CN108272767A - 一种含有卡介菌多糖核酸的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以卡介菌多糖核酸和多烯磷脂酰胆碱为活性成分的肠溶缓释制剂，主要用于预防和治疗肝损伤疾病。该缓释口服固体制剂以卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱为药用活性成分，与药学上可接受的辅料制成。该组合物在肠道中溶解并延缓药品的释放速度，避免了胃酸对卡介菌多糖核酸、多烯磷脂酰胆碱活性成份的影响，也避免了长期服药对胃粘膜造成刺激，减少服药引起的恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应。该组合物可以协同有效的发挥药物疗效，显著优于单用同剂量卡介菌多糖核酸或多烯磷脂酰胆碱的效果，具有增强治疗效果、减少药品的服用次数、改善用药顺应性等特点。

Description

一种含有卡介菌多糖核酸的药物组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种以卡介菌多糖核酸和多烯磷脂酰胆碱为主要活性成分的药物组合物及制备方法，该药物组合物主要用于预防和治疗肝损伤疾病。

背景技术

肝脏具有分泌、排泄、合成、生物转化及免疫等多种生理功能，是重要的人体器官。病毒、药物、酒精等都可以导致肝细胞损伤，严重肝损伤能导致肝功能衰竭。肝损伤是多种肝脏疾病共有一种病理状态，其长期存在往往是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生的最重要的始动因素。肝炎病毒是最为常见的致肝损伤原因，其中乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关，主要是通过诱导宿主产生针对病毒感染肝细胞的免疫应答，继而损伤肝脏细胞。我国是乙肝大国，中国的慢性乙肝病人中，约25％-40％最终将死于肝硬化或合并肝癌。药物性肝病是指在药物的治疗量内，肝脏因受药物及其代谢产物作用而发生的功能和结构的损害，可发生于以往无肝病史的健康者或者原来就有严重疾病的患者。药物性肝损伤也有由免疫机制参与介导而引起，譬如药物或其代谢产物所引起的肝脏损伤激发的免疫反应及药物过敏反应。我国的结核病位居全球第二位，治疗结核病时多选用以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇为主的联合化疗方案，而这些抗结核药物对肝脏有较强的毒副作用，其发生率高达10-20％，占所有药物性肝损害的8-13％。患者往往被迫停用抗痨药而造成结核杆菌耐药性的增加和治疗的失败。因此肝损伤的预防与治疗对乙肝、结核、肝硬化、肝癌的预防和干预治疗有重要意义，有效控制并治疗肝细胞损伤，将会大大改善广大肝病患者的预后。

多烯磷脂酰胆碱(Polyene Phosphatidyl choline)是从大豆中高度浓缩提取的一种磷脂，含有丰富易吸收利用的多种多价不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸和油酸)。多烯磷脂酰胆碱通过淋巴或血液途径最先到达肝脏，并渗入细胞和亚细胞膜内，以整个分子主动地和肝细胞膜及细胞器膜相结合，保护肝脏细胞结构及对磷脂有依赖的酶系统。多烯磷脂酰胆碱为肝脏提供了大量的高能量合成性重要磷脂，对已破坏的肝细胞膜进行生理性修复，提高细胞膜的流动性与稳定性，让肝功能和酶活力由损伤回复正常，并使肝脏的能量失调得以缓解，从而促进肝细胞的再生。多烯磷脂酰胆碱还可以从组成细胞骨架，减少氧应激与脂质过氧化，抑制肝细胞凋亡，降低炎症反应和抑制肝星状细胞活化等多个方面发挥对肝脏的保护作用，增加肝细胞膜对病毒、药物、毒物和自由基的防御能力，临床上用于各种类型的肝病、脂肪肝、胆汁阻塞等的治疗。

