虽然没有发现其被FDA批准作为药物使用的历史记录，但是它曾被用于治疗慢性疲劳和厌食，直到2004年，它作为神经刺激性物质的作用才被逐渐重视起来。2008年之前，它主要在欧洲地区被滥用，欧盟在2010年12月宣布亚甲基二氧吡咯戊酮和甲基甲卡西酮是非法的。英国在2010年4月16日将MDPV列入B级管制药物。同年，芬兰、丹麦和瑞典将MDPV列为管制药物。美国缉毒署2011年11月21日将其列为第一类管制药物。澳大利亚在2012年2月11日将MDPV列入管制药物。加拿大也于2012年对MDPV发布禁令。在我国，亚甲基二氧吡咯戊酮还未被列为管制药物，也未批准作为药品上市。
目前，亚甲基二氧吡咯戊酮的分析检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC),气相色谱(GC)，质谱(MS)等大型分析仪器。美国安捷伦公司开发出三重四极杆液质联用LC/MS/MS方法用于尿液“浴盐”成分亚甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)和4-甲基甲卡西酮的分析检测；美国司法部缉毒署的特别测试与研究实验室也建立了气相色谱-质谱联用(GC/MS)的“浴盐”成分标准分析方法；国内许多药物和毒品机构也开发出MDPV分析检测方法，基本都是气相色谱和液相色谱与质谱联动的仪器分析方法。
上述分析方法存在仪器昂贵，检测费时，需要专业技术人员操作，被检样品需要繁杂处理等缺点。免疫分析法可以克服上述方法的缺陷，它具有专一性强、操作简便、检测时间短、不需要专业人员操作及适用于大规模检测等优点,已被广泛用于各类疾病、毒品滥用和食品安全等项目的快速检测。免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。另外，目前亚甲基二氧吡咯戊酮的侧向流免疫层析试剂盒的市场需求增长迅速，而生产其检测试剂盒的关键原料是亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原，因此研制和提供一种有效的亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法已成当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的制备方法，所制备的亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的亚甲基二氧吡咯戊酮抗体，用于各类亚甲基二氧吡咯戊酮免疫分析法的研究以及作为亚甲基二氧吡咯戊酮免疫层析试剂盒生产的关键原料。
本发明的第一方面中，提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原，其结构如下的通式(1)：
其中，Z为氢原子或羰基氧原子，m为1-4碳原子。优选的方式中，m为1,2,3或者4个碳原子。更为优选的，m为1-4碳原子的直链。
本发明的第二方面中，提供了一种亚甲基二氧吡咯戊酮的人工抗原，其结构为通式(2)所示的结构：
其中，Z为氢原子或羰基氧原子，m为1-4碳原子；P为载体蛋白。
在一些优选的方式中，载体蛋白选自于牛血清蛋白(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清蛋白(OVA)中的一种。
本发明第三个方面，本发明提供一种制备亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原或人工抗原的方法，其中，该方法包括中间体亚甲基二氧戊酮的合成，其中，中间体亚甲基二氧戊酮的合成是以3,4-亚甲二氧苯甲腈为起始原料开始的。
在一些优选的方法中，所述的方法进一步包括：备出卤代烷格试剂，再以卤代烷格试剂与3,4-亚甲二氧苯甲腈经过羰基化、卤化及吡咯醇胺基化，制备出吡咯环上连有羟基的亚甲基二氧吡咯戊酮，最后用丁二酸酐与吡咯环上羟基反应制得含有长臂羧基的半抗原。在一些优选的方法中，卤代烷镁格氏试剂的制备方法包括：在无水醚介质中，金属镁屑与卤代烷在隔绝空气湿气条件下，在无水醚沸点下回流反应完成。在一些优选的方法中，无水醚为二乙醚、二丙醚、二丁醚，四氢呋喃及二氧六环等，非芳烃卤代烷等种的一种或者几种。在一些优选的方法中，采用非环醚做反应介质。在一些优选的方法中，二乙醚作为干醚反应介质。在一些优选的方法中，卤代烷可以为包括氯代烷、溴代烷或碘代烷中的一种或者几种。在一些优选的方法中，溴代烷作为格氏试剂的卤代烷烃试剂。优选的，金属镁与溴丁烷的的摩尔比一般在1:1-1:1.4。优选的，金属镁与溴丁烷的的摩尔比为1：1.15。
在一些优选的方法中，3,4-亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂经羰基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮的方法包括：亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂首先在醚和甲苯混合介质中反应，蒸发出乙醚后再在甲苯沸点下回流反应一定时间，反应完成后反应混合物经酸化、水解、纯化得目标产品。
在一些优选的方法中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮经溴化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮和溴水在乙酸介质中，室温反应一定时间，反应完成后反应混合物经碱化、纯化得目标产品。
