CN108273060B - Otub2及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OTUB2及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以L02细胞为实验对象，分别构建OTUB2过表达和OTUB2敲低L02细胞模型，然后经过棕榈酸/油酸（PA/OA）刺激后，进行油红O染色。染色结果表明：与phage对照组相比，OTUB2过表达组染色加深，OTUB2敲低组染色变浅。这表明OTUB2基因过表达后，会促进脂肪堆积，加剧脂肪肝的发生；而OTUB2基因敲除后，会抑制脂肪堆积，能够改善脂肪肝的发生。因此，OTUB2为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

OTUB2及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种去泛素化酶OTUB2作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝药物中的应用，以及OTUB2的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中应用。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高，饮食结构也发生了很大的变化，逐渐趋向于高蛋白、高脂肪。肝脏在机体脂肪代谢中占有重要地位，其参与脂质代谢过程中的多个重要环节，包括脂肪酸的摄取与合成，脂质的加工、贮存、氧化分解及输出。当肝脏获得脂肪酸的量超过其处理能力，造成脂质以甘油三酯的形式沉积于肝细胞内，导致肝细胞脂肪变性，成为单纯性肝脏脂肪变性、进而发展成为非酒精性脂肪性肝炎，部分患者可进展为肝纤维化、肝硬化、甚至肝癌。近年来，脂肪肝的发病率日益增高，发病群体也日趋年轻化，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病。目前，尚无防治脂肪肝的特效药物。所以寻找制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物的新靶点，就显得尤为重要。

OTUB2(OTU deubiquitinase,ubiquitin aldehyde binding 2)属于去泛素化酶OTU家族成员，含有OTU结构域，具有去泛素化酶活性^[1][2]。在免疫炎症反应中，它可以负调控由病毒诱导的Ⅰ型干扰素信号通路，当OTUB2表达量增多时，会通过对TRAF3/6的去泛素化，来抑制病毒激活的NF-κB信号通路^[3]。近年来，不断有研究证实OTUB2在DNA损伤修复中也发挥了重大作用。如在DNA双链断裂(DDR)早期应答中，OTUB2可以抑制由RNF8(E3泛素连接酶，当DNA双链断裂时，可以招募DDR因子，诱发染色质重塑，使细胞得以存活)介导的L3MBTL1泛素化以及Lys 63-连接泛素链的形成，从而可以轻微调整DNA双链断裂引发的泛素化的速度，以便细胞选择更合适的DNA损伤修复途径^[4]。此外，也有研究表明，OTUB2的消耗，也可以短暂的激活G2检查点，从而降低细胞对衰老的敏感性。但OTUB2在脂肪肝中的作用目前暂未报道。

参考文献：

[1].Nanao M H,Tcherniuk S O,Chroboczek J,et al.Crystal structure ofhuman otubain 2[J].EMBO Rep,2004,5(8):783-788.

[2].Komander D,Barford D.Structure of the A20OTU domain andmechanistic insights into deubiquitination.[J].Biochem J,2008,409(1):77-85.

[3].Li S,Zheng H,Mao A P,et al.Regulation of Virus-triggeredSignaling by OTUB1-and OTUB2-mediated Deubiquitination of TRAF3and TRAF6[J].JBiol Chem,2010,285(7):4291-7.

[4].Kato K,Nakajima K,Ui A,et al.Fine-tuning of DNA damage-dependentubiquitination by OTUB2supports the DNA repair pathway choice.[J].Mol Cell,2014,53(4):617.

[5].Johmura Y,Yamashita E,Shimada M,et al.Defective DNA repairincreases susceptibility to senescence through extension of Chk1-mediated G2checkpoint activation[J].Sci Rep,2016,6:31194.

