CN108271623B - 一种培养基、固体菌根制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种培养基、固体菌根制剂及其制备方法。使用所述培养基，能够促进乳牛肝菌的生长，极大地利于采用乳牛肝菌为微生物菌种的菌根制剂的制备。使用所述培养基和乳牛杆菌制备得到的乳牛肝菌固体菌根制剂，能够极大地提高松类树种根系对水、肥的吸收能力和抗病能力。

Description

一种培养基、固体菌根制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于真菌培养及其应用技术领域，具体涉及一种培养基、固体菌根制剂及其制备方法。
背景技术
微生物菌剂是指目标微生物(有效菌)经过工业化生产扩繁后，利用多孔的物质作为吸附剂(如草炭、蛭石)，吸附菌体的发酵液加工制成的活菌制剂。这种菌剂用于拌种或蘸根，具有直接或间接改良土壤、恢复地力、预防土传病害、维持根际微生物区系平衡和降解有毒害物质等作用。农用微生物菌剂恰当使用可以提高农产品产量、改善农产品品质、减少化肥用量、降低成本、改良土壤、保护生态环境。
菌根制剂作为微生物菌剂的一种，其中的微生物能够和植物的根系共生形成菌根，能够大幅度提高植物根系对水、肥的吸收能力，扩大吸收面积，分解吸收土壤中不易被根系直接吸收的营养物质，从而提高树体抗旱、耐瘠薄的能力。
但目前的微生物菌剂，特别是菌根制剂的制备方法较为繁复，常规发酵培养技术一般需经过一级摇瓶培养、二级摇瓶培养、种子罐培养、液体发酵罐培养或固体发酵罐培养等环节，经回收菌体后形成液体制剂或固体制剂，生产工艺较繁琐，而且大规模的发酵罐培养存在场地、设备、环境要求高，投入高，液体制剂包装、运输要求高等缺点。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种培养基、固体菌根制剂及其制备方法。使用所述培养基，能够促进乳牛肝菌的生长培养，极大地利于采用乳牛肝菌为微生物菌种的菌根制剂的生产。使用所述培养基和乳牛杆菌制备得到的乳牛肝菌固体菌根制剂，能够极大地提高松类树种根系对水、肥的吸收能力和抗病能力。
本发明的目的是提供一种用于培养乳牛杆菌，特别是乳牛杆菌菌株(Suilluslakei)生长的培养基。
本发明的再一目的是提供一种使用所述培养基的乳牛肝菌固体菌根制剂的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种乳牛肝菌固体菌根制剂。
本发明的培养基，以1升培养基为例，所述培养基包括以下重量的组分：
NH4Cl：0.4-0.6g、KH2PO4:0.4-0.6g、MgSO4.7H2O:0.4-0.6g、维生素H:4.0-6.0微克、维生素B1:0.8-1.2微克、FeCl3：1.5-2.5微克、ZnSO4.7H2O:0.8-1.2微克、MnSO4.H2O：0.4-0.6微克、葡萄糖：4.0-6.0g、琼脂粉：15-25克、蒸馏水定容至1000ml。
优选的，所述培养基，以1升培养基为例，包括以下重量的组分：
NH4Cl：0.5g、KH2PO4:0.5g、MgSO4.7H2O:0.5g、维生素H:5.0微克、维生素B1:1.0微克、FeCl3：2.0微克、ZnSO4.7H2O:1.0微克、MnSO4.H2O：0.5微克、葡萄糖：5.0g、琼脂粉：20克、蒸馏水定容至1000ml。
本发明还公开了一种乳牛肝菌固体菌根制剂的制备方法，所述制备方法使用所述培养基对乳牛肝菌进行培养。
根据本发明的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
A、菌种采集：采集乳牛肝菌的菌丝；
B、一级菌种培养：将步骤A得到的菌丝置于所述培养基上进行一级种子培养，培养5-7周后，得到一级菌种；
C、二级菌种培养：将所述培养基加入到固体培养基质中得到固体培养基，将步骤B得到的一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，培养5-7周后，得到二级菌种；
D、制备固体菌根制剂：将所述培养基加入到蛭石上得到固体发酵培养基，将步骤C得到的二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，培养10-12周后，得到所述固体菌根制剂。
根据本发明的制备方法，其中，步骤A中，采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放4-6个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝。
根据本发明的制备方法，其中，步骤B中，菌丝在25℃恒温黑暗的环境下进行一级菌种培养。
根据本发明的制备方法，其中，步骤C中，使用广口玻璃瓶为培养容器；所述固体培养基的制备方法为：将蛭石和草炭按照重量比为33:1的比例混合得到所述固体培养基质，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入所述固体培养基质中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体培养基；将所述一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养5-7周后，得到二级菌种。
