CN108267416A - 一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统及方法，该系统包括血样处理模块、循环肿瘤细胞检测模块、数据处理模块和结果输出模块，所述循环肿瘤细胞检测模块集成有用于对细胞进行太赫兹检测的太赫兹光谱仪。本发明主要通过不同有核细胞的太赫兹特征光谱实现CTCs的准确识别和区分，是一种低成本无标记无损检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞检测技术领域，特别是涉及一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统及方法。
背景技术
癌症的早期诊断可以极大的提高患者生存率治和治愈率。CTC即“循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell)”，是由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞。临床研究证实，肿瘤在1-2毫米早期时，虽然影像学等传统手段是检测不出来的，但血液中即可检出CTC。CTC已被ASCO(美国临床肿瘤学会，American Society of ClinicalOncology)归为肿瘤标志物，监测CTC类型和数量变化的趋势，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。然而目前还未有任何商业化产品。第一个也是唯一经过美国食品药品监督管理局(FDA)和中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准，用于恶性肿瘤疾病管理的检测CTC的商业化产品，强生公司CellSearch循环肿瘤细胞检测系统自2016年初开始停止销售，2015年底生产即已告停。CTCs检测分为以下两个步骤，(1)尽可能多的从患者的外周血中捕获CTCs；(2)尽可能的动用现有的或在研的生化、物理等检测方法对捕获的肿瘤细胞进行个体化分析。其难点在于CTCs含量特别低，一般患者10ml血液中存在数量为1-10个细胞；另外，目前已证实循环肿瘤细胞有15个分型，采用免疫方法漏检率特别高，并且为满足精准医疗，还需无损检测。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统及方法，用于解决现有技术中循环肿瘤细胞检测的检漏率高、易对细胞造成电离损伤等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统，包括血样处理模块、循环肿瘤细胞检测模块、数据处理模块和结果输出模块，所述血样处理模块用于从待测血样中分离得到有核细胞，所述循环肿瘤细胞检测模块用于对有核细胞进行太赫兹检测，所述数据处理模块用于对检测信息进行数据分析，所述结果输出模块用于显示分析结果；所述循环肿瘤细胞检测模块集成有用于对细胞进行太赫兹检测的太赫兹光谱仪。
在本发明的一些实施例中，所述数据处理模块集成有太赫兹光谱处理分析算法，所述太赫兹光谱处理分析算法包括太赫兹时域光谱的特征提取和对比分析，特征提取包括细胞太赫兹时域光谱的相位、幅值、计算所得的折射率、介电性质，对比分析将所提取的特征与数据库进行对比，并结合细胞光学成像图片结果，从而实现对所测试细胞类别的归类识别。
在本发明的一些实施例中，样品折射率n(f)计算公式如下：
其中，分别为Iref和Is进行傅里叶变换后获得的相位信息，Iref和Is分别代表所能捕获的参考信号和样品信号的透过能量，c代表光速，d代表太赫兹穿透样品的厚度，f代表频率；
消光系数κ(f)的计算公式如下：
其中ρ(f)是Is和Iref傅里叶变换的振幅比，n(f)代表折射率，f代表频率；
吸收系数α的计算公式如下：
在本发明的一些实施例中，所述血样处理模块集成有用于截留有核细胞的微通孔滤膜。
在本发明的一些实施例中，细胞碎片直径、红细胞直径＜滤膜孔径＜有核细胞直径，有核细胞包括肿瘤细胞、白细胞，使得细胞碎片、红细胞被除去，截留有核细胞进行太赫兹检测。
在本发明的一些实施例中，所述滤膜的过滤孔直径为7-9μm。
在本发明的一些实施例中，所述血样处理模块还集成有进样针筒、生化反应池、红细胞裂解液储备池、清洗液储备池和机械臂，所述红细胞裂解液储备池、清洗液储备池分别通过阀门与生化反应池相连，所述机械臂用于取出含有有核细胞的过滤芯片并将其转移至循环肿瘤细胞检测模块的电动样品台。