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种OTUB2基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因OTUB2的新用途，进而把OTUB2基因应用于脂肪肝的治疗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以L02细胞为实验对象，分别构建OTUB2过表达和OTUB2敲低L02细胞模型，然后经过棕榈酸/油酸(PA/OA)刺激后，进行油红O染色。染色结果表明：与phage对照组相比，OTUB2过表达组染色加深，OTUB2敲低组染色变浅。这表明OTUB2基因过表达后，会促进脂肪堆积，加剧脂肪肝的发生；而OTUB2基因敲除后，会抑制脂肪堆积，能够改善脂肪肝的发生。

在此基础上，本发明第一方面，提供OTUB2作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。

本发明第二方面，提供OTUB2作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

本发明第三方面，提供OTUB2的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述OTUB2的抑制剂是抑制OTUB2蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制OTUB2的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

优选的，所述抑制OTUB2蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括OTUB2的抗体、抑制OTUB2蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制OTUB2蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合OTUB2但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合OTUB2。

优选的，所述OTUB2的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。

如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。

优选的，抑制OTUB2的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制OTUB2的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

本发明的药物可施用于会发生或已经发脂肪肝及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。

本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现OTUB2的新功能，即OTUB2具有恶化脂肪肝的作用。

(2)基于OTUB2在恶化脂肪肝中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物提供靶标。

(3)OTUB2抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物。

附图说明

图1是稳转细胞系L02-OTUB2-phage-3×flag的WB鉴定结果图。

图2是过表达OTUB2细胞油红O染色结果图；A为phage细胞对照组，B为过表达OTUB2细胞组，C为验证过表达OTUB2组。

图3是稳转细胞系L02-siOTUB2的WB鉴定结果图。

图4是L02-siOTUB2细胞油红O染色结果图；A为siNC细胞对照组，B为siOTUB2#S1细胞组，C为siOTUB2#S2细胞组，D为siOTUB2#S1+S2细胞组。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

L02：人肝细胞系，购自中国科学院细胞库，目录号GNHu6。

HEK293T：人胚肾细胞，购自中国科学院细胞库，目录号GNHu43。

细胞培养于DMEM高糖培养基(含10％FBS)中。培养环境：37℃，5％CO2。

实验用质粒：

Phage：pHAGE-CMV-MCS-PGK puro N-HA+C-Flag

psPAX2：Addgene，12260

pMD2.G：Addgene，12259

OTUB2-phage-3×flag：受赠于李红良教授实验室

实验用siRNA：

引自：Kato K,Nakajima K,Ui A,et al.Fine-tuning of DNA damage-dependentubiquitination by OTUB2 supports the DNA repair pathway choice.[J].Mol Cell,2014,53(4):617.

siOTUB2#S1：CAGAGUGCCUCGGACCACA

siOTUB2#S2：CAUCCUUUAUGCAGCCGAU

实验用方法：

一.稳转细胞系(L02-phage、L02-OTUB2-phage-3×flag)的构建：

选用的系统是pHAGE-puro+psPAX2+pMG2.G.

1、慢病毒的培养

(1)转染所需材料

a.产病毒细胞系：239T

b.选用转染试剂：装盟Zlip2000(ZC302)

c.质粒：目的质粒(phage、OTUB2-phage-3×flag)、pMD2.G、psPAX2。

(2)产病毒流程

铺细胞：转染前一天开始培养293T细胞，使每孔细胞预计在铺板后第二天的细胞汇聚度为50％以上。

转染：转染时为3种质粒共同转染，每孔质粒用量为2.4μg，分别为：1.2μg目的质粒+0.6μg psPAX2+0.6μg pMD2.G。phage以及OTUB2-phage-3×flag各转染两个孔，同时设置一孔空白对照，一孔转染试剂对照。转染后4～6h换液。

2、慢病毒的收集

(1)第一次收集：在转染48h后，可以收集293T细胞悬液，并用0.45μg的滤膜过滤(不可低于此孔径)，收集滤液，病毒即在滤液中。然后给293T细胞加入新鲜的完全培养基，继续培养。

(2)第二次收集：24h后可再次收集一次病毒。收集后的病毒可放在-80℃一个月，用的时候需放在冰上慢融。也可以在转染239T后一天将待感染的细胞铺板，后在收集第一批病毒的同时即可进行第一次感染。

3、细胞的感染

(1)L02细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。

(2)第一次感染：将病毒液与待感染的L02细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μg病毒液+2mL完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/ml)，使其终浓度为8μg/ml。混匀后，常温，1400g，离心1.5h(离心时做好保护，防污染)。

(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染24h。

(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。注意在铺待感染细胞时，需要多铺一孔空白细胞，作为加药筛选时的空白对照。

4、加药筛选细胞

第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(本次使用终浓度为1μg/ml)，待空白孔细胞全部死亡后，将六孔板中细胞传代至T25培养瓶，一般空白细胞在24～48h后死亡。待细胞长满后，可收取一部分细胞做WesternBlot验证过表达，同时也可冻存部分细胞。