在一些优选的方法中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮经吡咯醇胺基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮与3-羟基吡咯烷在四氢呋喃介质中，氮气保护下60度反应一定时间，反应完成后反应混合物经纯化得目标产品。
在一些优选的方法中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮经羧基化制备出带有羧基的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮与酸酐在吡啶介质中酯化反应，氮气保护下100度反应一定时间，反应完成后反应混合物经纯化得含有长臂羧基的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原。
在一些优选的方法中，制备甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的合成的方法包括：在甲基二氧吡咯戊酮半抗原的基础上偶联蛋白制备的，其特征在于，制备采用活性酯蛋白偶联法：甲基二氧吡咯戊酮半抗原在N,N-二甲基甲酰介质中，与N-羟基琥珀酰亚胺及N,N-环己基碳二酰亚胺在氮气保护下于室温下反应制备出活性酯，然后其活性酯在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，与蛋白发生偶联反应得甲基二氧吡咯戊酮人工抗原。
本发明的第四方面中，提供一种检测样本中是否含有亚甲基二氧吡咯戊酮的试剂盒，其中，该试剂盒包括前述任意具体方案中的半抗原或者抗原，或者前述任意方案获得的抗体。
本发明的第五方面中，提供一种利用胶体金，但不限于胶体金的免疫层析技术快速检测MDPV的试剂盒，包括外包装、检测试剂盒其特征在于：所述的检测试剂盒由四部分组成，依次是：经专用溶液处理的样品垫、胶体金或彩色胶乳纳米微球标记的抗MDPV抗体的标记垫、在包被区域(检测区T)包被MDPV-BSA和(质控区C)包被多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸水板。
在一些优选的技术方案中，所述的MDPV抗体是本发明前述的任意方式中制备的MDPV抗原免疫哺乳动物获得的。在一些优选的技术方案中，所述的MDPV-BSA是本发明前述任意方式中制备的半抗原连接蛋白载体后得到的抗原。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV的试剂盒的制备工艺包括如下步骤：用MDPV－BSA配置T线溶液，多克隆抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的T线、C线区域，把用抗MDPV抗体标记好的免疫胶体金或免疫彩色胶乳纳米微球溶液包被到玻璃纤维或无妨布上，样品垫用专用溶液处理。将上述材料按一定顺序依次粘贴到PVC胶板上再与吸水板组合形成试剂条，试条可单独形成试剂条用于检测，也可把试剂条组装到塑料壳中组成卡式试剂盒检测。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV的试剂盒的制备工艺，其特征在于：样品垫用专用溶液处理，用以提高产品特异性及灵敏度。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV的试剂盒的制备工艺，其特征在于样品垫专用溶液主要成分由含有表面活性剂，牛血清白蛋白，PBS溶液构成。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV试剂盒的制备工艺，其特征在于：用于标记的抗MDPV抗体可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV试剂盒的制备工艺，其特征在于：用于包被的质控线是多克隆抗体，优选为羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV试剂盒的制备工艺，其特征在于：用于标记抗MDPV抗体的标记物可以是胶体金也可以是彩色胶乳纳米微球，荧光纳米微球。
在一些优选的技术方案中，快速检测MDPV试剂盒的制备工艺，其特征在于：将包被好的硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板上，将包被了MDPV抗体的免疫胶体金或彩色胶乳纳米微球的玻璃钎维(标记垫)搭接已包被好的硝酸纤维素膜0.5mm,将含有特殊溶液的样品垫搭接至标记垫的1/2处，吸水板搭接包被好的硝酸纤维素膜的上部分。
有益效果
本发明提供一种新的MDPV半抗原或者抗原的合成路线，克服了现有传统技术的不足。
附图说明
图1:本发明MDPV人工抗原制备的化学反应工艺流程示意图。
图2:本发明制备的MDPV羟基衍生物的质谱图。
图3:本发明制备的MDPV-BSA的紫外扫描图(1-MDPV 2-MDPV-BSA 3-BSA)。
图4:本发明一个具体实施方式中的测试条的结构示意图。
图5:本发明一个具体实施方式中的利用测试条检测尿液中MDPV含量的测试结果示意图。
详细说明
检测
检测表示化验或测试一种物质或材料是否存在，比如，但并不限于此，化学物质、有机化合物、无机化合物、新陈代谢产物、药物或者药物代谢物、有机组织或有机组织的代谢物、核酸、蛋白质或聚合物。另外，检测表示测试物质或材料的数量。进一步说，化验还表示免疫检测，化学检测、酶检测等。
亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原的合成
亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原的合成主要涉及两个关键因素，其中一个是中间体亚甲基二氧戊酮【IUPAC名称：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮】的合成，另一个是在亚甲基二氧吡咯戊酮分子结构中引入羧基(图1，图2)。
在传统的亚甲基二氧烷酮的合成方法中，一般采用以胡椒醛或胡椒环为初始原料的的合成工艺路线，例如专利申请WO9639133就是采用胡椒醛合成工艺路线的，此合成工艺路线的弊端是醛基的活泼性比氰基大，虽然都与格氏式剂反应，但副产物多，收率低，而且胡椒醛是易制毒原料，属于国家管控类化工原料，以胡椒醛为原料生产人工抗原，生产管理和库存管理程序变得复杂，以防止胡椒醛丢失或流向社会被非法制毒分子得到。美国专利US3478050在合成亚甲基二氧吡咯戊酮的工艺过程中，是以亚甲基二氧戊酮为起始原料，而亚甲基二氧戊酮不属于商业上易购的大宗化工原料，而是一种是特殊的或必须定制的医药中间体。
本发明在合成亚甲基二氧吡咯戊酮的过程中，采用的起始原料3,4-亚甲二氧苯甲腈，是化工商业市场上容易购得的化工原料，商业化抗原生产时不受原料制约，而且可以降低抗原生产的生产成本。另外，以传统的胡椒环为起始原料合成亚甲基二氧戊酮，其缺点是必需采用戊酰氯羰基合成工艺，戊酰氯毒性大，而且以无水三氯化铝为催化剂，羰基化工艺条件苛刻，反应剧烈，工业生产工艺控制难度大；而本发明采用的卤代烷格氏试剂和亚甲二氧苯腈羰基化工艺制备亚甲基二氧吡咯戊酮的合成方法避免了上述弊病。
亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原合成方法如下：制备格氏试剂的卤代烷和金属镁。以溴丁烷和金属镁为原料，在无水乙醚为介质中制备出卤代烷格试剂，再以卤代烷格试剂与和3,4-亚甲二氧苯甲腈为原料经过羰基化、卤化及吡咯醇胺基化，制备出吡咯环上连有羟基的亚甲基二氧吡咯戊酮，最后用丁二酸酐与吡咯环上羟基反应制得含有长臂羧基的半抗原(图1)。
在上述方法中，卤代烷镁格氏试剂制备方法如下：卤代烷镁格氏试剂是在无水醚介质中，金属镁屑与卤代烷在隔绝空气湿气条件下，在无水醚沸点下回流反应完成。
在一些优选的方式中，无水醚可以为二乙醚、二丙醚、二丁醚，四氢呋喃及二氧六环等，非芳烃卤代烷等种的一种或者几种。一般采用非环醚做反应介质，本发明优选二乙醚作为干醚反应介质。
在一些优选的方式中，制备格氏试剂的卤代烷可以为包括氯代烷、溴代烷或碘代烷中的一种或者几种，它们的反应活性顺序为碘代烷>溴代烷>氯代烷；碘代烷成本高，氯代烷反应活性相对较低。本发明优选溴代烷作为格氏试剂的卤代烷烃试剂。优选的，金属镁与溴丁烷的的摩尔比一般在1:1-1:1.4,本发明优选金属镁与溴丁烷的摩尔比为1：1.15。
在一些优选的方式中，当格氏试剂为溴丁烷镁格氏试剂的时候，亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂经羰基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮的方法包括如下步骤：亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂的羰基化反应需要在较高温度下进行，由于乙醚的沸点较低，需要加入高沸点溶液提高回流反应温度。芳烃类高沸点溶剂包括氯苯、甲苯、乙苯和二甲苯等，从反应惰性、沸点及毒性综合考虑本发明优选甲苯为反应介质。首先蒸出乙醚，再在甲苯沸点(110℃)下回流反应。反应混合物的酸化一般可采用盐酸、硝酸、磷酸和硫酸等无机酸，也可采用甲酸，乙酸和丙酸等有机酸，本发明优选浓硫酸为水解酸。水解需要在相对较低的温度下进行。
1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮经溴化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮在a位的溴化需要在有路易酸存在的溶剂介质中进行。溶剂包括二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃等有机溶剂，同时需要路易酸催化。本发明选用乙酸作为反应介质，既可以作为反应物的溶剂，本身又具有酸性，溶剂效应和催化效果均较佳，反应可在室温下进行。
1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮经吡咯醇胺基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮：MDPV的合成一般采用1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮的吡咯烷胺基化工艺，但合所成的MDPV分子结构中没有合适的活性基团可以构建羧基或氨基，这些基团是产生与蛋白连接的酰胺键的关键因素。本发明选用3-羟基吡咯烷代替吡咯烷，在MDPV分子结构的吡咯引入羟基，这个羟基再与长链卤代羧酸酯或羧酸酐反应产生羧基。1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮在四氢呋喃介质中，氮气保护下60度反应温度下与3-羟基吡咯烷反应3-18小时，本发明优选7小时为胺基化反应时间。1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮与3-羟基吡咯烷的反应摩尔比优选为1:1.4.