卡介菌多糖核酸内含有多糖核酸等多种具有免疫活性的物质，能通过调节机体内的细胞免疫、体液免疫、刺激网状内皮系统、激活单核一巨噬细胞功能，增强自然杀伤细胞功能来增强机体抗病能力。通过增强体内巨噬细胞和NK细胞活性，诱导干扰素形成，故有增强抗感染和促进肝损伤修复的作用。

然而，多烯磷脂酰胆碱易氧化，对光、热敏感，水溶液性质不稳定，作为注射剂时，一般不允许与其它注射液混合注射，作为普通胶囊剂时，需用足够量的液体送服，不能咀嚼，有时会使患者产生胃肠道紊乱、恶心、腹泻等不适，针对这些问题，多烯磷脂酰胆碱的肠溶制剂、软胶囊制剂、胃溶制剂等相继开发，如CN101045062A中公开了一种多烯磷脂酰胆碱的肠溶制剂及其制备方法；卡介菌多糖核酸在胃酸中容易失效，目前其主要给药途径为注射，其口含片、喷雾剂等剂型也相继开发；CN101926772A公开了一种卡介菌多糖核酸脂质组合物及冻干制剂，提高了稳定性和疗效；CN101926771A公开了一种酰化支链淀粉修饰卡介菌多糖核酸口服兽用脂质体及其冻干制剂，采用酰化支链淀粉修饰多糖和核酸脂质体，改善了常规脂质体磷脂双分子层保护效果不佳、不能有效给药的缺点，进一步提高了药物体内稳定性和疗效。

二者虽然都具有促进肝损伤修复的作用，但检索现有技术结果显示目前尚无卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱以合适的方式组合而得的药物组合物，二者因为性质差异非常大，二者以何种方式组合、二者的组合是否具有较好的防治效果以及安全性等均难以预料，也未见相关研究。

发明内容

本发明的目的提供一种以卡介菌多糖核酸和多烯磷脂酰胆碱为主要活性成分的药物组合物，主要用于预防和治疗肝损伤疾病。

一种药物组合物，含有如下重量份的成分：

卡介菌多糖核酸原粉 1-30份多烯磷脂酰胆碱 500-600份

进一步的，一种药物组合物，含有如下重量份的成分：

本发明所述药物组合物可制备成肠溶缓释制剂，制剂规格为100-1000mg。剂型包括但不限于肠溶缓释片、肠溶缓释胶囊、肠溶缓释颗粒剂。

上述药物组合物中所加抗氧化剂选自以下物质中的一种或多种：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲、维生素类抗氧剂、氨基酸类抗氧剂、硫代乙酸、叔丁基对羟基茴香醚、二丁甲苯酚、没食子酸丙酯或生育酚等。

上述药物组合物中所加缓释材料，选自以下物质中的一种或多种：羟丙基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、醋酸纤维素、聚羧乙烯类、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、山榆酸甘油酯、十六醇、十八醇、山萮酸甘油酯、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、巴西棕榈蜡等。为调节药物释放速度，可以选择不同的缓释辅料，添加或调整缓释药用辅料的组成及配比。

上述药物组合物中所加肠溶材料，选自以下物质中的一种或多种：括醋酸纤维素酞酸酯(CAP)、聚乙烯醇酞酸酯(PVAP)、聚乙二醇、聚丙烯酸树脂、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸纤维素苯三酸酯(CAT)、羟丙甲纤维素酞酸酯(HPMCP)等。

上述药物组合物中还可以含有其他药学可接受的其他药用辅料，所述药用辅料为以下物质中的一种或多种：致酸剂，粘合剂，填充剂，稀释剂，渗透压调节剂，吸附剂，色素，染料，崩解剂，分散剂，密封剂，助流剂，硬化剂，渗透增强剂，反乳化剂，稳定剂，润滑剂，增塑剂，增溶剂、致孔剂、润湿剂等，用于调剂口感，外观及成型。

所述的粘合剂，选自以下物质中的一种或多种：淀粉、明甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、乙基纤维素、胶、木糖、乳糖、合成胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素、水、蜡、醇等。