根据本发明的制备方法，其中，步骤D中，所述固体发酵培养基的制备方法为：用粒径大于5mm的蛭石，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入到蛭石中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体发酵培养基；将所述二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养10-12周后，得到所述固体菌根制剂。
根据本发明的制备方法，其中，步骤A提取到菌丝后，对所述菌丝进行DNA测序比对，在DNA测序比对时采用的引物为FR1和NSI，所述FR1的序列如SEQ ID NO：1所示，为：AICCAT TCA ATC GGT AIT；所述NSI的序列如SEQ ID NO：2所示，为：GTAGTCATATGCTTGTCTC。
DNA测序过程中，所使用的PCR扩增体系为：DNA(70ng/μL)、模板2μL、dNTPMixture(2.5mM)2.5μL、FR1(20μM)1.5μL、NS1(20μM)1.5μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL、ExTaq酶(5U/μL)0.2μL、补足ddH2O到50μL。
PCR扩增程序为：94℃变性3min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。
本发明还提供了一种乳牛肝菌固体菌根制剂，所述乳牛肝菌固体菌根制剂采用上述的制备方法制备而成。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种用于培养乳牛杆菌的培养基，使用所述培养基，能够促进乳牛肝菌的生长培养，极大地利于采用乳牛肝菌为微生物菌种的菌根制剂的生产。
2、本发明提供了一种使用所述培养基的菌根制剂的制备方法，采用上述制备方法制得的所述固体菌根制剂，能够与松类树种根系结合后形成菌根，能大幅度提高松类树种根系对水、肥的吸收能力，扩大吸收面积，分解吸收土壤中不易被根系直接吸收的营养物质，从而提高树体抗旱、耐瘠薄的能力。
3、所述制备方法，对乳牛肝菌依次经过一级菌种培养、二级菌种培养和发酵培养，并且，在每次培养中使用不尽相同的培养基质，设定不同的培养环境，既保证了乳牛肝菌的正常生长，又能够得到固体形态的产品。
4、所述固体菌根制剂还能够分泌生长刺激素，促进生根，提高地下部与地上部的生长；形成菌根后，可以拮抗其它有害微生物的侵染，从而提高抗病能力；形成菌根后，通过菌根菌的不断繁殖，增加了土壤中有益菌类的含量，改变土壤的理化性质，达到改良土壤的作用。
5、所述固体菌根制剂采用固体发酵，自主呼吸，不用通氧及补液，发酵载体采用轻型无机物，重量轻，不易污染，制剂成品易于包装及运输，常温(20℃)下保存时间较长；使用所述固体菌根制剂，能够大幅度提高苗木质量和合格苗产量，提高造林成活率和保存率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例为所述培养基与PDAM、HM和MRD培养基对乳牛肝菌的对比培养试验。
以1升培养基为例，所述培养基包括以下重量的组分：
NH4Cl：0.5g、KH2PO4:0.5g、MgSO4.7H2O:0.5g、维生素H:5.0微克、维生素B1:1.0微克、FeCl3：2.0微克、ZnSO4.7H2O:1.0微克、MnSO4.H2O：0.5微克、葡萄糖：5.0g、琼脂粉：20克、蒸馏水定容至1000ml。
采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放4-6个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝。
将菌丝分别置于所述培养基、PDAM、HM和MRD培养基中，在25℃恒温黑暗的环境下进行培养，观察不同培养基上菌落生长状况。不同培养基上菌落的生产状况如表1所示。
表1：不同培养基上菌落生长状况
Figure BDA0001569613920000061
试验结果表明：在所述培养基上，菌落生长最好，培养7天时菌落平均直径可达2.0cm，14天时菌落直径可达4.6cm，第二次继代培养14天时菌落平均直径达到6.1cm，远好于其他培养基。
实施例2
一种乳牛肝菌固体菌根制剂，其制备方法包括以下步骤：
A、菌种采集：采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放4个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝；
B、一级菌种培养：将步骤A得到的菌丝置于所述培养基上，在25℃恒温黑暗的环境下进行一级种子培养，培养7周后，得到一级菌种；
C、二级菌种培养：使用广口玻璃瓶为培养容器；所述固体培养基的制备方法为：将蛭石和草炭按照重量比为33:1的比例混合得到所述固体培养基质，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入所述固体培养基质中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体培养基；将所述一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养5周后，得到二级菌种；