1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮经羧基化制备出带有羧基的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮与酸酐的酯化反应是在有路易碱存在的溶剂介质中进行的，路易斯碱包括三乙胺、三丁胺或吡咯及吡啶等，溶剂介质包括二氯甲烷、氯仿、甲苯或四氢呋喃等有机溶剂。
本发明选用吡啶作为反应介质，既可以作为反应物的溶剂，本身又具有碱性，溶剂效应和催化效果均较佳。长链卤代羧酸酯包括溴丁酸甲酯、溴丁酸乙酯、溴戊酸甲酯、溴戊酸乙酯、溴己酸甲酯及溴己酸乙酯等，引入的羧酸酯经水解后产生羧基。羧酸酐包括乙二酸酐、丙二酸酐、丁二酸酐及戊二酸酐等，本发明优选溴丁酸乙酯或丁二酸酐作为羧基化试剂。1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮与丁二酸酐在氮气保护下100度反应5小时，-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮与丁二酸酐的摩尔比优选为1:1.45。
亚甲基二氧吡咯戊酮的人工抗原的合成以及抗体的产生
亚甲基二氧吡咯戊酮是一个小分子，由于其分子质量小(275.3道尔顿)，只具备免疫反应性，不具备免疫原性，必须将它连结到蛋白质大分子上，借助大分子的T细胞表位刺激机体才能产生抗体特异性免疫应答。所以本发明在合成甲基二氧吡咯戊酮半抗原的基础上，制备亚甲基二氧吡咯戊酮的人工抗原。其特制备工艺过程为：甲基二氧吡咯戊酮半抗原在N,N-二甲基甲酰介质中，与N-羟基琥珀酰亚胺及N,N-环己基碳二酰亚胺在氮气保护下于室温下反应制备出活性酯，然后其活性酯在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，与载体蛋白发生偶联反应得甲基二氧吡咯戊酮人工抗原(图3)。
在一些优选的实施方式中，本发明的半抗原通过与载体蛋白的偶联而活化，带有载体蛋白的修饰性抗原具有更强的免疫活性，因为单独的小分子本身通常不具有免疫活性或免疫活性很低。偶联的载体蛋白可以是，但并不局限于血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin,KLH)、牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)、牛血红蛋白(Bovine gamma globulin,BGG)、牛甲状腺蛋白(Bovine Thyroglobulin,BTG)、抹香鲸肌球素(Sperm Whale Myoglobin,SWM)、破伤风类毒素(Tetanus Toxoid,TT)、甲基化的牛血清蛋白(Methylated Bovine Serum Albumin,mBSA)、人免疫球蛋白IgG或IgA(Human immunoglobulins IgG,IgA)或者其他现有技术的免疫原蛋白等等。
用以上偶联有活性基团的小分子可以来免疫动物，例如鼠，兔，或其他哺乳动物来生产多克隆抗体，也可以用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体，这些方法是本领域现有公知的技术，在此不再赘述，可以参见一些教科书或免疫手册来获得本发明的抗体或抗体片段(制备和使用抗体-实用手册(Making AND Using Antibodies-A practical handbook).CRCPress,2007)。当然，抗体也可以经过自然产生，也可以是经过人工合成的抗体或抗体片段。这些抗体可以特异识别人工抗原或者半抗原或者小分子物质，而不能识别其它无关的抗原或者小分子物质。这里所谓“特异性”是指该抗体仅能识别或结合某一特定类型的抗原，而不识别或结合其他类型的抗原。在本发明中，所制备的抗体只是识别亚甲基二氧吡咯戊酮；亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原，亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原，而不能识别其它小分子化学物质。
作为结合或识别亚甲基二氧吡咯戊酮、亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原或者亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的抗体可以是本发明的抗体。抗体可以是免疫球蛋白分子或部分抗原特定位点的免疫球蛋白分子，例如那些具有抗原结合位点的分子能够特异(被免疫)结合被分析物质，被分析物质的拟态物质或配体。抗体也包括人工合成的杂交抗体或者经过修饰过的抗体或抗体分子片段，包括，但不局限于，抗体片段和Fv片段。具有结合抗原功能的抗体上具有自然发生的抗体上的一些片段。一个结合片段或抗体片段包括，但不局限于，(i)Fab片段，它包括VL,VH,CL和CH1区域；(ii)Fd片段，它包括VH和CH1区域(iii)Fv片段，它包括抗体的一个单链上的VL和VH区域；(iv)dAb区域(Ward et al.,Nature341:544-546(1989)，它包括VH区域；(v)一个独立的决定簇(CDR)；(vi)一个F(ab')2片段，一个二价片段包括两个通过二硫化物在铰链区连接的Fab片段。另外，虽然这Fv片段上的两个区域是不同的基因编码所决定，人工合成的连接试剂可以让他们形成单一的蛋白链(已知的单一Fv(scFv)链)(Bird等人,Science242:423-426(1988)；和Huston等人,PNAS 85:5879-5883(1988))。蛋白片段包括那些可以交联结合他们的目标抗原的片段，例如二价片段，如F(ab')2片段。可选的，那些不能自我交联结合目标抗原的蛋白片段也可与第二抗体一起结合目标抗原。