所述的增溶剂，选自以下物质中的一种或多种：酒石酸、聚乙二醇、柠檬酸等。

所述的润滑剂，选自以下物质中的一种或多种：滑石粉、硬脂酸镁、氢化植物油、聚乙二醇、微分硅胶、硬脂酸钙、硬脂酸等。

所述的增塑剂，选自以下物质中的一种或多种：丙二醇、邻苯二甲酸酯、蓖麻油、甘油、聚乙二醇、甘油三醋酸酯、乙酰单甘油酸酯等。

所述的致孔剂，选自以下物质中的一种或多种：木糖、乳糖、甘露醇、淀粉、滑石粉、二氧化硅、水溶性盐类。

本发明的第二个目的是提供该药物组合物的制备方法：

(1)缓释片剂或缓释颗粒剂的制备方法包括如下步骤：

将缓释材料作为缓释的骨架掺和到成型的其他辅料中按相应的制粒工艺制备，制粒后干燥、整粒成颗粒或进一步压片，再在制得的缓释颗粒或压制的缓释片上包上肠溶材料即得肠溶缓释片剂或肠溶缓释颗粒剂；

(2)缓释肠溶胶囊的制备方法包括如下步骤：

将缓释材料作为缓释的骨架掺和到成型的其他辅料中按相应的制粒工艺制备，制粒后干燥、整粒成颗粒，填入到肠溶胶囊中即得。

本发明第三个目的是提供本发明所述药物组合物的用途，所述药物组合物在制备治疗肝损伤药物中的应用。

以下通过细胞实验证明本发明对肝细胞损伤的保护作用的有益效果。

1人肝细胞株L-02在37℃，5％CO₂条件下用DMEM培养液(补加10％胎牛血清、2mmol/mL谷氨酰胺和100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素)培养，2d换液传代1次。取对数生长的细胞,台盼蓝染色后在显微镜下检查，细胞活力>95％可进行实验。取生长状态良好的L-02细胞以5×10⁶/mL密度接种24孔培养板上培养至对数生长期。共分为8个实验组：空白组(仅加培养基)、正常组(未做任何处理的单独L-02细胞)、损伤组、不同浓度卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱保护组(3组)、多烯磷脂酰胆碱组(500μg)、卡介菌多糖核酸组(25μg)，每组实验设3个复孔。对数生长期的细胞更换500μl DMEM培养液，其中卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱保护组分别加入卡介菌多糖核酸终浓度为2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL的DMEM培养液500μl(其中含多烯磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL)，多烯磷脂酰胆碱组加入含多烯磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL的DMEM培养液500μl，卡介菌多糖核酸组加入卡介菌多糖核酸终浓度为50μg/mL的DMEM培养液500μl。各组保护作用12小时后使用无血清DMEM洗两遍，然后加四氯化碳(CCl₄)损伤(损伤浓度为6μmol/ml)。损伤4小时后收集各组细胞，以反复冻融法获得细胞裂解液。按照丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒操作步骤检测细胞上清液中ALT指标。

表1各组小鼠血清中ALT含量(n＝3，)

ALT是肝细胞受损最敏感的指标之一，当肝细胞受损后细胞膜通透性增加，胞浆中的ALT释放出胞，该指标的高低与肝细胞的受损呈正比关系。与正常对照组相比CCl₄损伤组的ALT值显著增高，经过不同浓度实验组药物(卡介菌多糖核酸终浓度为2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL，多烯磷脂酰胆碱浓度为1mg/mL)干预后，L-02细胞上清ALT水平则显著降低，且与介菌多糖核酸终浓度成相关性。表明卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱的药物组合物具有保护肝细胞膜、对抗肝损伤的作用。其中保护组药物(多糖核酸25μg、多烯磷脂酰胆碱500μg)相比单独的多烯磷脂酰胆碱组(500μg)与卡介菌多糖核酸组(25μg)能显著的降低L-02细胞上清ALT水平。说明卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱的药用组合物，能够预防和治疗肝损伤疾病，相对于单用起到显著效果。