在本发明的一些实施例中，所述红细胞裂解液储备池、清洗液储备池体积≥500mL。
在本发明的一些实施例中，所述循环肿瘤细胞检测模块还集成有光学显微镜、成像CCD、电动样品台、近场探针和控制器，所述光学显微镜、成像CCD用于对细胞进行显微成像，所述控制器完成细胞测量后将测量数据发送至数据处理模块。
在本发明的一些实施例中，所述数据处理模块集成有细胞显微图像识别算法，用于对细胞进行空间定位，通过获取细胞边界和中心灰度变化进行细胞显微图像识别，从而准确获取每个细胞的形状和空间坐标。
在本发明的一些实施例中，所述数据处理模块还集成有细胞统计算法，用于在细胞显微图像识别算法和太赫兹光谱处理分析算法处理后的结果基础之上，进行结果统计，以获得循环肿瘤细胞的类别分布和各类别的数量，然后分析出患者癌症转移的风险大小。
在本发明的一些实施例中，所述数据处理模块还集成有数据库。
在本发明的一些实施例中，所述结果输出模块集成有循环肿瘤细胞测试结果的直接显示区和统计分析结果显示区，所述直接显示区用于显示循环肿瘤细胞检测模块中的测量结果，所述统计分析结果显示区用于显示细胞统计算法计算得到的统计分析结果。
本发明第二方面提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查的方法，包括如下步骤：
1)提供含有有核细胞的血液样品；
2)对血液样品中的有核细胞定位，获得有核细胞的光学显微图像；
3)对对应具有光学显微图像的有核细胞进行太赫兹光谱检测，获得透过细胞的太赫兹时域光谱信息；
4)判断捕获太赫兹时域光谱信息的细胞对应的参考，获得参考太赫兹时域光谱信息；
5)分析计算获得过滤后血液样品中所有有核细胞的太赫兹特征光谱信息；
6)结合细胞光学显微成像特征，比对构建形成的不同组织分类学人体细胞太赫兹特征光谱数据库，筛查血液样品中循环肿瘤细胞，确定数目并判断种类。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，采用微通孔过滤芯片过滤，获得含有有核细胞的血液样品。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，过滤前，采用红细胞裂解液对血液样品进行生化反应处理。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，血液样品进入生化反应池的体积为5mL。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，采用过滤孔直径为7-9μm的滤膜过滤得到含有有核细胞的血液样品。
如上所述，本发明的一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统及方法，具有以下有益效果：本发明主要通过不同有核细胞的太赫兹特征光谱实现CTCs的准确识别和区分，是一种低成本无标记无损检测方法。
附图说明
图1显示为本发明实施例中基于太赫兹光谱的CTCs筛查系统框图，框图间的连线表示组成系统的各模块间的关系。
图2显示为本发明实施例中利用本发明系统检测获得的肺癌CTCs细胞光学显微镜成像结果图。
图3显示为本发明实施例中利用本发明系统检测获得的图2对应细胞的太赫兹时域光谱图。
图4显示为本发明实施例中利用本发明系统检测获得的图2对应细胞的太赫兹频率光谱图。
图5显示为本发明实施例中两种不同细胞时域光谱时间延迟特征图。
图6显示为本发明实施例中两种不同细胞时域光谱振幅特征图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为避免现有技术中CTCs免疫富集和检测存在的检出率低、假阳性和免疫试剂的高成本问题，本发明提供了一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统。太赫兹波是频率在0.1-10THz的电磁波，核酸、蛋白、糖类和脂类生物大分子之间/内的弱相互作用力(氢键、范德华力)、骨架振动和偶极子旋转等，正好处于THz频谱范围。通过生物大分子在THz频谱范围内所特有的THz光谱指纹(即：特征吸收峰、吸收系数和折射率等)，可实现生物大分子的定性分析。不同类型的肿瘤细胞可通过差异性生物分子太赫兹光谱特征进行区分。太赫兹生物医学检测已经成为当前受到极大重视的交叉前沿学科。本发明所提供的系统利用微通孔芯片实现对血液中CTCs的富集，然后利用太赫兹光谱的特异性并结合细胞的光学成像特征区分不同种类的细胞，在排除微通孔芯片富集后残留的红细胞和白细胞后，准确比对一定体积的血液样品中CTCs的数量和类型，协助癌症诊断。
