CN115541556A - 一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物，属于疾病检测技术领域。本发明提供了基于拉曼光谱检测血清中关键成分的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品中的应用；所述关键成分的峰位强度包括：总胆固醇的428cm^‑1、糖类的1127cm^‑1、脂类的1099cm^‑1、铁血红素1395cm^‑1、甲硫氨酸的642cm^‑1、组氨酸的1269cm^‑1、脯氨酸与苯基丙氨酸的1175cm^‑1的峰位强度中的一种或几种。本发明筛选了特异、显著的拉曼位移及其对应的峰强度用作诊断的生物标志物，能够帮助精准且更快的诊断类风湿关节炎。

Description

一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物

技术领域

本发明属于疾病检测技术领域，具体涉及一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一类致残率高的自身免疫病。目前RA主要依靠关节症状和自身抗体检测进行诊断，其中自身抗体包括抗瓜氨酸蛋白抗体(Anti-cyclic citrullinated peptide antibody，ACPA)和类风湿因子(Rheumatoidfactor,RF)。然而，在RA患者中仍然有部分患者缺乏自身抗体ACPA，被称为血清阴性RA患者，血清阴性RA患者只能依靠关节症状进行诊断。并且血清阴性RA患者出现的关节疼痛的症状与骨关节炎(Osteoarthritis，OA)患者的症状类似，目前判断这部分病人需要依赖丰富临床经验。OA与RA是两类发病机制与对应治疗方案完全不一样的疾病，如何有效诊断两类疾病，对患者进行对症治疗至关重要。此外，在RA发病的早期阶段，很多患者还未出现关节疼痛的症状，且自身抗体滴度低，因此诊断这部分患者的诊断也十分困难。如何采用简单、客观、便捷有效的方案诊断RA患者，减少对临床经验的依赖，从而使患者获益是目前的临床难题。

拉曼光谱是无侵入性，直接获得分子震动、转动结构信息的指纹光谱，可实现对物质结构、成分与浓度的检测。样本无需前处理，无需标记、原位无损，测定时间短且灵敏度高。基于拉曼光谱的这些优势，目前在癌症早期筛查、甲状腺恶化检测、卵母细胞分化以及耐药细菌筛查等多个领域已有运用，在不同的应用中，由于疾病特点不同，拉曼光谱作为一类指纹图谱有独特的信息。目前在自身免疫病诊断领域，拉曼光谱特征的相关工作尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物，本发明的生物标志物能够制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品，实现类风湿关节炎的准确预测或检测。

本发明提供了基于拉曼光谱检测血清中关键成分的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品中的应用；

所述关键成分的峰位强度包括：总胆固醇的428cm^-1、糖类的1127cm^-1、脂类的1099cm^-1、铁血红素1395cm^-1、氨基酸的642cm^-1、氨基酸的1269cm^-1、和氨基酸1175cm^-1的峰位强度中的一种或几种。

优选的，所述糖类包括葡萄糖；所述酯类包括十六烷酸酯；所述氨基酸包括蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸中的一种或几种。

优选的，在抗瓜氨酸蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者的血清中总胆固醇的428cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于骨关节炎患者和正常对照平均值，且达到显著水平。

优选的，在类风湿关节炎患者的血清中葡萄糖的1127cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

优选的，在类风湿关节炎患者的血清中十六烷酸酯的1099cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

优选的，在类风湿关节炎患者的血清中铁血红素的1395cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平。

优选的，在类风湿关节炎患者的血清中蛋氨酸和组氨酸的642cm^-1和/或蛋氨酸和组氨酸的1269cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平，而脯氨酸和苯丙氨酸的1175cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

优选的，所述拉曼光谱检测的条件为：532nm激光作为激发光，100X倍物镜，1200g/mm光栅，10～12mw功率，15s累积时间，光谱范围279～2187cm^-1，应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理。

本发明提供了基于拉曼光谱检测血清中关键成分的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品中的应用；所述关键成分的峰位强度包括：总胆固醇的428cm^-1、糖类的1127cm^-1、脂类的1099cm^-1、铁血红素1395cm^-1、氨基酸的642cm^-1、氨基酸的1269cm^-1、和氨基酸1175cm^-1的峰位强度中的一种或几种。本发明筛选了特异、显著的拉曼位移及其对应的峰强度用作诊断的生物标志物，能够帮助精准且更快的诊断类风湿关节炎。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为自身抗体阳性RA患者、自身抗体阴性RA患者与疾病对照骨关节炎患者以及健康对照的130份血清拉曼光谱展示图；