D、制备固体菌根制剂：所述固体发酵培养基的制备方法为：用粒径大于5mm的蛭石，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入到蛭石中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体发酵培养基；将所述二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养12周后，得到所述固体菌根制剂。
本实施例中，所述培养基以1升培养基为例，包括以下重量的组分：NH4Cl：0.4g、KH2PO4:0.6g、MgSO4.7H2O:0.4g、维生素H:6.0微克、维生素B1:0.8微克、FeCl3：2.5微克、ZnSO4.7H2O:0.8微克、MnSO4.H2O：0.6微克、葡萄糖：4.0g、琼脂粉：25克、蒸馏水定容至1000ml。
使用所述固体菌根制剂进行松树造林的肥料添加剂，造林成活率为95％，造林保存率为92％，高于不添加所述固体菌根制剂的造林成活率(92％)和造林保存率(90％)。
实施例3
一种乳牛肝菌固体菌根制剂，其制备方法包括以下步骤：
A、菌种采集：采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放6个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝；
B、一级菌种培养：将步骤A得到的菌丝置于所述培养基上，在25℃恒温黑暗的环境下进行一级种子培养，培养5周后，得到一级菌种；
C、二级菌种培养：使用广口玻璃瓶为培养容器；所述固体培养基的制备方法为：将蛭石和草炭按照重量比为33:1的比例混合得到所述固体培养基质，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入所述固体培养基质中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体培养基；将所述一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养7周后，得到二级菌种；
D、制备固体菌根制剂：所述固体发酵培养基的制备方法为：用粒径大于5mm的蛭石，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入到蛭石中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体发酵培养基；将所述二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养10周后，得到所述固体菌根制剂。
本实施例中，所述培养基以1升培养基为例，包括以下重量的组分：NH4Cl：0.6g、KH2PO4:0.4g、MgSO4.7H2O:0.6g、维生素H:4.0微克、维生素B1:1.2微克、FeCl3：1.5微克、ZnSO4.7H2O:1.2微克、MnSO4.H2O：0.4微克、葡萄糖：6.0g、琼脂粉：15克、蒸馏水定容至1000ml。
使用所述固体菌根制剂进行松树造林的肥料添加剂，造林成活率为94％，造林保存率为92％，高于不添加所述固体菌根制剂的造林成活率(92％)和造林保存率(90％)。
实施例4
一种乳牛肝菌固体菌根制剂，其制备方法包括以下步骤：
A、菌种采集：采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放5个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝；
B、一级菌种培养：将步骤A得到的菌丝置于所述培养基上，在25℃恒温黑暗的环境下进行一级种子培养，培养6周后，得到一级菌种；
C、二级菌种培养：使用广口玻璃瓶为培养容器；所述固体培养基的制备方法为：将蛭石和草炭按照重量比为33:1的比例混合得到所述固体培养基质，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入所述固体培养基质中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体培养基；将所述一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养6周后，得到二级菌种；
D、制备固体菌根制剂：所述固体发酵培养基的制备方法为：用粒径大于5mm的蛭石，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入到蛭石中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体发酵培养基；将所述二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养11周后，得到所述固体菌根制剂。
本实施例中，所述培养基以1升培养基为例，包括以下重量的组分：NH4Cl：0.5g、KH2PO4:0.5g、MgSO4.7H2O:0.5g、维生素H:5.0微克、维生素B1:1.0微克、FeCl3：2.0微克、ZnSO4.7H2O:1.0微克、MnSO4.H2O：0.5微克、葡萄糖：5.0g、琼脂粉：20克、蒸馏水定容至1000ml。
本实施例中，在步骤A提取到菌丝后，对所述菌丝进行DNA测序比对，已验证得到的菌丝为乳牛杆菌。在DNA测序比对时采用的引物为FR1和NSI，所述FR1的序列如SEQ ID NO：1所示，为：AIC CAT TCA ATC GGT AIT；所述NSI的序列如SEQ ID NO：2所示，为：GTAGTCATATGCTTGTCTC。