半抗原、人工抗原，抗体的应用
本发明合成的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原或者亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原以及利用他们产生的抗体(单克隆或者多克隆)可以被用来制备利用免疫方法来检测样本中是否含有亚甲基二氧吡咯戊酮，亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原。这里的样本一般是哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液、或者哺乳动物或者人的组织样本，例如肝脏、脾等组织。这里所谓的“免疫检测方法”一般是利用抗体与抗原的结合的原理进行的免疫分析或者检测方法，这种免疫方法包括酶联免疫方法，也包括横向流动(lateral flow)测试试纸的方法，方法可以包括竞争方法。
横向流动测试试纸它可以用吸水或者非吸水性材料制成，一个测试条可以使用多种材料，用于液体的传递。测试条的一种材料可以叠加在另一种测试条材料上，例如，滤纸叠加在硝化纤维上。或者，测试条中至少含有一种材料的一个区域位于另一种至少含有一种不同材料的区域之后。在这种情况下，各区域之间液体是流通的，它们之间可以相互叠加或者不叠加。测试条上的材料可以固定在例如塑料衬片的支持物上或者硬质表面，以加强测试条可持力。测试条各区域可按如下排列：加样区，至少一个试剂区，至少一个检测结果区，至少一个控制区，至少一个掺假检测区和液体吸收区。如果检测区包括一个控制区，优选控制区位于检测结果区的被分析物检测区之后。所有这些区或其组合可以在含有一种材料的单一试纸条上。另外，这些区由不同的材料制成，并按液体传递的方向连接在一起。例如，不同区域可以直接或者间接进行液体传递。在本例子中，不同的区可以沿液体传递的方向末端和末端相连，或沿液体传递方向相互叠加，或者通过其他材料相连接，例如连接介质材料(优选吸水性材料例如滤纸，玻璃纤维，无纺布或硝酸纤维素)。在用连接材料时，连接材料能使包含各区域的末端与末端相接的材料、包含各区域的末端与末端相接但液体不流通的材料、或包含各区域相互重叠(例如但不限于从头到尾重叠)但液体不流通的材料，形成液体流通。
除此之外，也可以利用本发明的抗原制备的抗体用于免疫治疗因为亚甲基二氧吡咯戊酮引起的各种疾病，例如用于治疗亚甲基二氧吡咯戊酮成瘾的一种免疫试剂。这样就作为一种药物试剂来使用。
检测人体尿液中的亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析试剂盒
本发明的目的是提供一种检测人体尿液中的亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析试剂盒的制备方法，其步骤如下：试纸条由四部分组成，依次是：样品垫、标记垫(包被有胶体金标记或彩色胶乳微球标记的亚甲基二氧吡咯戊酮抗体的玻璃纤维)、在T线区域(检测区)包被了亚甲基二氧吡咯戊酮-BSA和在C线区域(质控区)包被了多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸水板。
亚甲基二氧吡咯戊酮MDPV检测试剂盒制备：
1)主要材料①MDPV-BSA复合物(本发明的)②抗MDPV单克隆抗体或多克隆抗体(商业购买)(③多克隆抗体④硝酸纤维素膜⑤免疫胶体金溶液⑥塑料壳(由上、下盖组成)⑦吸水板⑧PVC底板
2)硝酸纤维素膜的制备：MDPV-BSA复合物配置T线溶液，多克隆抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的检测线T线、质控线C线区域；
3)胶体金的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液0.75ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。停止加热，冷却待用。
4)免疫胶体金制备：胶体金与蛋白质(IgG)的结合：将胶体金溶液用0.1Mol/LK2CO3调pH至9.0，电磁搅拌胶体金溶液，加入抗MDPV抗体溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，通过离心纯化得到免疫胶体金标记物。
5)胶体金垫的制备：把调配好适当浓度的免疫胶体金溶液包被到玻璃纤维上。烘干。
6)样品垫的制备：将玻璃纤维浸泡在样品垫溶液中，烘干。
7)试剂盒制备：1.试剂盒的组成：本发明检测试剂盒从加样端开始依次是：样品垫、标记垫、在T线区域(检测区)包被了亚甲基二氧吡咯戊酮-BSA和在C线区域(质控区)包被了多克隆抗体优选为羊抗鼠或羊抗兔抗体的硝酸纤维素膜、吸水板四个部分。这四个部分均依次粘贴到PVC底板上，然后切割成所要求的宽度，形成试剂条。也可以按塑料壳尺寸装入设计好的塑料壳里。形成卡式试剂盒。
本组件的特征是：本发明选择使用特殊试剂处理样品垫，它可以保证产品的稳定性和可重复性。可以明显地降低非特异性背景。提高检测结果均一的特性。明显克服了由于非特异性反应引起的假阳性，因此，本发明提高了检测的灵敏度和特异性。
样品垫处理溶液的配方：0.1％BSA,0.03M PBS,0.01％表面活性剂。
具体实施例子
为了说明本发明的思想如何实现，仅仅以举例的方式来说明本发明如何实现，这些实现仅仅是在不违背本发明的精髓下的具体有限的说明，并不构成对本发明的具体限制。
实施例子1：溴丁烷镁格试剂的合成
250毫升的干燥四口瓶，安装氮气通气管、上端插有无水氯化钙干燥管的回流冷凝器及连有无水氯化钙干燥管的恒压滴液漏斗。漏斗中装有40毫升绝对干燥乙醚和7.23克的1-溴丁烷。在四口瓶中加入40毫升绝对干燥乙醚、1.15克金属镁屑及两粒碘粒。开动搅拌，氮气置换后，将1-溴丁烷乙醚溶液加到四口瓶中，半小时滴加完毕，升温回流反应3小时，然后温度降至室温。