图2表示基于降维分析技术可视化RA与对照组之间的差异；其中，A展示通过提取不同来源血清拉曼光谱的特征峰位信息；B展示多个用于LDA分析中发挥重要影响的峰位置；

图3为拉曼谱图用于诊断类风湿关节炎及其两种疾病类型的诊断曲线；其中A为拉曼谱图用于诊断类风湿关节炎的诊断曲线；B为拉曼谱图用于诊断ACPA+类风湿关节炎的诊断曲线；C为拉曼谱图用于诊断ACPA-类风湿关节炎的诊断曲线；

图4为拉曼谱图用于诊断类风湿关节炎中特征峰的结果。

具体实施方式

本发明提供了基于拉曼光谱检测血清中关键成分的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品中的应用；

所述关键成分的峰位强度包括：总胆固醇的428cm^-1、糖类的1127cm^-1、脂类的1099cm^-1、铁血红素1395cm^-1、甲硫氨酸的642cm^-1、组氨酸的1269cm^-1、脯氨酸与苯基丙氨酸的1175cm^-1的峰位强度中的一种或几种。

本发明的方案能够检测自身抗体阴性的RA患者，通过同时获得多种生物物质信息进行精准筛查。

在本发明中，所述糖类优选的包括葡萄糖；所述酯类优选的包括十六烷酸酯；所述氨基酸优选的包括蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸中的一种或几种。

在本发明中，在抗瓜氨酸蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者的血清中总胆固醇的428cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于骨关节炎患者和正常对照平均值，且达到显著水平。

在本发明中，在类风湿关节炎患者的血清中葡萄糖的1127cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

在本发明中，在类风湿关节炎患者的血清中十六烷酸酯的1099cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

在本发明中，在类风湿关节炎患者的血清中铁血红素的1395cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平。

在本发明中，在类风湿关节炎患者的血清中蛋氨酸和组氨酸的642cm^-1和/或蛋氨酸和组氨酸的1269cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平，而脯氨酸和苯丙氨酸的1175cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

在本发明中，所述拉曼光谱检测的条件为：532nm激光作为激发光，100X倍物镜，1200g/mm光栅，10～12mw功率，15s累积时间，光谱范围279～2187cm^-1，应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种预测或辅助诊断类风湿关节炎的生物标志物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、试验过程

选取北京大学人民医院2020～2022年确诊的类风湿关节炎患者，年龄范围为55岁到70岁，女性比例达到87％，基本符合类风湿关节炎患者患病规律。样本收集过程获得性别和年龄匹配个体的130份血清样本，包括40例自身抗体ACPA阳性RA患者，30例ACPA阴性RA患者，30例骨关节炎患者用作疾病对照和30名健康个体作为健康对照。该研究经北京大学人民医院研究伦理委员会批准。RA的诊断符合2010年ACR/欧洲风湿病联盟分类标准。通过对肿胀关节、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)水平和治疗的定量，访问并记录RA患者的疾病活动度评分。排除与一种或多种情况一致的患者；(1)与其他自身免疫性疾病合并；(2)存在病毒或细菌感染；(3)肿瘤的存在。

将5μL血清样品滴在氟化钙(CaF₂)载玻片上并等待蒸发直至收缩成1μm斑点区域。选用共聚焦拉曼显微镜(LabRAM HR Evolution，Horiba)用于分析血清样品。使用532nm激发激光收集所有拉曼光谱数据，然后通过100X显微镜物镜将激光聚焦在样品上，从而形成350nm光斑。光谱采集参数设置如下：1200g/mm光栅，10～12mw功率，15积分时间，光谱范围279～2187cm^-1。在同一位置平均连续进行3次采集，以最大限度地降低噪声。为了避免任何偏差，从不同位置的随机场中采集样本。从一个样本中记录了约15个光谱，拉曼光谱的总数为1950个。然后，使用LabSpec6软件(Horiba)将原始光谱数据自动处理成一系列具有宇宙射线去除的子波段，并根据矢量变换进行平滑处理。随后，采用五阶多项式拟合法减去采集到的拉曼光谱基线并去除背景噪声。此外，去除荧光噪声以减少与拉曼数据重叠的宽背景。光谱数据按面积归一化，并给出平均±标准偏差。