本发明提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统，包括血样处理模块、循环肿瘤细胞检测模块、数据处理模块和结果输出模块，血样处理模块用于从待测血样中分离得到有核细胞，具体集成了血液自动进样针筒、生化池、微通孔过滤芯片、红细胞裂解液、清洗液和机械臂，血液处理模块为现有技术，本领域技术人员通过购买现有设备及部件进行组装连接即可得到，循环肿瘤细胞检测模块用于对有核细胞进行太赫兹检测，数据处理模块用于对检测信息进行数据分析，结果输出模块用于显示分析结果；循环肿瘤细胞检测模块集成有用于对细胞进行太赫兹检测的太赫兹光谱仪。血样处理模块将血液样品中的白细胞和红细胞裂解并截留有核细胞后，循环肿瘤细胞检测模块对有核细胞进行光学显微成像以及太赫兹光谱检测，系统自动将数据实时传输到数据处理模块(即分析模块)中，分析模块首先对细胞太赫兹时域光谱的振幅及相位特征信息进行分析，而后对时域光谱进行傅里叶变化，计算得到折射率、介电等信息，然后将处理后的数据与系统中的数据库进行比对。数据库包含所有红细胞、白细胞(种类固定)的太赫兹光谱和部分CTCs细胞的太赫兹光谱，若分析结果显示所测细胞属于正常的血细胞，则该细胞不再标记，结果不统计，若分析结果显示所测细胞属于数据库中已有的CTCs细胞，则对该细胞进行标记，并进行类别和数量统计，若分析结果显示所测细胞不属于数据库中的任何细胞，则对该细胞进行标记和单独归类，并统计数量。
数据处理模块集成有太赫兹光谱处理分析算法，太赫兹光谱处理分析算法包括太赫兹时域光谱的特征提取和对比分析，特征提取包括细胞太赫兹时域光谱的相位、幅值、计算所得的折射率、介电性质，对比分析是将所提取的特征与数据库进行对比，并结合细胞光学成像图片结果，从而实现对所测试细胞类别的归类识别。
血样处理模块集成有用于截留有核细胞的微通孔滤膜，细胞碎片直径、红细胞直径＜滤膜孔径＜有核细胞直径，有核细胞包括肿瘤细胞、白细胞，使得细胞碎片、红细胞被除去，截留有核细胞进行太赫兹检测。优选地，滤膜的过滤孔直径为7-9μm。
血样处理模块还集成有进样针筒、生化反应池、红细胞裂解液储备池、清洗液储备池和机械臂，红细胞裂解液储备池、清洗液储备池分别通过阀门与生化反应池相连，机械臂用于取出含有有核细胞的过滤芯片并将其转移至循环肿瘤细胞检测模块的电动样品台。
红细胞裂解液储备池、清洗液储备池体积≥500mL。
循环肿瘤细胞检测模块还集成有光学显微镜、成像CCD、电动样品台、近场探针和控制器，光学显微镜、成像CCD用于对细胞进行显微成像，控制器完成细胞测量后将测量数据发送至数据处理模块。
数据处理模块集成有细胞显微图像识别算法和数据库，细胞显微图像识别算法用于对细胞进行空间定位，通过获取细胞边界和中心灰度变化进行细胞显微图像识别，从而准确获取每个细胞的形状和空间坐标。
数据处理模块还集成有细胞统计算法，用于在细胞显微图像识别算法和太赫兹光谱处理分析算法处理后的结果基础之上，进行结果统计，以获得循环肿瘤细胞的类别分布和各类别的数量，然后分析出患者癌症转移的风险大小。
结果输出模块集成有循环肿瘤细胞测试结果的直接显示区和统计分析结果显示区，直接显示区用于显示循环肿瘤细胞检测模块中的测量结果，统计分析结果显示区用于显示细胞统计算法计算得到的统计分析结果。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统，该系统由血样处理模块、循环肿瘤细胞检测模块、数据处理模块和结果输出模块构成；血样处理模块集成了血液自动进样针筒、生化池、微通孔过滤芯片、红细胞裂解液、清洗液和机械臂，血样处理模块具体可参照申请公布号为CN 106754720A的中国专利《一种循环肿瘤细胞富集与显微成像样本制作装置》，本实施例的裂解液Solarbio,Red Blood Cell Lysis,货号：R1010；清洗液Solarbio,1×PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，货号：P1020；微通孔过滤芯片的孔径为8μm；循环肿瘤细胞检测模块集成有光学显微镜、成像CCD、三维电动样品台、太赫兹光谱仪、近场探针和控制器，数据处理模块集成有细胞显微图像识别算法、太赫兹光谱处理分析算法、细胞统计算法和数据库；结果输出模块集成有循环肿瘤细胞测试结果的直接显示区和统计分析结果显示区。该系统的工作过程如下：