本发明的有益效果：

(1)本发明解决了卡介菌多糖核酸与多烯磷脂酰胆碱二者性质差异大、难以协同合用的技术难点，开发出一种新的药物组合物；

(2)本发明所述药物组合物以协同有效的发挥药物疗效，显著优于单用同剂量卡介菌多糖核酸或多烯磷脂酰胆碱的效果，缩短了用药周期；

(3)本发明肠溶缓释技术，让该组合物在肠道中缓慢释放，减少了对肠道的刺激，避免了胃酸对卡介菌多糖核酸、多烯磷脂酰胆碱活性成份的影响，也避免了长期服药对胃环境的影响而产生恶心、恶油、呕吐、上消化道和胃部不适等副作用，而且改变了普通口服制剂的吸收程序和状态，达到了肠部释放和集中吸收的目的，不仅能改善制剂的生物利用度，也可使食物对肠溶制剂药物效能的影响大大减小。

(4)本发明所得药物制剂安全、可靠，副作用小。

附图说明

图1实施例1所制备的肠溶缓释片在人工胃肠液中的累计释放曲线

具体实施方式：

本发明所需的卡介菌多糖核酸原粉(精制的卡介菌多糖核酸提取物)可通过按照2010版中国药典第二增补版P400-401记载的制备，也可以通过如下方法获得，但本领域技术人员可以理解卡介菌多糖核酸的制备包括但并不限于此种方法：

卡介菌多糖核酸原粉的制备详述如下：

1)卡介菌的培养和收获

1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃连续培养14-20天；或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃连续培养14-20天。

2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。

2)卡介菌多糖核酸的制备

1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30～100℃)，在低速搅拌中保温30分钟～1小时。

2.卡介菌多糖核酸的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液，台式离心机高速离心后，取上清加入等体积酚/氯仿(1:1)，涡旋混匀后13000rpm离心2min，取上清经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合液。

3)精制卡介菌多糖核酸原粉的制备

采用美国密里博(MILLIPORE)公司制造的K-PRIME 40Ⅱ凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖、核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。具体的制备过程如下：

(1)打开主机及监控电脑，将系统预热20至30分钟，并检查管道，柱体是否畅通完好，是否存在气泡。

(2)平衡：用0.9％生理盐水以1000mL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、pH一致时结束平衡过程。

(3)上样：将卡介菌多糖核酸提取液经上样系统进行上样，上样速度为600mL/分钟。

(4)洗脱：上样结束后，用0.9％生理盐水以800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的核酸目的峰通过0.45μm无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。

(5)清洗：洗脱后用注射用水对系统进行清洗直至柱前、柱后电导接近于零时为止。

将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为精制卡介菌多糖核酸原粉。

实施例1

肠溶缓释片，处方为：

制成1000粒肠溶缓释片

制备方法为：将亚硫酸钠、羟丙基甲基纤维素、淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁分别过80目筛后备用，按处方量称取羟丙基甲基纤维素、淀粉、微晶纤维素置混合机中混匀后，再与处方量卡介菌多糖核酸原粉和多烯磷脂酰胆碱按等量递增法混匀，加入适量的4％聚乙烯吡咯烷酮和75％乙醇溶液，制粒、整粒后于60℃干燥，干颗粒加入处方量的硬脂酸镁混匀，用摇摆式颗粒机过16目筛网整粒，对颗粒进行含量测定，并确定片重范围，压片得缓释片，用85％乙醇调配含肠溶材料醋酸纤维素酞酸酯的包衣粉备肠溶包衣液，再在所得缓释片上包上肠溶衣，检查合格后包装得到1000粒肠溶缓释片。