模型建立：选取其中生物样本常规采集的范围300～1800cm^-1；基于每个样本采集15张谱图，获得数据的高维度，我们选用基于Kullback-leibler算法的图像提取方法，从谱图中提取特征峰数据进行LDA分析。通过降维分析，发现几个不同组的拉曼谱图明显不同cluster位置，说明几组样本的拉曼数据具有不同的特点。将获得的拉曼谱图的数据中取出70％数据用于训练集，剩下30％用于验证集，采用十倍交叉验证；训练集主要是通过计获得算不同组中拉曼谱图的峰位置与强度的特征，获得计算模型；进一步通过验证集的数据，检测获得模型用于预测和诊断疾病的准确性、特异性与敏感性。在机器学习过程中采用的是采用LDA、支持向量机(SVM)、极限梯度提升(XGBoost)和随机森林(RF)等分类器进行分析，揭示差异和计算该方法的诊断能力。

2、试验结果

1)类风湿关节炎患者、骨关节炎患者以及健康人血清中拉曼图谱分析，结果参见图1。

图1为几组样本血清拉曼图谱的展示图：从RA中ACPA+RA与ACPA-RA、OA与HC的130个样本，每个样本15个样本中1950张谱图的全部谱图进行分析，构成该数据资料。展现从300～1800cm^-1的范围内的每组样本的总血清拉曼光谱，其中实线表示为该组样本的平均值，阴影部分表示该组样本的标准差；几组样本之间形态相近，单纯依靠肉眼进行分析比较困难，因此需要借助图像提取特征算法结合机器学习建立分类模型。

本研究共获得健康对照血清拉曼特征光谱30份，ACPA阳性患者血清血清拉曼特征光谱40份，ACPA阳性患者血清血清拉曼特征光谱30份，疾病对照组骨关节炎患者血清血清拉曼特征光谱30份。图1在300～1800cm^-1的范围内可见对照组与类风湿关节炎患者血清拉曼光谱形态相近，依据上述光谱图形无法有效鉴别不同来源血清差异，因此需要建立分类模型。

2)基于有监督的线性降维判别算法可视化RA与对照组之间的差异，结果参见图2。

图2中的A表明运用有监督的线性降维判别算法(LDA)可以很好的甄别骨关节炎/类风湿关节炎与健康人的血清拉曼光谱数据。展示通过提取不同来源血清拉曼光谱的特征峰位信息，采用有监督的LDA降维分析获得不同组的特征展示，图中不同颜色的一个点代表一个样本，不同来源的样本分为明显的不同四群，利用LD1与LD2概括了因变量94％的变异信息，利用LDA方法能有效区分类风湿关节炎vs骨关节炎vs健康人。图2B展示提取出用于影响不同来源样本在LDA分类中的重要拉曼峰位。

3)通过选用130个样本中每组总样本谱图70％用作训练集共1365张谱图，30％用作验证集共计585张谱图，构成不同数据资料。分别对样本数据应用机器算法分类器，展开详细分析比较，通过判别多种分类器的分类准确性用于后续的诊断评价。结果参见表1。

表1多种机器学习方法准确性比较结果

从表1来看，通过提取拉曼光谱差异特征信息，多种分类器均可甄别骨关节炎/类风湿关节炎与健康人的血清拉曼光谱数据。

4)基于极度梯度提升分类器(XGBoost)验证拉曼光谱诊断疾病效果。使用机器学习中XGBoost分类器将从拉曼谱图提出的特征信息用于诊断几组不同的样本，发现该方法可以有效将几组样本进行区分，模型具有良好的鉴别能力，获得样本的特异性与敏感性如表2所示。

表2用于诊断类风湿关节炎的特异性与敏感性

5)拉曼谱图用于诊断类风湿关节炎及其两种疾病类型的诊断曲线，结果参见图3。ROC曲线展示血清拉曼光谱诊断类风湿关节炎尤其是两类不同的类风湿关节炎准确性高，对该疾病具有良好的诊断价值。利用血清拉曼光谱诊断所有的类风湿患者曲线下面积达到0.99(标准误差为0.014)，具有良好的诊断效能。此外，利用血清拉曼光谱诊断自身抗体阳性的类风湿患者曲线下面积达到1.0(标准误差为0.011)。诊断自身抗体阴性性的类风湿患者曲线下面积达到0.96(标准误差为0.024)，这种方法对于两类类风湿关节炎亚类同样具备良好诊断效能。