(1)将从癌症患者身上采集的静脉血放入检测系统入口，系统的血样处理模块自动抽取5mL血液，加入进样口，然后系统加入红细胞裂解液，自动震荡混匀，保持8分钟，此时血液中绝大部分红细胞和白细胞被裂解。控制裂解后的液体进入过滤区，通过微通孔芯片进行过滤，过滤完成后系统加入缓冲液冲洗，再过滤，使裂解残渣被彻底过滤，此时几乎全部的有核细胞和少量血细胞碎片被截留在微通孔芯片表面。
(2)系统控制微通孔芯片与血液处理模块分离，将其自动转移到CTCs检测模块中三维电动样品台上固定。
(3)通过控制样品台移动，CTCs检测模块通过图像识别对芯片表面的细胞进行自动对焦，然后进行光学显微成像，通过细胞图像识别自动获取每一个细胞的形状、空间位置。
(4)系统对成像的细胞依次自动进行太赫兹光谱检测，系统根据光学成像结果依次将各个细胞的中心定位到太赫兹光斑的焦点处，一次测量的积分时间为80ps。
(5)每获得一个细胞的太赫兹光谱后，系统自动将数据实时传输到分析模块中，分析模块首先对细胞太赫兹时域光谱的振幅及相位特征信息进行分析，而后对时域光谱进行傅里叶变化，计算得到折射率、介电等信息，然后将处理后的数据与系统中的数据库进行比对。数据库包含所有红细胞、白细胞(种类固定)的太赫兹光谱和部分CTCs细胞的太赫兹光谱；癌细胞判断依据如下：时域光谱振幅与参考的差异区间：0.04-0.20皮秒；时域光谱相位与参考的差异区间：10-30毫伏；折射率：2.5-4(@1THz)；吸收系数：225-400cm-1(@1THz)；介电：6-13(real,@1THz)；3-8(imaginary,@1THz)；结合光学显微成像分析综合考量。判断依据包含但不仅限于上述参数及范围。
若分析结果显示所测细胞属于正常的血细胞，则该细胞不再标记，结果不统计，若分析结果显示所测细胞属于数据库中已有的CTCs细胞，则对该细胞进行标记，并进行类别和数量统计，若分析结果显示所测细胞不属于数据库中的任何细胞，则对该细胞进行标记和单独归类，并统计数量。
太赫兹吸收系数或折射率的计算都是基于以上参考信号和样品信号的傅里叶变换得到的相应太赫兹频域波形、振幅等信息获得，样品折射率n(f)计算公式如下：
其中，分别为Iref和Is进行傅里叶变换后获得的相位信息，Iref和Is分别代表所能捕获的参考信号和样品信号的透过能量，c代表光速，d代表太赫兹穿透样品的厚度，f代表频率；
消光系数κ(f)的计算公式如下：
其中ρ(f)是Is和Iref傅里叶变换的振幅比，n(f)代表折射率，f代表频率；
吸收系数α的计算公式如下：
(6)完成所有细胞测试与分析后，将所有统计结果通过显示模块显示到屏幕上，包括CTCs和未知细胞的光学显微图像(如附图2所示)和对应的太赫兹时域光谱图像(如附图3所示)，统计分析患者5ml血液中CTCs的数目为40±5个。
图4显示为本发明实施例中利用本发明系统检测获得的图2对应细胞的太赫兹频率光谱图；图5显示为本发明实施例中两种不同细胞时域光谱时间延迟特征图；图6显示为本发明实施例中两种不同细胞时域光谱振幅特征图。从光谱特征可以发现，通过时域光谱峰值位置的偏移(图5、图6)即可区分两种细胞，而现有的拉曼光谱需要进行数值分析(参考文献：Distinguishing Different Cancerous Human Cellsby Raman SpectroscopyBased on DiscriminantAnalysis Methods)。
本发明通过微通孔芯片实现CTCs的初步富集，然后主要通过不同有核细胞的太赫兹特征光谱实现CTCs的准确识别和区分，是一种低成本无标记无损检测方法。