(一)动物急性毒性试验

选用6～8周龄，体重20～24g的SPF级健康C57BL/6小鼠，雌雄各半。在恒温、安静、相对避光的环境中饲养3天，按随机数字表法将小鼠随机均分为4组：正常对照组、实验组(口服实施例1中肠溶缓释片)，每组10只。用药前6h禁食不禁水。按卡介菌多糖核酸60mg/kg，多烯磷脂酰胆碱40g/kg的含量将实施例1中的制剂经口染毒，连续观察7天。观察期内各试验组均无小鼠死亡，活动、进食、行为等均正常，无中毒症状。观察期满处死动物,尸体剖检未发现组织或脏器有明显异常改变。

(二)胃肠液中溶出试验

取实施例1肠溶缓释片，按中国药典2010年版释放度测定法第二法，采用溶出度测定法桨法的装置和条件。配制pH 1.2的盐酸溶液模拟人工胃液作为溶出介质500mL，2h后，取溶液作为供试品溶液测定卡介菌多糖、卡介菌核酸、多烯磷脂酰胆碱的释放度。并迅速将杯中溶液换成预先热至37℃的pH 6.8的磷酸盐缓冲液模拟人工肠液，继续溶出，2、4、6、8、10小时分别测定卡介菌多糖、卡介菌核酸、多烯磷脂酰胆碱在不同时间的累积释放度。本实验平行6份。

试验结果：实施例1中肠溶缓释片在酸液中浸泡2h几无溶出，而在pH 6.8的磷酸盐溶液中12h释放了92％以上,符合肠溶制剂的要求。实施例1肠溶缓释片在人工胃液中几乎不释放，避免了对胃部刺激，在人工肠液中开始缓慢释放，避免了局部药物浓度过高引起的肠道粘膜刺激。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于含有如下重量份的成分：

卡介菌多糖核酸原粉 1-30份

多烯磷脂酰胆碱 500-600份

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，含有如下重量份的成分：

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，含有如下重量份的成分：

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物制备成肠溶缓释制剂。

5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于所述抗氧化剂选自以下物质中的一种或多种：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲、维生素类抗氧剂、氨基酸类抗氧剂、硫代乙酸、叔丁基对羟基茴香醚、二丁甲苯酚、没食子酸丙酯或生育酚。

6.按照权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于所述缓释材料选自以下物质中的一种或多种：羟丙基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基纤维素、醋酸纤维素、聚羧乙烯类、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、山榆酸甘油酯、十六醇、十八醇、山萮酸甘油酯、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、巴西棕榈蜡。

7.按照权利要求2或3所述的肠溶药物组合物，其特征在于所述肠溶材料选自以下物质中的一种或多种：醋酸纤维素酞酸酯(CAP)、聚乙烯醇酞酸酯(PVAP)、聚乙二醇、聚丙烯酸树脂、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸纤维素苯三酸酯(CAT)、羟丙甲纤维素酞酸酯(HPMCP)。

8.按照权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于还可以含有其他药学可接受的药学辅料，所述药学辅料为致酸剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、渗透压调节剂、吸附剂、色素、染料、崩解剂、分散剂、密封剂、助流剂、硬化剂、渗透增强剂、反乳化剂、稳定剂、润滑剂、增塑剂、增溶剂、致孔剂、润湿剂中的一种或多种。

9.权利要求2或3所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：

(1)缓释片剂或缓释颗粒剂的制备方法包括如下步骤：

将缓释材料作为缓释的骨架掺和到成型的其他辅料中按相应的制粒工艺制备，制粒后干燥、整粒成颗粒或进一步压片，再在制得的缓释颗粒或压制的缓释片上包上肠溶材料即得肠溶缓释片剂或肠溶缓释颗粒剂；

(2)缓释肠溶胶囊的制备方法包括如下步骤：

将缓释材料作为缓释的骨架掺和到成型的其他辅料中按相应的制粒工艺制备，制粒后干燥、整粒成颗粒，填入到肠溶胶囊中即得。

10.权利要求1-3任一权利要求所述的药物组合物的用途，其特征在于所述药物组合物在制备治疗肝损伤药物中的应用。