6)拉曼光谱用于诊断类风湿关节炎中特征峰，结果参见图4。对来源于ACPA+RA，ACPA-RA，OA以及HC模型中的潜在标志物进行验证。代表胆固醇的峰位428cm^-1，与OA与HC相比，ACPA+RA胆固醇水平显著升高，ACPA-RA胆固醇水平显著降低，具有统计学差异(p<0.001)。代表胶原的峰位857cm^-1，ACPA^-RA患者血清中与ACPA⁺RA、OA与HC相比显著升高(p<0.001)。已有文献表明使用糖酵解的抑制剂显著改善ACPA+RA类风湿关节炎的疾病进展，在480cm^-1峰位对应的糖原的强度，显示ACPA⁺RA患者血清中糖原水平显著高于ACPA-RA、OA与HC，而ACPA^-RA患者血清中糖原水平显著低于ACPA⁺RA、OA与HC。1127cm^-1峰位对应的葡萄糖的血清水平在两类RA中低于HC与OA，这与研究中发现RA炎性滑膜组织中的糖代谢异常的研究结果一致，也与本此次入组患者通过血生化检测结果一致。脂代谢的生物学功能主要是在能量代谢，细胞的凋亡增殖与炎症，磷脂水平与软损伤有关，血清拉曼光谱中获得的结果与文献中使用RA血清非靶向脂类代谢组学结论一致。1099cm^-1峰位对应的十六烷酸酯的在ACPA-RA患者的血清中明显降低。1044cm^-1对应的总脂类在ACPA⁺RA患者血清中显著高于ACPA-RA、OA与HC，而在ACPA^-RA低于OA、HC。1395cm^-1对应的血红素在RA中显著升高。此外与OA与HC对比，642cm^-1对应的甲硫氨酸和1269cm^-1对应的组氨酸的水平在RA患者中显著升高；1175cm^-1对应的脯氨酸与苯基丙氨酸在RA患者血清中显著降低。

综上来看，本发明利用多元降维方法PCA分析，通过聚类分析获得疾病与健康对照之间的差异。进一步联合机器学习进行分类，采用LDA、支持向量机(SVM)、极限梯度提升(XGBoost)和随机森林(RF)等分类器进行分析，揭示差异和计算该方法的诊断能力。RA患者表现出独特的拉曼光谱，其特征在于疾病进展过程中的生物分子改变。鉴别能力对RA诊断产生了97.3％的敏感性和94.8％的特异性。在ACPA阴性RA的识别中，敏感性和特异性也分别达到了95.6％和92.8％。

进一步，通过拉曼峰实现对疾病的诊断；428cm^-1对应胆固醇，ACPA阳性患者高于OA与健康人；1127cm^-1对应葡萄糖，在RA患者中明显降低；1099cm^-1对应的十六烷酸酯在RA也明显降低；1395cm^-1铁血红素在RA中明显升高；在氨基酸代谢物中，RA患者在642cm^-1和1269cm^-1处蛋氨酸和组氨酸的强度显着增加，而在1175cm^-1处脯氨酸和苯丙氨酸水平降低。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.基于拉曼光谱检测血清中关键成分的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测类风湿关节炎的产品中的应用；

所述关键成分的峰位强度包括：总胆固醇的428cm^-1、糖类的1127cm^-1、脂类的1099cm^-1、铁血红素1395cm^-1、甲硫氨酸的642cm^-1、组氨酸的1269cm^-1、脯氨酸与苯基丙氨酸的1175cm^-1的峰位强度中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖类包括葡萄糖；所述酯类包括十六烷酸酯；所述氨基酸包括蛋氨酸、组氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在抗瓜氨酸蛋白抗体阳性类风湿关节炎患者的血清中总胆固醇的428cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于骨关节炎患者和正常对照平均值，且达到显著水平。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在类风湿关节炎患者的血清中葡萄糖的1127cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于健康对照平均值，且达到显著水平。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在类风湿关节炎患者的血清中十六烷酸酯的1099cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在类风湿关节炎患者的血清中铁血红素的1395cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在类风湿关节炎患者的血清中蛋氨酸和组氨酸的642cm^-1和/或蛋氨酸和组氨酸的1269cm^-1的拉曼峰的峰位强度高于正常对照平均值，且达到显著水平，而脯氨酸和苯丙氨酸的1175cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，且达到显著水平。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述拉曼光谱检测的条件为：532nm激光作为激发光，100X倍物镜，1200g/mm光栅，10～12mw功率，15s累积时间，光谱范围279～2187cm^-1，应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理。

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