DNA测序过程中，所使用的PCR扩增体系为：DNA(70ng/μL)、模板2μL、dNTPMixture(2.5mM)2.5μL、FR1(20μM)1.5μL、NS1(20μM)1.5μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL、ExTaq酶(5U/μL)0.2μL、补足ddH2O到50μL。
PCR扩增程序为：94℃变性3min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。
DNA测序结果显示，得到的rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，经对比发现，相似菌株为Suillus lakei，登录号为DQ534692.1，二者相似度为99％。
使用所述固体菌根制剂进行松树造林的肥料添加剂，造林成活率为96％，造林保存率为93％，高于不添加所述固体菌根制剂的造林成活率(92％)和造林保存率(90％)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种乳牛肝菌固体菌根制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法由以下步骤组成：
A、菌种采集：采集乳牛肝菌的菌丝；
B、一级菌种培养：将步骤A得到的菌丝置于培养基上进行一级种子培养，培养5-7周后，得到一级菌种，
使用以下培养基对乳牛肝菌进行培养，以1升培养基为例，所述培养基包括以下重量的组分：
NH4Cl：0.4-0.6g、KH2PO4:0.4-0.6g、MgSO4·7H2O:0.4-0.6g、维生素H:4.0-6.0微克、维生素B1:0.8-1.2微克、FeCl3：1.5-2.5微克、ZnSO4·7H2O:0.8-1.2微克、MnSO4·H2O：0.4-0.6微克、葡萄糖：4.0-6.0g、琼脂粉：15-25克、蒸馏水定容至1000ml；
C、二级菌种培养：将所述培养基加入到固体培养基质中得到固体培养基，将步骤B得到的一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，培养5-7周后，得到二级菌种；
D、制备固体菌根制剂：将所述培养基加入到蛭石上得到固体发酵培养基，将步骤C得到的二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，培养10-12周后，得到所述固体菌根制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以1升培养基为例，所述培养基包括以下重量的组分：
NH4Cl：0.5g、KH2PO4:0.5g、MgSO4·7H2O:0.5g、维生素H:5.0微克、维生素B1:1.0微克、FeCl3：2.0微克、ZnSO4·7H2O:1.0微克、MnSO4·H2O：0.5微克、葡萄糖：5.0g、琼脂粉：20克、蒸馏水定容至1000ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中，采集松树具有菌根的根段，用流水冲净表面泥土，用灭菌纱布包裹，置30％H2O2中浸泡10分钟，将纱布包取出，用无菌蒸馏水冲洗3次，将根段在消毒滤纸上吸干表面水分后，用无菌镊子将根段移入盛有PDA培养基的培养皿中，置于25℃的恒温培养箱中培养，每个培养皿放4-6个根断；一周后，收集菌根上长出的具有锁状联合的菌丝。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，菌丝在25℃恒温黑暗的环境下进行一级菌种培养。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中，使用广口玻璃瓶为培养容器；所述固体培养基的制备方法为：将蛭石和草炭按照重量比为33:1的比例混合得到所述固体培养基质，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入所述固体培养基质中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体培养基；将所述一级菌种接种在所述固体培养基表面进行二级菌种培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养5-7周后，得到二级菌种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述固体发酵培养基的制备方法为：用粒径大于5mm的蛭石，将所述培养基按照体积比为1:2的比例加入到蛭石中，经121℃、0.11MPa高温高压灭菌60分钟后自然冷却至室温后，得到所述固体发酵培养基；将所述二级菌种接种在所述固体发酵培养基表面进行发酵培养，在25℃恒温黑暗的环境下培养10-12周后，得到所述固体菌根制剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A提取到菌丝后，对所述菌丝进行DNA测序比对，在DNA测序比对时采用的引物为FR1和NSI，所述FR1的序列为：AICCATTCAATCGGTAIT；所述NSI的序列为：GTAGTCATATGCTTGTCTC。
8.一种乳牛肝菌固体菌根制剂，其特征在于，所述乳牛肝菌固体菌根制剂采用权利要求1-7任一所述的制备方法制备而成。
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