实施例子2：(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮的合成
将5.89克的3,4-亚甲二氧苯甲腈和50毫升甲苯从恒压滴液漏斗中滴加到上步制备的格氏试剂中，1小时滴加完毕。升温蒸出乙醚后，加入30毫升甲苯，升温回流反应，反应进程由薄层色谱监测。回流反应3小时后反应结束，降至室温，加入40毫升冰水混合物和8毫升浓硫酸，水解反应后，分液，水相用100毫升乙醚萃取两次，合并有机相，用100毫升饱和食盐水洗一次，去离子水洗两次，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除溶剂得到一个油状物粗品，将这个粗品用闪色谱分离(硅胶柱洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1：9)得到6.55克(产率68％)目标物1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮。
实施例子：3-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮的合成
将6.25克1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮及30毫升乙酸加入到100毫升三口瓶中；将溶解在30毫升乙酸中的6.35克液溴加入到滴液漏斗中。在室温及磁力搅拌下将漏斗中的液溴乙酸溶液滴加到三口瓶中，30分钟滴加完毕，室温继续搅拌反应，薄层色谱点板监测反应进程。三小时后反应完成，旋转蒸发除去乙酸，加入50毫升水搅拌分散，然后转入分液漏斗中，用50毫升氯仿萃取两次，合并有机相，分别用30毫升碳酸氢钠饱和溶液洗涤一次，30毫升去离子水洗涤一次，30毫升饱和食盐水洗涤一次，然后加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去氯仿，所得粗品用闪色谱分离(硅胶柱洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:19)得到7.45克(产率87％)目标物1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮。
实施例子4：(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊 酮的合成
在100毫升干燥单口瓶中，加入6.5克1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮、60毫升四氢呋喃、7.10克无水碳酸钾及4.10克3-羟基吡咯烷，氮气保护下60度搅拌反应，薄层色谱点板监测反应进程。7小时后反应结束，加入60毫升去离子水，将反应瓶中的反应液彻底地转移到分液漏斗中，加入60毫升氯仿萃取三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除溶剂得到4.2克(产率65％)褐色泡沫状固体，为目标物1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮。
实施例子5；半抗原的合成
在100毫升干燥单口瓶中，加入3.51克1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮、60毫升无水吡啶及1.82克丁二酸酐，氮气保护下100度搅拌反应，薄层色谱点板监测反应进程。5小时后反应结束，旋转蒸发除去吡啶得到深褐色粘液，这个粗品用闪色谱分离(硅胶柱洗脱剂：甲醇：氯仿＝1:4)得到3.27克半抗原(收率69％)，如图1的技术合成图线，如图2所示，通过质谱鉴定，获得了目的半抗原。
实施例子6:半抗原活性酯合成
在25毫升干燥单口瓶中，加入106.55毫克半抗原、77.64毫克N-羟基琥珀酰亚胺、139.05毫克N,N-环己基碳二酰亚胺基和10毫升无水N,N-二甲基甲酰胺,在氮气保护下室温搅拌过夜。反应完成后,将反应混合物分装在8个1.5毫升的离心管中,10000rpm离心10分钟,将上清液装在8个1.5毫升的离心管中密封储藏备用。
实施例子7:人工抗原(MDPV-BSA偶联物)的合成
取100毫克BSA于25毫升单口瓶中，加入7.5毫升PH8.6的100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和2.5毫升DMF搅拌溶解，用冰水浴使反应混合液的温度维持在4度左右，将3.5毫升活性酯溶液缓慢地滴加到BSA溶液中，用0.5N氢氧化钠溶液随时调整反应液的PH值，维持混合液的PH值在8.5左右。滴加完毕后，将反应瓶放入4度冷室，搅拌反应过夜。反应结束后，将反应混合物转入透析袋中，对0.1M PH7.4的PBS缓冲液透析两天，然后将其冻干，得目标抗原(此抗原用作包被抗原)。
实施例子8:人工抗原(MDPV-KLH偶联物)的合成
取100毫克KLH于25毫升单口瓶中，加入9.0毫升PH8.6的100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和3.5毫升DMF搅拌溶解，用冰水浴使反应混合液的温度维持在4度左右，将4.8毫升活性酯溶液缓慢地滴加到BSA溶液中，用0.5N氢氧化钠溶液随时调整反应液的PH值，维持混合液的PH值在8.5左右。滴加完毕后，将反应瓶放入4度冷室，搅拌反应过夜。反应结束后，将反应混合物转入透析袋中，对0.1M PH7.4的PBS缓冲液透析两天，然后将其冻干，得目标抗原(此抗原用作免疫抗原)。
实施例子9:人工抗原的鉴定