综上所述，本发明通过太赫兹检测，显著降低检漏率和误检率，无需消耗生化试剂，有效避免昂贵试剂的使用，不会对细胞造成电离损伤，无需大量人工操作，便于临床应用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于，包括血样处理模块、循环肿瘤细胞检测模块、数据处理模块和结果输出模块，所述血样处理模块用于从待测血样中分离得到有核细胞，所述循环肿瘤细胞检测模块用于对有核细胞进行太赫兹检测，所述数据处理模块用于对检测信息进行数据分析，所述结果输出模块用于显示分析结果；所述循环肿瘤细胞检测模块集成有用于对细胞进行太赫兹检测的太赫兹光谱仪。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：所述数据处理模块集成有太赫兹光谱处理分析算法，所述太赫兹光谱处理分析算法包括太赫兹时域光谱的特征提取和对比分析，特征提取包括细胞太赫兹时域光谱的相位、幅值、计算所得的折射率、介电性质，对比分析将所提取的特征与数据库进行对比，并结合细胞光学成像图片结果，从而实现对所测试细胞类别的归类识别。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于，样品折射率n(f)计算公式如下：
其中，分别为Iref和Is进行傅里叶变换后获得的相位信息，Iref和Is分别代表所能捕获的参考信号和样品信号的透过能量，c代表光速，d代表太赫兹穿透样品的厚度，f代表频率；
消光系数κ(f)的计算公式如下：
其中ρ(f)是Is和Iref傅里叶变换的振幅比，n(f)代表折射率，f代表频率；
吸收系数α的计算公式如下：
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：所述血样处理模块集成有用于截留有核细胞的微通孔滤膜。
5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：细胞碎片直径、红细胞直径＜滤膜孔径＜有核细胞直径，优选地，所述滤膜的过滤孔直径为7-9μm。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：所述血样处理模块还集成有进样针筒、生化反应池、红细胞裂解液储备池、清洗液储备池和机械臂，所述红细胞裂解液储备池、清洗液储备池分别通过阀门与生化反应池相连，所述机械臂用于取出含有有核细胞的过滤芯片并将其转移至循环肿瘤细胞检测模块的电动样品台。
7.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：所述循环肿瘤细胞检测模块还集成有光学显微镜、成像CCD、电动样品台、近场探针和控制器，所述光学显微镜、成像CCD用于对细胞进行显微成像，所述控制器完成细胞测量后将测量数据发送至数据处理模块。
8.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞筛查系统，其特征在于：所述数据处理模块集成有细胞显微图像识别算法，用于对细胞进行空间定位，通过获取细胞边界和中心灰度变化进行细胞显微图像识别，从而准确获取每个细胞的形状和空间坐标；
和/或，所述数据处理模块还集成有细胞统计算法，用于在细胞显微图像识别算法和太赫兹光谱处理分析算法处理后的结果基础之上，进行结果统计，以获得循环肿瘤细胞的类别分布和各类别的数量，然后分析出患者癌症转移的风险大小；
和/或，所述数据处理模块还集成有数据库；
和/或，所述结果输出模块集成有循环肿瘤细胞测试结果的直接显示区和统计分析结果显示区，所述直接显示区用于显示循环肿瘤细胞检测模块中的测量结果，所述统计分析结果显示区用于显示细胞统计算法计算得到的统计分析结果。
9.一种基于太赫兹光谱的循环肿瘤细胞筛查的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供含有有核细胞的血液样品；
2)对血液样品中的有核细胞定位，获得有核细胞的光学显微图像；
3)对对应具有光学显微图像的有核细胞进行太赫兹光谱检测，获得透过细胞的太赫兹时域光谱信息；
4)判断捕获太赫兹时域光谱信息的细胞对应的参考，获得参考太赫兹时域光谱信息；
5)分析计算获得过滤后血液样品中所有有核细胞的太赫兹特征光谱信息；
6)结合细胞光学显微成像特征，比对构建形成的不同组织分类学人体细胞太赫兹特征光谱数据库，筛查血液样品中循环肿瘤细胞，确定数目并判断种类。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤1)中，采用微通孔过滤芯片过滤，获得含有有核细胞的血液样品；
和/或，步骤1)中，采用红细胞裂解液对血液样品进行生化反应处理，再采用微通孔滤膜过滤，得到含有有核细胞的血液样品；
和/或，步骤1)中，血液样品进入生化反应池的体积为5mL；
和/或，步骤1)中，采用过滤孔直径为7-9μm的滤膜过滤得到含有有核细胞的血液样品。
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