二、Western Blot

1.细胞中蛋白提取

细胞加入RIPA裂解液，裂解完成后超声，离心取上清，运用BCA Protein AssayKit定量收集蛋白样品。

2.上样与电泳

配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，点样完成后开始电泳。

3.转膜

①配制转膜液，于4℃预冷。

②裁剪合适大小的NC膜备用。

③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，按“三明治结构”将凝胶平铺在负极的滤纸上，将NC膜覆盖其上，夹上夹板。

④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。

⑤转膜槽接通电源，电流设为0.3A，转移40min。

⑥转移结束后，取出NC膜。

4.封闭

把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。

5.一抗孵育

①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次10min。

②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗，OTUB2 Antibody(AVIVA，OAAB19740)。

③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。

6.二抗孵育

①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次10min，回收一抗。

②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司，BF03008/BF03008X)的二抗稀释液中，室温孵育1h。

7.蛋白检测

孵育后用TBST洗涤3次，每次10min。利用胶片检测目的条带。

三、siRNA的转染

实验用转染试剂：PepMute^TMsiRNA Transfection Reagent，购自美国Signagen(货号SL100566)

细胞系：L02

根据转染试剂说明书来操作，转染48h后收样，WesternBlot来检测其敲除效果。

四、油红O染色

1.取出细胞观察状态，密度。

2.吸出培养基，加PBS漂洗3次，洗净后尽量吸干PBS。

3.4％多聚甲醛固定，37℃，15min。

4.固定结束后，吸弃甲醛。加入PBS漂洗3次，每次3分钟，使用平动的摇床。

5.准备60％异丙醇，异丙醇：PBS＝3:2

6.加入60％异丙醇作用30s。

7.用PBS洗3次。

8.超净台内吹干水分，水分完全干透后，皿底呈白色。

9.准备油红O的工作液，Red Oil：PBS＝3:2配置。油红配置好后室温静置10min，然后用0.45μM滤器过滤，即可使用。

10.吹干后加工作液，染色过程中及时观察，达到要求后吸弃染色液。

11.用PBS洗3次。

12.加PBS浸润拍照观察。

【实施例1】稳转细胞系L02-phage以及L02-OTUB2-phage-3×flag的构建以及验证

构建验证结果如图1：内源性的OTUB2大小为27KDa，同时用本体抗体和标签抗体来检测，与vector对照组相比，可明显看出过表达细胞系构建成功。

【实施例2】过表达OTUB2对L02细胞脂肪堆积的影响

细胞处理：过表达OTUB2细胞系及对照组phage细胞贴壁后，饥饿12h，然后用0.25/0.5mM PA/OA处理24h后进行油红染色。

染色结果如图2A、2B：与对照组phage相比，过表达OTUB2细胞系染色明显加深。该结果说明：过表达OTUB2，可以明显的促进脂肪堆积。

【实施例3】L02-siRNA转染及western blot检测

细胞处理：L02细胞分为5组，一组为空白细胞，另外四组分别转染siNC对照、siOTUB2#S1、siOTUB2#S2、siOTUB2#S1+S2。细胞贴壁后，生长至可转染密度时，转染siRNA，24h后再转染一次，转染48h后收样，然后Western Blot来检测其敲低效果。

结果如图3：与L02空白细胞以及siNC对照组相比，实验组的OTUB2表达量明显下降。该结果表明，siOTUB2是有效的。

【实施例4】敲低OTUB2对L02细胞脂肪堆积的影响

细胞处理：L02细胞分为4组，分别转染siNC对照、siOTUB2#S1、siOTUB2#S2、siOTUB2#S1+S2。细胞贴壁后，生长至可转染密度时，转染siRNA，24h后再转染一次，转染siRNA 36h后，用0.1/0.2mM PA/OA处理12h后进行油红染色。

染色结果如图4：与对照组siNC相比，OTUB2敲低组染色明显变浅。该结果说明：敲低OTUB2，可以明显的抑制脂肪堆积。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> OTUB2及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagagugccu cggaccaca 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cauccuuuau gcagccgau 19

Claims (1)

1.OTUB2作为药物靶标在筛选预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗非酒精性脂肪肝药物是抑制OTUB2表达的药物，所述的药物具有抑制肝脏脂质蓄积的功能。

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