本发明制备得到的亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：偶联物的结合比是指偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比，偶联比可采用分光光度法测定。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱迭加的性质。偶联物的结合比是指偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比。
分别测定载体蛋白、半抗原、偶联物在某一波长下的摩尔吸光系数(￡)，根据光谱分析中吸光度的加和性原理，依下式估算出每摩尔载体蛋白上所偶联的半抗原的摩尔数(N)。根据紫外光谱扫描结果，对照三者的紫外吸收光谱特征可以进行定性解析。
ε＝(ε偶联物-ε载体蛋白)/ε半抗原
亚甲基二氧吡咯戊酮、亚甲基二氧吡咯戊酮和牛血清蛋白的紫外扫描谱图见附图3：亚甲基二氧吡咯戊酮在波长268nm处有最大吸收，载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)在278nm处有最大吸收，亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原在274nm处有最大吸收，它与载体蛋白BSA吸收峰相比，波长发生了位移，说明亚甲基二氧吡咯戊酮与半抗原载体蛋白偶联成功。
亚甲基二氧吡咯戊酮在最大吸收峰268nm处的吸光度A1＝1.4187,亚甲基二氧吡咯戊酮人工抗原在最大吸收峰274nm处吸光度A2＝1.011，BSA的最大吸收峰278nm处的吸光度A3＝0.669。
经过鉴定，本发明亚甲基二氧吡咯戊酮-BSA偶联物的偶联比为1：14。
偶联物蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝法测定。取标准牛血清蛋白溶于PBS，配制成浓度为0,20,40,60,80,120,140ug/ml的标准液，各取标准溶液1ml加入3ml考马斯亮蓝染色液混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。计算得亚甲基二氧吡咯戊酮抗原的蛋白浓度为9.132mg/ml。
实施例子10:利用本发明的人工抗原制备检测MDPV的横流式测试条
1：样品垫制备：:将玻璃纤维浸泡在样品垫处理溶液中，然后烘干，样品垫处理溶液的配方：0.1％BSA,0.03M PBS,0.01％表面活性剂。
2：金标垫制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液0.75ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。停止加热，冷却待用。将胶体金溶液以0.1Mol/LK2CO3调pH至9.0，电磁搅拌胶体金溶液，加入抗MDPV单抗(Eastcoast HM457)继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，通过离心纯化得到免疫胶体金标记物。把调配好适当浓度的免疫胶体金溶液包被到玻璃纤维上，烘干备用。
3：硝酸纤维素膜制备：MDPV-BSA复合物(本发明)配置T线溶液，羊抗鼠IgG抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的T线、C线区域；
实施例子11:检测人尿液中亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析诊断试剂盒
检测人尿液中亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析诊断试剂盒，所述试剂盒包括1：样品垫，2：抗体标记胶体金所制备的标记垫，3：硝酸纤维素膜，4：吸水板和5：PVC底板。贴板方式如图4所示：硝酸纤维素膜检测线(T线)方向连接标记垫，质控线(C线)方向连接吸水板。金标垫压硝酸纤维素膜0.5mm。样品垫与金标标记垫相连压金标垫1/2处，下方与底板齐。吸水板压硝酸纤维素膜1mm，上端与底板齐。所述硝酸纤维膜上T线包被MDPV-BSA，C线包被羊抗鼠抗体。所述金标标记垫标记鼠抗MDPV-BSA单克隆抗体。待检测样品滴加到样品垫处，样品利用毛细效应向上层析，样品沿样品垫-标记垫-硝酸纤维素膜-吸水板方向移动，完成反应过程。
实施例子12:检测人尿液中亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析诊断试剂盒
实例12与实例11不同处为，所述金标垫标记的是兔抗MDPV-BSA多抗。质控线包被的是羊抗兔抗体。
实施例子13:检测人尿液中亚甲基二氧吡咯戊酮的免疫层析诊断试剂盒
实例13与实例11不同处为，所述金垫为彩色胶乳纳米微球标记的MDPV抗体。
检测结果判断如图示5。
取待检测尿样100ul，加在试条的样品加样区，当样品滴加到样品垫上后，尿液将因毛细层析效应作用向吸水板端层析，如果尿液中无亚甲基二氧吡咯戊酮，标记了抗亚甲基二氧吡咯戊酮抗体的胶体金颗粒将随同尿样溶液运行至膜上T线位置后，与T线包被好的亚甲基二氧吡咯戊酮载体结合物发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线位置的堆积使得在T线呈现出一条肉眼可见的粉红色线条，此为阴性结果。如果尿液中含有亚甲基二氧吡咯戊酮，它们将和T线位置包被的亚甲基二氧吡咯戊酮-BSA竞争有限的抗体结合位点，当病人尿液中的亚甲基二氧吡咯戊酮浓度达到一定量时，它将占据胶体金颗粒上标记的所有抗体结合位点，因而阻止了T线位置上所包被的亚甲基二氧吡咯戊酮-BSA与其抗体胶体金的结合，这样，T线区无线条出现，表示结果阳性，无论亚甲基二氧吡咯戊酮是否存在于尿样中，一条红色条带都会出现在质控区(C线)处，红色条带是判定是否有足够待检样品，层析过程是否符合正常的标准，同时也作为试剂盒的内控标准。一般，阳性结果：在试剂盒显示区质控线出现一条红色条带。阴性结果：在试剂盒显示区检测线和质控线各出现一条红色条带。失败结果：在试剂盒显示区检测线和质控线均无红色条带显示或仅检测线出现一条红色条带。
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本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。

Claims (22)

1.一种亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原，其结构如下的通式(1)：
其中，Z为氢原子或羰基氧原子，m为1-4碳原子。
2.根据权利要求1所述的半抗原m为1,2,3或者4个直链碳链。
3.一种亚甲基二氧吡咯戊酮的人工抗原，其结构为通式(2)所示的结构：
其中，Z为氢原子或羰基氧原子，m为1-4碳原子的直链碳链；P为载体蛋白。
4.根据权利要求3所述的人工抗原，其中，所述的载体蛋白选自于牛血清蛋白(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清蛋白(OVA)中的一种。
5.一种制备亚甲基二氧吡咯戊酮的半抗原或人工抗原的方法，其中，该方法包括中间体亚甲基二氧戊酮的合成，其中，中间体亚甲基二氧戊酮的合成是以3,4-亚甲二氧苯甲腈为起始原料开始的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，该方法进一步包括：备出卤代烷格试剂，再以卤代烷格试剂与3,4-亚甲二氧苯甲腈经过羰基化、卤化及吡咯醇胺基化，制备出吡咯环上连有羟基的亚甲基二氧吡咯戊酮，最后用丁二酸酐与吡咯环上羟基反应制得含有长臂羧基的半抗原。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，卤代烷镁格氏试剂的制备方法包括：在无水醚介质中，金属镁屑与卤代烷在隔绝空气湿气条件下，在无水醚沸点下回流反应完成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，无水醚为二乙醚、二丙醚、二丁醚，四氢呋喃及二氧六环等，非芳烃卤代中的一种或者几种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，采用非环醚做反应介质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，二乙醚作为干醚反应介质。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，卤代烷可以为包括氯代烷、溴代烷或碘代烷中的一种或者几种。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的卤代烷为溴代烷。
13.根据权利要求7所述的方法，其中，所述的卤代烷为溴丁烷，金属镁与溴丁烷的摩尔比一般在1:1-1:1.4。
14.根据权利要求7所述的方法，其中，3,4-亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂经羰基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮的方法包括：亚甲二氧苯甲腈和溴丁烷镁格氏试剂首先在醚和甲苯混合介质中反应，蒸发出乙醚后再在甲苯沸点下回流反应一定时间，反应完成后反应混合物经酸化、水解、纯化得目标产品。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮经溴化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)戊-1-酮和溴水在乙酸介质中，反应完成后反应混合物经碱化、纯化。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮经吡咯醇胺基化制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴戊-1-酮与3-羟基吡咯烷在四氢呋喃介质中，氮气保护下60度反应一定时间，反应完成后反应混合物经纯化得目标产品。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，制备1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮经羧基化制备出带有羧基的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原的方法包括：1-(苯并[D][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(3-羟基吡咯烷-1-基)-1-戊酮与酸酐在吡啶介质中酯化反应，氮气保护下100度反应一定时间，反应完成后反应混合物经纯化得含有长臂羧基的亚甲基二氧吡咯戊酮半抗原。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，该方法进一步包括制备甲基二氧吡咯戊酮人工抗原的合成的方法，该方法包括：在甲基二氧吡咯戊酮半抗原的基础上偶联蛋白制备的。
19.一种抗体，其中，该抗体是用如权利要去1-4中所述的半抗原或者抗原免疫动物而获得的。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中，所述的抗体为单克隆抗体或者多抗。
21.根据权利要求19所述的抗体，其中，所述的动物为哺乳动物。
22.一种检测样本中是否含有亚甲基二氧吡咯戊酮的试剂盒，其中，该试剂盒包括：如权利要求1-4中所述的半抗原或者抗原，或者权利要求19-21所述的抗体。
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